专利名称：人血清白蛋白和肿瘤坏死因子的融合的方法
技术领域：
本专利涉及一种生物合成的方法，特别涉及到人血清蛋白与抗肿瘤因子的融合方法。
背景技术：
抗肿瘤因子是迄今为止发现的抗肿瘤作用最强的细胞因子，是所有细胞因子中唯一具有直接杀伤肿瘤细胞的因子。抗肿瘤因子能特异性地直接杀伤肿瘤细胞，而对正常细胞无不良影响。对抗肿瘤因子敏感的肿瘤细胞表面存在抗肿瘤因子受体，抗肿瘤因子通过与该受体结合，引发细胞的一系列变化，最终导致肿瘤细胞的死亡。研究发现，抗肿瘤因子经过抗肿瘤因子R的识别、结合、内吞，导致一系列的变化，膜蛋白特异性磷酸化，产生大量热能，溶酶体酶类高度活化，膜通透性增加，蛋白酶类溢出，导致细胞溶解；也有证据表明， 抗肿瘤因子与受体结合后可使细胞的线粒体产生的自由基增加，使质膜过氧化，引起细胞损伤。
抗肿瘤因子与受体结合后，可通过细胞内的一系列级联反应，诱导肿瘤细胞凋亡。抗肿瘤因子直接抑制细胞生长的作用也通过肿瘤细胞表面的特异性受体介导。主要通过影响其蛋白质的代谢，导致肿瘤蛋白质合成减少，分解增加，从而抑制肿瘤生长。
肿瘤的血液供应丰富，对血液供应减少较为敏感。抗肿瘤因子除了对肿瘤细胞具有细胞毒性作用之外，更重要的是它能摧毁实体瘤周围的血管上皮组织，并且通过血栓的形成， 阻断肿瘤的血液营养供应，最终导致肿瘤的出血性坏死、消退和消失。
抗肿瘤因子是一种细胞因子，它对人体免疫系统具有很重要的调节作用。例如，抗肿瘤因子对免疫细胞树突状细胞具有催熟作用，具有激活和刺激T细胞作用。抗肿瘤因子可导致肿瘤局部的炎症反应，增强单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞的杀伤作用，增强T细胞的增殖和杀伤作用，还可诱导产生其他细胞因子如IL-2、IFN等，通过“级联反应”发挥更强昂的杀肿瘤活性。另外，抗肿瘤因子通过对核内基因的调控，促进肿瘤抑制基因P53的表达， 从而加强机体自身的抗肿瘤作用。
人血清白蛋白(HSA )本身是许多内源因子和外源药物的载体，药物和人血清白蛋白结合后，可以在减少其生物利用度的同时增加其在体内的半衰期。这是由于HSA本身是一种大分子蛋白，不易被肾小球滤过，并可抵御生物体内酶的作用，它还是一个稳定的“惰性” 蛋白，因而蛋白药物与其融合后可以提高药物的稳定性，延长蛋白药物在体内的半衰期。另外HSA的表达水平较高，与其融合后可以提高目的蛋白药物的表达水平。
发明内容
本发明的提供一种人血清白蛋白与肿瘤坏死因子的融合的方法，它可以延长药物在体内的半衰期，减小毒性，从而提高抗肿瘤的效果，提高产量。
为完成上述发明的目的，本专利是这样实现的一种人血清白蛋白和肿瘤坏死因子的融合的方法，其特征在于包括以下步骤 (1)基因扩增及表达菌株的构建；用T4DNA连接酶将目的人血白蛋白基因片段与载体连接，连接产物转化大肠杆菌菌株和毕氏酵母菌，挑取阳性克隆，电泳验证结果；
(2)诱导表达；
分别挑取重组体单菌落接种于大肠杆菌LB培养基中和酵母菌YPD培养基中，振荡过夜培养诱导表达，产生融合蛋白；
(3)表达产物分析取发酵液上清进行SDS-PAGE分析，并进行Western-blotting分析
(4)产物体外生物活性测试，细胞测活，生物学活性并与对照品对比。
对上述技术方案作进一步的改进，所述的人血白蛋白基因片段的基因序列如图1所
7J\ ο
对上述方案作进一步的细化，采用PCR方法进行聚合酶链反应，用设计的引物合成上述人血清白蛋白基因。
对上述方案作进一步的细化，上述人血清蛋白基因的引物设计为 上游GC GGATCC AAG TTA GTG ACA GAT CTT ACC ； 下游GC GAATTC CTC GGC AAA GCA GGT CTC CTT。 TNF基因信息为图2。
TNF引物设计
上游GC GAATTC ATG CGC AAA CGT GTC AGA TCA ； 下游GC CTCGAG TCA CAG GGC AAT GAT CCC AAA。 .TNF基因信息为图2。 所述的.TNF引物设计为
上游GC GAATTC ATG CGC AAA CGT GTC AGA TCA ； 下游GC CTCGAG TCA CAG GGC AAT GAT CCC AAA。
本研究申请发明专利的特点是分别选用大肠杆菌和毕氏酵母作为表达宿主菌，构建人血清白蛋白和抗肿瘤因子基因链接的融合表达菌种，用以表达白蛋白和抗肿瘤因子的融合蛋白，优点是延长药物在体内的半衰期，减小毒性，从而提高抗肿瘤的效果，提高产量。
图1为人血白蛋白基因片段的基因序列。 图2为.TNF基因序列。 图3为人血白蛋白PCR反应结果图。 图4为质粒连接反应载体质粒图。
图5为11，12，13泳道为质粒双酶切结果(BamHI+Ecorl)图。 图6为4，5泳道为TNF PCR反应结果图。
图7为3泳道为白蛋白构建完成后提取的质粒双酶切结果(Ecorl+Xhol)图。 图8为1-10泳道均为人血白蛋白-TNF连接载体后菌落PCR反应结果PCR扩增引物为人血白蛋白上游引物和TNF下游引物图。
图9为人血白蛋白-TNF连接载体后酶切鉴定结果(1014+486=1500bp)人血白蛋白-TNF连接载体后双酶切鉴定结果(BamHI+XhoI)图。
图10为构建好的表达质粒采用氯化钙的方法转化入大肠杆菌中，培养诱导后所表达的融合蛋白结果图。
具体实施例方式
为了更好的说明本发明的优点，下面结合具体的实验流程，对本发明作进一步的阐
述·
如图ι所示，本发明所要用到的血清白蛋白选取的基因序列，图2是.TNF基因序列，利用上述两基因序列进行操作；首先该(1)基因扩增及表达菌株的构建；
用T4DNA连接酶将目的人血白蛋白基因片段与载体连接，连接产物转化大肠杆菌菌株和毕氏酵母菌，挑取阳性克隆，电泳验证结果； (2)诱导表达；
分别挑取重组体单菌落接种于大肠杆菌LB培养基中和酵母菌YPD培养基中，振荡过夜培养诱导表达，产生融合蛋白；
(3)表达产物分析取发酵液上清进行SDS-PAGE分析，并进行Western-blotting分析
(4)产物体外生物活性测试，细胞测活，生物学活性并与对照品对比。 (5 )采用PCR方法进行聚合酶链反应，用设计的引物合成上述人血清白蛋白基因。
(6)引物设计:
(7)上游GCGGATCC AAG TTA GTG ACA GAT CTT ACC ；
(8)下游GCGAATTC CTC GGC AAA GCA GGT CTC CTT。
TNF引物设计
上游GC GAATTC ATG CGC AAA CGT GTC AGA TCA ； 下游GC CTCGAG TCA CAG GGC AAT GAT CCC AAA。
1.人血白蛋白选取的基因序列(1014bp)
AAGTTAGTGACAGATCTTACCAAAGTCCACACGGAATGCTGCCATGGAGATCTGCTTGAATGTGCTGATGAC AGGGCGGACCTTGCCAAGTATATCTGTGAAAATCAAGATTCGATCTCCAGTAAACTGAAGGAATGCTGTGAAAAACC TCTGTTGGAAAAATCCCACTGCATTGCCGAAGTGGAAAATGATGAGATGCCTGCTGACTTGCCTTCATTAGCTGCTG ATTTTGTTGAAAGTAAGGATGTTTGCAAAAACTATGCTGAGGCAAAGGATGTCTTCCTGGGCATGTTTTTGTATGAA TATGCAAGAAGGCATCCTGATTACTCTGTCGTGCTGCTGCTGAGACTTGCCAAGACATATGAAACCACTCTAGAGAA GTGCTGTGCCGCTGCAGATCCTCATGAATGCTATGCCAAAGTGTTCGATGAATTTAAACCTCTTGTGGAAGAGCCTC AGAATTTAATCAAACAAAATTGTGAGCTTTTTGAGCAGCTTGGAGAGTACAAATTCCAGAATGCGCTATTAGTTCGT TACACCAAGAAAGTACCCCAAGTGTCAACTCCAACTCTTGTAGAGGTCTCAAGAAACCTAGGAAAAGTGGGCAGCAA ATGTTGTAAACATCCTGAAGCAAAAAGAATGCCCTGTGCAGAAGACTATCTATCCGTGGTCCTGAACCAGTTATGTG TGTTGCATGAGAAAACGCCAGTAAGTGACAGAGTCACCAAATGCTGCACAGAATCCTTGGTGAACAGGCGACCATGC TTTTCAGCTCTGGAAGTCGATGAAACATACGTTCCCAAAGAGTTTAATGCTGAAACATTCACCTTCCATGCAGATAT ATGCACACTTTCTGAGAAGGAGAGACAAATCAAGAAACAAACTGCACTTGTTGAGCTTGTGAAACACAAGCCCAAGG CAACAAAAGAGCAACTGAAAGCTGTTATGGATGATTTCGCAGCTTTTGTAGAGAAGTGCTGCAAGGCTGACGATAAG GAGACCTGCTTTGCCGAG
2.引物设计
上游GC GGATCC AAG TTA GTG ACA GAT CTT ACC 下游GC GAATTC CTC GGC AAA GCA GGT CTC CTT
5采用PCR方法(聚合酶链反应)，用设计的引物合成上述人血清白蛋白基因。
3.人血白蛋白PCR反应结果见第一泳道(1014bp) Marker: 2000bp, 1500bp, IOOObp, 700bp, 400bp, 200bp
M 1 2
4.用以构建表达质粒连接反应载体质粒信息
5.白蛋白连接后提质粒酶切信息
14泳道为白蛋白构建完成后提取的质粒 11，12，13泳道为质粒双酶切结果(BamHI+Ecorl) M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
6.TNF基因克隆信息
(1).TNF基因信息
5， GC CAT ATG CGC AAA CGT GTC AGA TCA TCT TCT CGA ACC CCG AGT GAC AAG
CCT GTA GCC CAT GTT GTA GCA AAC CCT CAA GCT GAG GGG CAG CTC CAG TGG
CTG AAC CGC CGG GCC AAT GCC CTC CTG GCC AAT GGC GTG GAG
CTG AGA GAT AAC CAG CTG GTG GTG CCA TCA GAG GGC CTG TAC
CTC ATC TAC TCC CAG GTC CTC TTC AAG GGC CAA GGC TGC CCC
TCC ACC CAT GTG CTC CTC ACC CAC ACC ATC AGC CGC ATC GCC
GTC TCC TAC CAG ACC AAG GTC AAC CTC CTC TCT GCC ATC AAG
AGC CCC TGC CAG AGG GAG ACC CCA GAG GGG GCT GAG GCC AAG
CCC TGG TAT GAG CCC ATC TAT CTG GGA GGG GTC TTC CAG CTG
GAG AAG GGT GAC CGA CTC AGC GCT GAG ATC AAT CGG CCC GAC
TAT CTC GAC TTT GCC GAG TCT GGG CAG GTC TAC TTT GGG ATC
ATT GCC CTG TGA GAATTC CGG 3'
(2).TNF引物设计
上游GC GAATTC ATG CGC AAA CGT GTC AGA TCA 下游GC CTCGAG TCA CAG GGC AAT GAT CCC AAA
(3).采用PCR方法(聚合酶链反应)
(4)· TNF PCR 反应结果(486bp) 4，5泳道为TNF PCR反应结果
Ml 2 3 4 5
7.TNF酶切后割胶纯化结果
1泳道为TNF双酶切后割胶纯化结果(Ecorl+Xhol) 3泳道为白蛋白构建完成后提取的质粒双酶切结果(Ecorl+Xhol)
M 1 2 3
8.人血白蛋白-TNF连接载体后菌落PCR反应结果
1-10泳道均为人血白蛋白-TNF连接载体后菌落PCR反应结果 PCR扩增引物为人血白蛋白上游引物和TNF下游引物
1 23456789 10 M
9.人血白蛋白-TNF连接载体后酶切鉴定结果(1014+486=1500bp)人血白蛋白-TNF连接载体后双酶切鉴定结果(BamHI+XhoI) M123
人血白蛋白-TNF电泳图片
1 2 3 4 5
10.构建好的表达质粒采用氯化钙的方法转化入大肠杆菌中，培养诱导后所表达的融合蛋白结果
1.泳道1，2，3为人血白蛋白-TNF诱导表达后样品 2泳道.4为人血白蛋白-TNF诱导前样品
3.泳道5 为 Marker (116，66，45，35，25) kd
4.我们的目的蛋白分子量应该是81kd
11.采用MTT测活性法，用细胞测定融合表达蛋白的活性，活性比单独TNF表达有所提高。
权利要求
1.一种人血清白蛋白和肿瘤坏死因子的融合的方法，其特征在于包括以下步骤(1)基因扩增及表达菌株的构建；用T4DNA连接酶将目的人血白蛋白基因片段与载体连接，连接产物转化大肠杆菌菌株和毕氏酵母菌，挑取阳性克隆，电泳验证结果；(2)诱导表达；分别挑取重组体单菌落接种于大肠杆菌LB培养基中和酵母菌YPD培养基中，振荡过夜培养诱导表达，产生融合蛋白；(3)表达产物分析取发酵液上清进行SDS-PAGE分析，并进行Western-blotting分析 (4)产物体外生物活性测试，细胞测活，生物学活性并与照片对比。
2.根据权利要求1所述的一种人血清白蛋白和肿瘤坏死因子的融合的方法，其征在于所述的人血白蛋白基因片段的基因序列如图1所示。
3.根据权利要求1所述的一种人血清白蛋白和肿瘤坏死因子的融合的方法，其征在于采用PCR方法进行聚合酶链反应，用设计的引物合成上述人血清白蛋白基因。
4.根据权利要求3所述的一种人血清白蛋白和肿瘤坏死因子的融合的方法，其征在于引物设计上游GC GGATCC AAG TTA GTG ACA GAT CTT ACC ； 下游GC GAATTC CTC GGC AAA GCA GGT CTC CTT。
5.根据权利要求1所述的一种人血清白蛋白和肿瘤坏死因子的融合的方法，其征在于.TNF基因信息为图2。
6.根据权利要求4所述的一种人血清白蛋白和肿瘤坏死因子的融合的方法，其征在于.TNF引物设计:上游GC GAATTC ATG CGC AAA CGT GTC AGA TCA ； 下游GC CTCGAG TCA CAG GGC AAT GAT CCC AAA。
全文摘要
本发明涉及一种生物合成的方法特别涉及到人血清蛋白与抗肿瘤因子的融合方法。它可以延长药物在体内的半衰期，减小毒性，从而提高抗肿瘤的效果，提高产量。为完成上述发明的目的包括以下步骤(1)基因扩增及表达菌株的构建；(2)诱导表达；(3)表达产物分析取发酵液上清进行SDS-PAGE分析；(4)产物体外生物活性测试，细胞测活，生物学活性并与照品对比。本发明的特点是分别选用大肠杆菌和毕氏酵母作为表达宿主菌，构建人血清白蛋白和抗肿瘤因子基因链接的融合表达菌种，用以表达白蛋白和抗肿瘤因子的融合蛋白，优点是延长药物在体内的半衰期，减小毒性从而提高抗肿瘤的效果提高产量。
文档编号C12R1/84GK102443587SQ201110264949
公开日2012年5月9日 申请日期2011年9月8日 优先权日2011年9月8日
发明者唐灿, 孙晨, 王灿珍, 黄先进 申请人:上海深元生物科技有限公司