专利名称：：土壤中病原细菌的多重pcr检测方法
技术领域：
：本发明涉及一种用于土壤中病原细菌检测的多重PCR扩增方法，具体涉及多重PCR才企测方法在净皮大肠杆菌(Eyc/zen'c/z/aco//)、沙门氏菌(w/附o"e〃a)、金黄色葡萄球菌(Stop/9;/0c0cc船awews)、志贺氏菌(幼/ge/Za)、铜绿假单胞菌(i^ei^owo"asaerwgz'"as1)污染的土壎—样品分析中的应用。二、
背景技术：
快速检测与鉴定土壤环境中的病原菌是及时有效地控制与预防病原菌传播的前提，对人类健康具有重要意义。目前对病原细菌的检测方法，主要依靠常规的细菌学培养方法，一般需4-7d,操作繁瑣，费时耗力；有关病原细菌检测的乳胶凝集法、免疫磁珠分离法、酶免疫测定方法、核酸杂交技术和PCR技术因其特异性强、敏感性高、操作简单、检测快速等优点而被广泛应用，但这些方法每次实验通常只能检测一种病原细菌。本发明主要基于通用靶标gyW基因的PCR扩增技术和多重PCR扩增技术快速检测土壤中的5种典型病原菌致病性大肠杆菌、伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、铜绿假单胞菌，达到一次性、同时、快速检测出多种土壤病原菌的目的。本发明所筛选的各病原菌基因均具有较强的特异性和灵敏性。大肠杆菌基因是其持家基因，存在于所有大肠杆菌中；沙门氏菌的欲BC4基因编码的是连四硫酸盐还原酶结构蛋白，沙门氏菌基因组中较为保守的序列；金黄色葡萄球菌v/c《基因只存在于金黄色葡萄球菌中，在其它葡萄球菌和病原菌中均检测不出；志贺氏菌的^a//基因存在于所有志贺菌属的质粒和染色体上，具有高度特异性，比其他毒力因子*"5、C、D基因有更高的灵敏度，是侵袭力的特异标志；志*氏菌的v/M基因存在于所有志贺氏菌和侵染性大肠杆菌(E正C)中，具有丰支高的特异性和灵敏度，目的条带为215bp;铜绿假单胞菌的eq/Y基因是有关血红素或毒性的基因。本发明筛选合成这6对特异性引物通过不同的组合进行多重PCR扩增检测，以达到快速检测土壤样品中病原菌的目的。5三、
发明内容技术问题本发明目的在于克服常规病原菌检测技术操作繁瑣，费时耗力等不足，充分发挥多重PCR技术在土壤病原菌检测中的应用，尽量增加病原菌的种类和引物的对数，提高检测的特异性和灵敏度。技术方案一种土壤中病原菌多重PCR快速检测方法，采用多重PCR—次性同时扩增致病性大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和福氏志贺菌的特异性基因；/20丄欲5C4、Wdec/T、和vz>j,再通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。一种多重PCR快速检测方法，所述多重PCR扩增土壤中病原菌特异性基因，包括如下步骤(1)土壤样品的釆集及预处理取距离土层表面15cm的土壤，装入灭菌封口塑料袋中，去除样品中带有的植物残体、沙石等大颗粒，研磨过20目筛，-80°C保存备用；(2)DNA模板提取①取步骤1预处理过的土壤样品，采用土壤DNA提取试剂盒和核酸提取仪提取和纯化土壤中的细菌总DNA;②取未被病原菌污染的土壤样品，采用土壤DNA提取试剂盒和核酸^取仪提取和纯化土壤中的细菌总DNA;(3)多重PCR扩增检测土壤中病原菌的毒素基因、高度保守性基因及特异性基因欣5C4、v/dvz'M或z;^仏ec/G具体步骤如下反应体系总体系30pLH20緩沖液(lOxPCR)3攀;MgCl2(25mM)1.5nL;dNTP(2.5mM)phoA正向(10拜ol/L)O早，pho版向(10拜ol/L)0.5pL;ttrC-13(10pmol/L)2nL,ttrB-1(10|xmol/L)vicKl(lOpmol/L)vicK2(10pmol/L)l单;virA-F(lO^mol/L)virA-r(10(imol/L)1jjL5或ipaH-Ul(lO^imol/L)1HL,ipaH-Ll(lO^mol/L)叫5JECF1U0拜ol/L)lpL，ECF2(10拜ol/L)l^L;模板DNATaqDNA聚合酶(5U/pL)0.5^。引物致病性大肠杆菌引物为phoA正向5'隱TACAGGTGACTGCGGGCTTATC-3',phoA反向5'-CTTACCGGGCAATACACTCACTA-3';沙门氏菌引物为ttrC陽13:5'-ACTGCCGATAAATGCACGTT-3',ttrB-1:5'隱CTTTTTTCCGCCAGTGAAGA誦3';金黄色葡萄球菌引物为vicKl:5'-CTAATACTGAAAGTGAGAAACGTA-3',vicK2:5'-TCCTGCACAATCGTACTAAA-3';福氏志贺菌引物为virA-F:5'-CTGCATTCTGGCAATCTCTTCACA陽3'，virA-r:5'陽TGATGAGCTAACTTCGTAAGCCCTCC隱3';或ipaH-Ul:5'-CCTTTTCCGCGTTCCTTGA-3',ipaH-Ll:5'隱CGGAATCCGGAGGTATTGC-3';铜绿假单胞菌引物为ECF1:5'隱ATGGATGAGCGCTTCCGTG-3',ECF2:5'-TCATCCTTCGCCTCCCTG國3'。(4)PCR反应循环参数如下95。C5min;(95。Clmin,55°Clmin，72°Clmin)30个循环；72°C10min;l(TC保存(5)电泳4企测鉴定对多重PCR反应产物进行电泳检测，电泳图中含有622bp、528bp、418bp、289bp、112bp或215bp相应目的条带的一种或多种，分别对应于样本中的致病性大肠杆菌基因、铜绿假单胞菌eq/T基因、沙门氏菌欣BC4基因、金黄色葡萄球菌v/cK基因、福氏致贺菌z》a/f基因或v/M基因的一种或多种。多重PCR检测方法，步骤(5)中的电泳检测鉴定的具体操作方法如下以0.5xTBE緩冲液配制2%(w/v)琼脂糖凝胶溶液，加热溶解，冷却至50-60°C,倒入胶槽中，待胶凝固后，移去梳子，将胶放入倒有TBE緩冲液的电泳槽中；再将8pLPCR扩增产物与2pL6x上样緩沖液的混合液依次加入加样孔内；200V恒压电泳2535min;断电源，取出琼脂糖凝胶，置于lpg/mL的溴化乙锭中浸泡10~15min,取出置于紫外凝胶成像系统中观察分析结果。本发明所提及的病原菌由中国科学学院南京土壤研究所和常州进出口免疫处提供大肠杆菌(五w/zen'c//aco//):ATCC25922;沙门氏菌"o/附o"e〃a):鼠伤寒沙门氏菌(S.)ATCC50071、副伤寒沙门氏菌(5W/附o"e〃"/wraO^/z/)50073、肠炎沙门氏菌(S.);金黄色葡萄球菌(Sto;/^/ococc^:ATCC25923、A号ATCC、MH,福氏志贺菌(幼./exwen')51302;铜绿假单胞菌(i^ewJomwi^aerag/"as)。所有菌林均接种于牛肉膏蛋白胨营养琼脂斜面上(LuriaBertani,LB)，37。C培养18-24h，平皿转接3次后备用本发明所用主要试剂及试剂盒TaqDNA聚合酶、dNTP、引物、50bpDNALadder(上海生工生物工程技术服务有限公司)，100bpDNALadder(上海生工生物工程技术服务有限公司)，琼脂糖(中国惠兴生化试剂有限公司)，FastDNASPINKitforSoil试剂盒(MPBiomedicals,Solon,OH,USA)。本发明所用主要4义器PTC-100PCR仪(MJResearch,Waltham，MA,USA),高速离心才几(上海安亭科学仪器厂)，DYY-8B型电泳仪(北京市六一仪器厂)，凝胶成l象系统(Bio-RadLaboratories,Segrate，Italy),FastPrepTMFP120核酸提取仪(Bio101,Carlsbad,CA,USA)。本发明所用的土壤中细菌的DNA提取方法采用FastDNASPINKitforSoil试剂盒和FastPrepTMFP120核酸提取仪提取和纯化土壤样品总DNA，具体方法参见生产商使用说明。主要过程为称取500mg新鲜土壤样品到含有陶瓷和硅土微粒的裂解管中，再加入978pL磷酸钠緩沖液和122pL微管緩冲液，将管子^t入FastPrepFP120核酸提取仪，设置速度为6.0并运行40秒，最后用硅胶柱过滤并洗脱总DNA进行纯化，提取的总DNA分装分别置于4。C和-2(TC保存。本发明根据文献基于每种病原菌的毒素基因、高度保守性基因及特异性基因合成6对特异性引物，见表l。8<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>本发明所述多重PCR扩增体系和反应参数如下多重PCR扩增土壤中病原菌的；/za4、欣5C4、v/dv/M或z>xf/"、ec^T基因的反应体系为总体系30pL,超纯水9.5pL，10xPCR緩冲液3|xL;Mg2+(25mmol/L)1.5pL;dNTP(2.5mmol/L)2.5pL;引物(lO^imol/L)phoA正向、phoA反向、各0.5pL,virA-F、virA-R或ipaH國Ul、ipaH-Ll各lpL、ECF1、ECF2各lpL，vicKl、vicK2各1.5pL,ttrC-13、ttrB-l各2pL;DNAlpL;TaqDNA聚合酶2.5U。多重PCR反应参数95°C5min;(95°Clmin,55°Clmin,72°Clmin)30个循环；72。C10min，10。C保存。有益效果土壤环境比较复杂，影响因子较多，传统的检测方法无法对土壤中难培养或不可培养的致病菌进行检测，而且特异性不高、灵敏度低、操作烦瑣、耗时，还不能实现有效的监测、预防作用。本发明所建立的多重PCR技术能克服以上不足，多重PCR扩增结果表明6对特异性引物致病性大肠杆菌phoA正向、phoA反向，沙门氏菌ttrC-13、ttrB-l,金黄色葡萄球菌vicKl、vicK2，志贺氏菌ipaH-Ul、ipaH-Ll和virA-F、virA-R,铜绿假单胞菌ECF1、ECF2都具有较高的检测特异性和灵敏度。对土壤中存在的典型病原菌进行全面、系统、准确的检测与鉴定；所有反应可在同一PCR管中进行，操作简单、快速，具很高的特异性和敏感度，为快速检测与鉴定病原菌提供了有效的手段，可以推广应用于环境监测、土壤质量检测等领域；并为其它土壤中不同致病菌检测组合提供技术模式，可以大大提高检测效率、缩短检测周期、降低检测成本，具有显著的经济与社会效益。四图1为多重PCR扩增检测土壤中病原菌结果M:DNAMaker(100bp);泳道1~15分别对应1、大肠杆菌+铜绿假单胞菌+沙门氏菌+金黄色葡萄球菌+福氏志贺氏菌；2、大肠杆菌+金黄色葡萄球菌+福氏志贺氏菌；3、大肠杆菌+福氏志贺氏菌；4、大肠杆菌+金黄色葡萄球菌+福氏致贺氏菌；5、大肠杆菌+铜绿假单胞菌+沙门氏菌+福氏致贺氏菌；6、大肠杆菌+沙门氏菌+福氏致贺氏菌；7、大肠杆菌+沙门氏菌+金黄色葡萄球菌；8、大肠杆菌+沙门氏菌+福氏致贺氏菌；9、大肠杆菌+沙门氏菌+金黄色葡萄球菌+福氏志贺氏菌；10、大肠杆菌；11、沙门氏菌；12、金黄色葡萄球菌；13、福氏志贺氏菌；14、福氏志贺氏菌；15、铜绿^f叚单胞菌。五具体实施方式实施例1:土壤样品的采集及预处理取距离土层表面l-5cm的土壤，装入灭菌封口塑料袋中。去除样品中带有的植物残体、沙石等大颗粒，研磨过筛(20目筛)，称取100g土样-80。C保存备用。土壤中菌体DNA提取采用FastDNASPINKitforSoil试剂盒和FastPrepFP120核酸提取仪(Bio101,Carlsbad,CA,USA)提取和纯化土壤样品总DNA,具体方法参见生产商使用说明。主要过程为称取500mg新鲜土壎_样品到含有陶瓷和硅土微粒的裂解管中，再加入978pL磷酸钠緩沖液和122pL微管緩冲液，将管子放入FastPrepFP120核酸提取仪，设置速度为6.0并运行40秒，最后用硅胶柱过滤并洗脱总DNA进行纯化，提取的总DNA分装分别置于4°。和-20'C保存备用。PCR扩增总体系25pL,在200pLPCR小管中依次加入9.5nL超纯水；2.5^L10xPCR緩冲液；1.5pLMg2+(25mmol/L);2.5^iLdNTP(2.5mmol/L);引物(10pmol/L)phoA正向、phoA反向、各0.5pL,virA-F、virA-R或ipaH-Ul、ipaH-Ll各lpL、ECF1、ECF2各lpL,vicKl、vicK2各1.5^L,ttrC國13、ttrB隱l各2pL;DNAlpL;最后加TaqDNA聚合酶2.5U,手指轻弹混匀，3000rpm离心30s，放入PCR仪。引物序列如下致病性大肠杆菌上下游引物分别为phoA正向5'-TACAGGTGACTGCGGGCTTATC-3',phoA反向5'-CTTACCGGGCAATACACTCACTA-3',扩增片段长度为622bp;沙门氏菌上下游引物分别为ttrC-13:5'隱ACTGCCGATAAATGCACGTT國3',ttrB-l:5'隱CTTTTTTCCGCCAGTGAAGA-3',扩增片段长度为418bp;金黄色葡萄球菌上下游引物分别为vicKl:5'-CTAATACTGAAAGTGAGAAACGTA陽3',vicK2:5'-TCCTGCACAATCGTACTAAA-3'，扩增片段长度为289bp;福氏志贺菌两对上下游引物分别为virA-F:5'-CTGCATTCTGGCAATCTCTTCACA-3',virA-R:5'-TGATGAGCTAACTTCGTAAGCCCTCC-3'，和ipaH陽Ul:5'-CCTTTTCCGCGTTCCTTGA-3',ipaH-L1:5'誦CGGAATCCGGAGGTATTGC-3',扩增片段长度分别为215bp和112bp;铜绿假单胞菌上下游引物分别为ECF1:5'-ATGGATGAGCGCTTCCGTG-3'，ECF2:5'陽TCATCCTTCGCCTCCCTG-3',扩增片段长度为528bp。设置PCR扩增反应参数95。C5min;(95。Clmin，55°Clmin,72。Clmin)30个循环；72。C10min,10。C保存。PCR扩增结束后，电泳检测PCR扩增产物以0.5xTBEi爰冲液配制2%(w/v)琼脂糖凝胶溶液，加热溶解，冷却至50-60°C,倒入胶槽中，待胶凝固后，移去梳子，将胶放入倒有TBE緩冲液的电泳槽中；再将8pLPCR扩增产物与2pL6x上样緩冲液的混合液依次加入加样孔内；200V恒压电泳25-35min;切断电源，取出琼脂糖凝胶，置于l吗/ml的溴化钇锭中浸泡1015min，取出置于紫外凝胶成像系统中观察分析结果，见图1。如图1,M:DNAMaker(100bp);泳道115分别对应1、大肠杆菌+4同绿假单胞菌+沙门氏菌+金黄色葡萄球菌+福氏志贺氏菌；2、大肠杆菌+金黄色葡萄球菌+福氏志贺氏菌；3、大肠杆菌+福氏志贺氏菌；4、大肠杆菌+金黄色葡萄球菌+福氏致贺氏菌；5、大肠杆菌+铜绿假单胞菌+沙门氏菌+福氏致贺氏菌；6、大肠杆菌+沙门氏菌+福氏致贺氏菌；7、大肠杆菌+沙门氏菌+金黄色葡萄球菌；8、大肠杆菌+沙门氏菌+福氏致贺氏菌；9、大肠杆菌+沙门氏菌+金黄色葡萄球菌+福氏志贺氏菌；10、大肠杆菌；11、沙门氏菌；12、金黄色葡萄球菌；13、福氏志贺氏菌；14、福氏志贺氏菌；15、铜绿假单胞菌。序列表<110>中国科学院南京土壤研究所<120>土壤中病原细菌的多重PCR检测方法<130><160>12<170>Patentlnversion3.3<210><211><212><213><400>122DNA大肠杆菌1tacaggtgactgcgggcttatc22<210>2<211>23<212>DNA<213>大肠杆菌<400>2c加ccgggcaatacactcacta23<210>3<211>20<212>DNA<213>沙门氏菌<400>3actgccgataaatgcacgtt20<210>4<211>20<212>DNA<213>沙门氏菌<400>4cttttttccgccagtgaag3<210>5<211>24<212>DNA<213>金黄色葡萄球菌<400>5ctaatactgaaagtgagaaacgta<210>6<211>20<212>DNA<213>金黄色葡萄球菌<400>6tcctgcacaatcgtactaaa<210>7<211>19<212>DNA<213>志贺氏菌<400>7CCttttCCgCgttCCttg3<210>8<211>19<212>DNA<213>志贺氏菌<400>8cggaatccggaggtattgc<210>9<211>24202420191913<212>DNA<213>志贺氏菌<400>9ctgcattctggcaatctcttcaca24<210>10<211>26<212>DNA<213>志贺氏菌<400>10tgatgagctaacttcgtaagccctcc26<210>11<211>19<212>DNA<213>铜绿假单胞菌<400>11atggatgagcgcttccgtg19<210>12<211>18<212>DNA<213>铜绿假单胞菌<400>12tcatccttcgcctccctg18权利要求1、一种土壤中病原菌多重PCR快速检测方法，其特征在于，采用多重PCR一次性同时扩增致病性大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和福氏志贺菌的特异性基因phoA、ttrBCA、vicK、ecfX、ipaH和virA，再通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。2、一种如权利要求1所述的多重PCR快速检测方法，其特征在于，所述多重PCR扩增土壤中病原菌特异性基因，包括如下步骤(1)土壤样品的采集及预处理取距离土层表面l~5cm的土壤，装入灭菌封口塑料袋中，去除样品中带有的植物残体、沙石等大颗粒，研磨过20目筛，-80°C保存备用；(2)DNA模板提取①取步骤1预处理过的土壤样品，采用土壤DNA提取试剂盒和核酸提取仪提取和纯化土壤中的细菌总DNA;②取未被病原菌污染的土壤样品，釆用土壤DNA提取试剂盒和核酸提取仪提取和纯化土壤中的细菌总DNA;(3)多重PCR扩增检测土壤中病原菌的毒素基因、高度保守性基因及特异性基因//zo4、欣5C4、Wdvz'M或z;pa//、ec/&具体步骤如下反应体系总体系30pLH209.5^L;緩沖液(10xPCR)3单；MgCl2(25mM)dNTP(2.5mM)2.5pL;phoA正向(10pmol/L)0单，phoA反向(10|jmol/L)0单；ttrC-13(10nmol/L)2pL,ttrB-1(10pmol/L)2|oL;vicKl(lOpmol/L)1.5^,vicK2(10,1/L)1.5nL;virA-F(10nmol/L)virA-R(10拜ol/L)或ipaH-Ul(10pmol/L)l^L,ipaH-Ll(10pmol/L)lpL;ECF1(10nmol/L)ECF2(10[imol/L)模板DNATaqDNA聚合酶(5U/fiL)0.5pL。引物致病性大肠杆菌引物为phoA正向5'-TACAGGTGACTGCGGGCTTATC-3'，phoA反向5'-CTTACCGGGCAATACACTCACTA-3';沙门氏菌引物为ttrC-13:5'-ACTGCCGATAAATGCACGTT-3',ttrB-1:5'-CTTTTTTCCGCCAGTGAAGA-3';金黄色葡萄球菌引物为vicKl:5'-CTAATACTGAAAGTGAGAAACGTA-3',vicK2:5'-TCCTGCACAATCGTACTAAA-3';福氏志贺菌引物为virA-F:5'-CTGCATTCTGGCAATCTCTTCACA-3',virA-R:5'-TGATGAGCTAACTTCGTAAGCCCTCC-3';或ipaH-Ul:5'-CCTTTTCCGCGTTCCTTGA-3',ipaH-Ll:5'誦CGGAATCCGGAGGTATTGC-3';铜绿假单胞菌引物为ECF1:5'-ATGGATGAGCGCTTCCGTG-3',ECF2:5'-TCATCCTTCGCCTCCCTG-3'。(4)PCR反应循环参数如下95。C5min;(95°Clmin，55。Clmin，72。Clmin)30个循环；72°C10min;l(TC保存(5)电泳检测鉴定对多重PCR反应产物进行电泳检测，电泳图中含有622bp、528bp、418bp、289bp、112bp或215bp相应目的条带的一种或多种，分别对应于样本中的致病性大肠杆菌p/wj基因、铜绿假单胞菌eq/T基因、沙门氏菌欲5C4基因、金黄色葡萄球菌vic/C基因、福氏致贺菌z》fli/基因或v/M基因的一种或多种。3、如权利要求2所述的多重PCR检测方法，其特征在于，所述步骤(5)中的电泳检测鉴定的具体操作方法如下以0.5xTBE緩冲液配制2%(w/v)琼脂糖凝胶溶液，加热溶解，冷却至50-60。C,倒入胶槽中，待胶凝固后，移去梳子，将胶放入倒有TBE緩冲液的电泳槽中；再将8^LPCR扩增产物与2pL6x上样緩沖液的混合液依次加入加样孔内；200V恒压电泳25~35min;断电源，取出琼脂糖凝胶，置于l吗/mL的溴化乙锭中浸泡10-15min，取出置于紫外凝胶成像系统中观察分析结果。全文摘要一种土壤中病原菌多重PCR快速检测方法，其特征在于，采用多重PCR一次性同时扩增致病性大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和福氏志贺菌的特异性基因phoA、ttrBCA、vicK、ecfX、ipaH和virA，再通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。本发明克服了常规病原菌检测技术操作繁琐，费时耗力等不足，充分发挥多重PCR技术在土壤病原菌检测中的应用，尽量增加病原菌的种类和引物的对数，提高检测的特异性和灵敏度。文档编号C12R1/42GK101575637SQ200910026868公开日2009年11月11日申请日期2009年5月27日优先权日2009年5月27日发明者燕刘,睿尹,钟文辉申请人:中国科学院南京土壤研究所被以下专利引用(3),