专利名称：土壤中根肿病菌的特异性pcr检测方法
技术领域：
本发明涉及一种土壤中根肿病菌(Plasmodiophora brassicae)的特异性PCR检测方法，特别是涉及一种土壤中芸薹根肿病菌的特异性PCR检测方法。
背景技术：
十字花科植物根肿病是由芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae)侵染引起的一种世界性土传病害，可以危害青菜、卷心菜、甘蓝、白花菜、西兰花、油菜等许多十字花科植物，造成植株地下部根的畸形肿大以及地上部植株矮小、萎蔫，导致作物的产量严重下降或者绝收。病原菌从腐烂的肿大根组织中释放出大量的游动孢子，进而发展成休眠孢子进入田块，田块一旦受到根肿病菌的污染，将长期带菌，不再适宜栽培十字花科植物。因此，该病严重威胁十字花科作物的生产。十字花科植物根肿病最早发现于18-19世纪的地中海西岸和欧洲南部，现在许多国家都有发生。在我国浙江、广东、广西、湖南、福建、江西、江苏、安徽、四川、云南、新疆、西藏、辽宁、山东、台湾、上海、北京等省、市、自治区均有分布。近年来，我国部分地区大白菜根肿病发生面积急剧增加，在上海，2006年上海郊区某西兰花出口基地根肿病严重发生，导致西兰花因不能结球几乎绝产，只能改种其它非十字花科作物。据报导根肿病菌休眠孢子能在土壤中存活15年以上，带菌土壤中根肿菌的休眠孢子很容易通过农用机械、鞋子、家畜的粪便、带菌植株的移栽和灌溉水等方式传播，这使得作使土壤中根肿病菌休眠孢子的数量突增。由于Plasmodiophora brassicae属专性寄生菌，不能在人工培养基上生长，故不能像其它非专性寄生菌一样通过分离、培养来检测土壤是否带菌。应用感病指示作物可以测定土壤是否带菌，然而这种方法要求土壤带菌量至少在 IO3个孢子/克干土以上，且需8周时间才能观察到植株根部肿大。利用分子手段检测根肿病菌的发展迅速，Faggian等(1999年)就报道检测根肿病菌的专一性PCR引物，然而因土壤中存在大量的抑制物质干扰根肿病菌PCR检测的灵敏度，许多检测方法在检测土壤中根肿病菌时检测的灵敏度不高。因此，亟须一种十分高效、灵敏的检测方法来弥补上述不足。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种土壤中根肿病菌的特异性PCR检测方法，以显著提高现有的土壤中根肿病菌检测方法的灵敏度，弥补现有技术的缺陷。本发明通过对上海郊区十字花科蔬菜根肿病菌核糖体DNA ITS序列的测定与分析，与近源种、土壤中常见种及十字花科常见病原菌进行比较，设计了 6对引物，经过特异性检验、多种方法提取土壤DNA的PCR检测并与现有的检测引物比较，建立了一种更为灵敏的PCR检测方法，对于土壤中根肿病的快速监测及田块根肿病危害的风险评估具有非常重要的现实意义和应用价值。
具体来说，本发明测定了引起上海地区十字花科青菜根肿病菌的病菌核糖体 DNAITS序列，通过与根肿菌纲不同种、土壤中卵菌纲不同病原菌种及镰刀菌不同种间序列的比较，设计了芸薹根肿病菌PCR检测的特异性正向引物2个0^Fl、PbF2)、反向引物3个 (PbRl、I^R2、in3R3)，组成6对引物对，进行目标青菜根肿病菌、青菜上其它病原菌种类、卵菌纲不同病原菌种类及镰刀菌不同种类PCR扩增反应的特异性检验，并对采用不同方法提取的土壤DNA进行根肿病菌灵敏度检测的PCR扩增反应。其中，本发明所设计的6对引物对序列分别如下
引物对1正向引物I^bFl5'atcattaacacagtgggcgg 3'(参i昏 SEQ ID No 1)
反向引物I^bRl5'cgcgcaaacgaacagaaa 3'(参看SEQ ID No 2)
引物对2正向引物I^bFl5'atcattaacacagtgggcgg 3'(参i昏 SEQ ID No 1)
反向引物1 ^5'gcagcaaagctcattgtctt 3‘(参-f SEQ ID No 3)
引物对3正向引物I^bFl5'atcattaacacagtgggcgg 3'(参i昏 SEQ ID No 1)
反向引物1 5'tcgttcaagctatgccgc 3'(参看SEQ ID No 4)
引物对4正向引物5'ctagcgctgcatcccatat 3'(参·rSEQ ID No 5)
反向引物I^bRl5'cgcgcaaacgaacagaaa 3'(参看SEQ ID No 2)
引物对5正向引物5'ctagcgctgcatcccatat 3'(参·rSEQ ID No 5)
反向引物1 ^5'gcagcaaagctcattgtctt 3‘(参-f SEQ ID No 3)
引物对6正向引物5'ctagcgctgcatcccatat 3'(参·rSEQ ID No 5)
反向引物1 5'tcgttcaagctatgccgc 3'(参看SEQ ID No 4)
所述的PCR扩增反应体系为20 μ 1，包括模板DNA 1 μ L，引物对(正、反向引物)各
2 μ L，dNTP 混合物(2. 5mM/ 每种)2 μ L，PCR 反应缓冲液(10 X) 2 μ L，MgCl2 溶液(25mmol/ L) 2 μ L，Taq 酶(IU/ μ L) 0· 4 μ 1，补充去离子水至 20 μ 1。所述的PCR扩增反应条件为95°C5min 1 个循环；95°C 30sec,54°C 30sec，72°C 45sec，;35 循环；72°C IOmin 1 个循环。将上述PCR扩增产物经Agrose凝胶电泳后分析，结果发现引物对2、4和5的 PCR扩增方法可以分别特异、灵敏地扩增根肿病病组织中芸薹根肿病菌在35;3bp、300bp和 331bp的目标片段。分别以引物对2、引物对5为外圈引物对、以引物对4为内圈引物对组成的两种巢式PCR扩增方法均可以特异性扩增出3种方法提取的根肿病土壤DNA在300bp的目标片段， 其中引物对5/引物对4组成的巢式PCR扩增片段比引物对2/引物对4扩增的片段更为清晰、明亮，而用引物对7为外圈引物对和引物对8为内圈引物组成的巢式PCR仅能特异性扩增1种方法提取的根肿病土壤DNA中芸薹根肿病菌在507bp的目标片段。弓丨物对2、5和7分别作为外圈引物对的PCR扩增均可以检测到相当于1μ g病根中的根肿病菌。用引物对7为外圈引物，引物对4和引物对8分别作为内圈引物进行巢式 PCR反应灵敏度检验，引物对4可以检测Ifg第一轮PCR产物，而引物对8仅可以检测IOng 的第一轮PCR产物。由此说明引物对2作为外圈引物对，引物对4作为内圈引物以及引物对5作为外圈引物对，引物对4作为内圈引物的二种巢式PCR检测土壤中芸薹根肿病菌的方法比现有文献报道的引物对7作为外圈引物、引物对8作为内圈引物的巢式PCR检测方法更为灵敏。
其中引物对7、8的序列分別如下引物对 7 正向引物 PbITSl :5' acttgcatcg attacgtccc 3'(參看 SEQ ID No 6)反向引物 PbITS2 :5' ggcattctcg agggtatcaa 3'(參看 SEQ ID No
7)引物对 8 正向引物 PbITS6 :5' caacgagtca gcttgaatgc 3'(參看 SEQ ID No
8)反向引物 PbITS7 :5' tgtttcggct aggatggttc 3'(參看 SEQ ID No 9)本发明的土壤中芸薹根肿病菌的特异性PCR鉴别方法可作为ー种土壌、植物组织 中芸薹根肿病菌(Plasmodiophora brassicae)的检测有效技术手段。本发明的优点1)检测快速完成土壤中根肿病菌的检测仅需8-9小时；通过传统种植感病的生物材料检测需要8周以上。2)方法灵敏本发明的技术首轮PCR可以检测到相当于Iyg病根中芸薹根肿病菌，第二轮巢式PCR可以检测出Ifg以上的首轮PCR扩增的DNA产物。现有技术第二轮引物只能检测IOng以上的首轮PCR扩增的DNA产物。3)特异性好本发明可以特异性检测十字花科根肿病病组织、土壤中的芸薹根肿病菌。4)适用性广本发明的特异性PCR适用于检测从多种的方法中(3种方法)提取的土壤DNA中的芸薹根肿病菌，现有技术仅能从1种方法提取的DNA中检测到根肿病菌。5)操作简便本发明仅仅需要1台PCR扩增仪以及PCR扩增反应所需的常规试剂。因此本发明的方法具有非常高的实用价值。
图1为本发明的6对引物对扩增青菜病根中芸薹根肿病菌的电泳图，其中M: marker ； 1-6 依次为引物对 1 (PbFl/PbRl)、引物对 2 (PbFl/PbR2)、引物对 3 (PbFl/PbR3)、弓丨
4(PbF2/PbRl) ^IiW 5(PbF2/PbR2) ^IiW 6(PbF2/PbR3)。图2为本发明的引物对1进行PCR扩增青菜其它病原菌的电泳图，其中Μ: marker ；1 阳性对照；2 :Erwinia carotovora subsp. carotovora ；3、4 Colletotrichum higginsianum ；5 阴性对照。图3为本发明的引物对1进行PCR扩增卵菌纲内病原菌的电泳图，其中 M :marker ；1 阳性对照；2 :Pythium aphanidermatuma ；3 :Pythium ultimum ；4 Pythiumaphanidermatuma ；5 :Phytopathora capsci ；6 阴t生图4为本发明不同方法提取芸薹根肿病病土总DNA的电泳图，其中M :marker ；1 方法一 ；2 方法二 ；3 方法三；4 方法四；5 病根。图5为用PblTSl/I^blTSZ作为外圈引物对和I^bFl/PbRl作为内圈引物对进行PCR 检测4种不同方法提取病土 DNA中根肿病菌电泳图，其中M :marker ；1 方法一 ；2 方法二 ； 3 方法三；4 方法四；5 阳性对照；6 阴性对照。
图6为用m3lTSl/PbITS2作为外圈引物对和in3Fl/PbR2作为内圈引物对进行PCR 检测4种不同方法提取病土 DNA中根肿病菌电泳图，其中M :marker ；1 方法一 ；2 方法二 ； 3 方法三；4 方法四；5 阳性对照；6 阴性对照。图7为用m3lTSl/PbITS2作为外圈引物对和in3F2/PbRl作为内圈引物对进行PCR 检测4种不同方法提取病土 DNA中根肿病菌电泳图，其中M :marker ；1 方法一 ；2 方法二 ； 3 方法三；4 方法四；5 阳性对照；6 阴性对照。图8为用m3lTSl/PbITS2作为外圈引物对和in3F2/PbR2作为内圈引物对进行PCR 检测4种不同方法提取病土 DNA中根肿病菌电泳图，其中M :marker ；1 方法一 ；2 方法二 ； 3 方法三；4 方法四；5 阳性对照；6 阴性对照。图9为用m3lTSl/PbITS2作为外圈引物对和in3lTS6/PbITS7作为内圈引物对进行 PCR检测4种不同方法提取病土 DNA中根肿病菌电泳图，其中M marker ；1 方法一 ；2 方法二 ；3 方法三；4 方法四；5 阳性对照；6 阴性对照。图10为引物对2进行PCR检测根肿病病根的灵敏度的电泳图，其中1 :lmg病根； 2 =IOOyg病根；3 =IOyg病根；4 :1 μ g病根；5 =IOOng病根；6 =IOng病根；7 阴性对照。图11为引物对5进行PCR检测根肿病病根的灵敏度的电泳图，其中1 :lmg病根； 2 =IOOyg病根；3 =IOyg病根；4 :1 μ g病根；5 =IOOng病根；6 =IOng病根；7 阴性对照。图12为引物对7进行PCR检测根肿病病根的灵敏度电泳图，其中1 :lmg病根；2 100 μ g病根；3 :10μ g病根；4 :1μ g病根；5 IOOng病根；6 IOng病根；7 阴性对照。图13为引物对4作为内圈引物对的巢式PCR扩增检测灵敏度的电泳图，其中第一轮PCR的扩增引物为引物对7，扩增产物倍比稀释后各取1 μ L为模板进行第二轮的巢式 PCR ；M :marker ； 1-10 内圈引物对 4 ； 11-20 内圈引物对 8 ；1,11 IOOng ；2，12 =IOng ；3， 13 =Ing ；4，14 =IOOfg ；5，15 =IOfg ；6，16 =Ifg ；7，17 =IOOpg ；8，18 =IOpg ；9，19 :lpg ；10,20 0. Ipg0图14为用引物对2作为外圈引物对、引物对4作为内圈引物对进行PCR扩增检测 4种不同方法提取病土 DNA中根肿病菌的电泳图，其中M :marker ；1 方法一 ；2 方法二 ；3 方法三；4 方法四；5 阳性对照；6 阴性对照。图15为用引物对5作为外圈引物对、引物对4作为内圈引物对进行PCR扩增检测 4种不同方法提取病土 DNA中根肿病菌的电泳图，其中M :marker ；1 方法一 ；2 方法二 ；3 方法三；4 方法四；5 阳性对照；6 阴性对照。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例1上海地区青菜根肿病菌分子特征序列的测定1)根肿病菌根基组DNA提取将洗干净的青菜畸形肿大的病根用液氮磨碎磨细，取50mg磨好的病根样品加入 ImL 提取液(50mmol/L· Tris-HCl, 150mmol/L NaCl, 100mmol/L EDTA)于 1. 5mL Eppendorf
6离心管中，振荡混勻，再加入0. ImL 20% SDS混勻，然后将离心管置于摇床内37°C缓慢摇动 lh，每管加入 0. 15mL 5mol/L NaCl 溶液，缓慢混勻，加入 0. l!3mL CTAB/NaCl 溶液(10% CTAB in 0. 7mol/L NaCl)，混勻，65°C水浴20min，每隔几分钟摇动1次，冷却置室温，加入等体积氯仿/异戊醇，在摇床内剧烈摇动5min, 10，000r/min离心12min，上清12，000r/min离心 5min，上清液移入新管中，加入0. 6倍体积预冷的异丙醇，_20°C放置过夜，10，OOOrmp离心 12min，弃上清液，倒置使管壁液体流尽，70%无水乙醇洗沉淀，室温放置干燥5 lOmin，溶于 50 μ L ddH20 中，加入 RNaseAdOy g/μ L) 1 μ L，37°C水浴 30min, _20°C保存备用。2) PCR 扩增对上述提取获得的根肿病菌根基因组DNA进行病菌特征序列的PCR扩增。PCR 扩增反应体系体积2 O μ L，其中包括1 μ L病样模板DNA，2 μ L 10 X PCR反应缓冲液， 2 μ LMgCl2 (25mmol/L)，2 μ L dNTPs (每种 2. 5mmol/L)，2 μ L 弓 |物 PbITSl (10 μ mol/L)，2 μ L 引物 PbITS2(10ymol/L)，0.4yL Taq 酶(lu/μ L)，补充去离子水至 20 μ 1。其中，所述引物I^bITSl、PbITS2的序列分别如下PbITSl 5' acttgcatcgattacgtccc 3'(参看 SEQ ID No 6)PbITS2 5' ggcattctcgagggtatcaa 3'(参看 SEQ ID No 7)扩增条件如下95°C5min，1 个循环；95°C 60s,60°C 60s,72°C 90s，共；35 个循环；72°C 10min，l 个循环。将上述扩增得到的PCR产物委托上海生工生物工程有限公司测序，获得青菜根肿病菌Pb-Sianghai的分子特征序列SEQ ID No 10。实施例2上海地区青菜根肿病菌分子特征序列与根肿菌纲内不同种类病原菌及其它不同种类的土壤病原菌比对将上述获得的青菜根肿病菌菌株的分子特征序列与根肿菌纲不同种类的病原菌、 卵菌纲内不同种类病原菌及土壤中不同种类镰刀菌分别进行相似性比对，寻找青菜根肿病菌菌株DNA的特异性区域。1)青菜根肿病菌与根肿菌纲不同种类的病原菌分子特征序列相似性比对(其中， 同一位置相同频率较高的碱基用灰色标示)其中A 上海青菜根肿病菌Pb-Shanghai的序列(SEQ ID No 10)B =Plasmodiophora brasiccae 歹lj (GenBank g^^· Y12831)C =Polymyxa graminis 序列(GenBank 登录号 Y12824)D =Polymyxa betae 序列(GenBank 登录号 Y12827)E Spongospora subterranea 序列(GenBank 登录号 Y12829)F =Olpidium brassicae 序列(GenBank 登录号 Yl283O)
权利要求
1.一种土壤中根肿病菌的特异性PCR检测方法，其特征在于，依据SEQ ID No 10中的 1-10 位序列设计如SEQ ID No 1、2、3、5所示的引物，组成引物对2、4、5进行特异性PCR 检测。
2.根据权利要求1所述的土壤中根肿病菌的特异性PCR检测方法，其特征在于，引物对2的正向引物I^bFl和反向引物此1 2的序列分别如SEQ ID No 1、3所示；引物对4的正向引物PbF2和反向引物PbRl的序列分别如SEQ ID No 5、2所示；引物对5的正向引物和反向引物此1 2的序列如SEQ ID No 5、3所示。
3.根据权利要求1所述的土壤中根肿病菌的特异性PCR检测方法，其特征在于，以引物对2、5作为外圈引物对，进行PCR扩增。
4.根据权利要求1所述的土壤中根肿病菌的特异性PCR检测方法，其特征在于，以引物对4作为内圈引物对，进行巢式PCR扩增。
5.根据权利要求1所述的土壤中根肿病菌的特异性PCR检测方法，其特征在于，以引物对2或5作为外圈引物对，以引物对4作为内圈引物对，进行PCR扩增。
6.权利要求1 5所述的特异性PCR检测方法在土壤中根肿病菌检测中的应用。
7.正向引物PbFl、PbF2和反向引物PbRl、PbR2及其序列的延伸或缩短序列在土壤中根肿病菌检测中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种土壤中根肿病菌的特异性PCR检测方法。依据SEQ ID No 10中的1-1028位序列设计如SEQ ID No 1、2、3、5所示的引物，组成引物对2、4、5，进行特异性PCR检测。本发明方法检测快速、方法灵敏、特异性好、适用性广、操作简便，可作为一种土壤、植物组织中芸薹根肿病菌的检测有效技术手段，具有非常高的实用价值。
文档编号C12N15/11GK102296120SQ201110265290
公开日2011年12月28日 申请日期2011年9月8日 优先权日2011年9月8日
发明者戴富明, 曾蓉, 陆金萍 申请人:上海市农业科学院