专利名称：单核细胞增生性李斯特菌ic-pcr检测试剂盒和制备方法
技术领域：
本发明涉及一种针对四大食源性致病菌之一的单核细胞增生性李斯特菌 {Listeria monocytogenes, LM)分子水平的免疫捕捉PCR(Immuno_capture PCR, IC-PCR)检测试剂盒，可以用于食品中单核细胞增生性李斯特菌的常规检测。
背景技术：
近年来，食源性疾病屡屡发生，食品安全问题已经成为全球关注的公共卫生问题，而食源性致病菌正是食品安全问题的严重隐患。单核细胞增生性李斯特菌(listeria monocytogenes, LM)是常见的食源性致病菌，广泛存在于自然界，可感染多种肉制品、奶制品、水产品以及植物性产品；它是李斯特菌属中致病力最强的细菌，可导致严重的人畜共患病，如脑膜炎、败血症及流产等，孕妇、新生儿、老年人和免疫缺陷病人是易感人群，病死率高达30-70%。有研究表明，人类李斯特菌感染约99%属食源性，而Prazak等的研究表明， LM在食品特别是即食性食品中的污染率达3%。由于LM引起的感染病死率高、危害大，已成为全球性疾病，引起了国际上的高度重视，目前WHO将其列为20世纪90年代四大食源性致病菌之一，并在2000年建立了全球监测网，在世界范围内开展与单核细胞增生性李斯特菌相关的监测。我国也在2000年建立了全国食品污染物监测网和食源性疾病监测网，单核细胞增生性李斯特菌是其中重要监测菌之一，因此在食品上市和消费前开展李斯特菌的相关检测非常必要，但是在实际样品(如牛奶、肉制品等)中LM数量很少，这给检测带来了很大困难。目前，我国对LM的检测主要采用传统的分离培养检测及鉴定、ELISA和PCR技术。 国标法GB4789. 30-2008《食品卫生微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》需要增菌和分离培养，一般需3-14天，耗时长、工作量大，不适应目前对病原检测灵敏、快速、特异的要求，但其在爆发流行病的检测和传染源的追踪方面是其他方法不可替代的；在实际样品(如牛奶、肉制品等)中单增李斯特菌数量很少，这给检测带来了很大的难度。ELISA方法操作简便，可在同一时间内检测大量样品，但由于菌体及鞭毛抗原交叉反应的存在，难以进行李斯特菌种间的特异性鉴别，且检测灵敏度较低；目前，我国出入境检验检疫行业标准SN/T1869-2007《食品中多种致病菌快速检测方法PCR法》采用Direct-PCR检测LM。 Direct-PCR技术相对传统方法和ELISA检测灵敏度高，但同时也存在一定的局限性，需要对样品进行前处理即提取DNA，首先样品前处理的好坏很大程度上影响PCR检测的结果；而且在DNA抽提过程中无疑损失了大量病原菌，因而不可避免的降低了 PCR的检测灵敏度。其次，某些食品中本身就含有对PCR有干扰或抑制的成分(本实验对生猪肉的PCR检测中就遇到此类问题)，因而检测前病原菌的纯化和富集尤为重要。最常用的富集方法就是生物学培养，采用该方法增菌虽然可以大大提高检出率，提升检测灵敏度，但是其增加了检测时间， 难满足快速检测的要求
发明内容
本发明的目的是避免现有的食源性致病菌检测技术的不足提供一种单核细胞增生性李斯特菌的IC-PCR检测试剂盒。建立一种新的微量病原检测技术。IC-PCR试剂盒结合了 DAS-ELISA捕捉抗原与PCR高效扩增的优点，一方面除去了对PCR扩增有抑制的物质， 另一方面可以抑制杂菌，使目标菌达到一定的纯度和浓度，从而提高了检测灵敏度，使捕捉效率达到96%以上，避免了假阳性的出现，同时省去了核酸提取过程，缩短了检测周期，特别适合食品中微量致病菌的检测。为实现上述目的，本发明采取的技术方案为一种单核细胞增生性李斯特菌的 IC-PCR检测试剂盒，其主要特点是包括有单核细胞增生性李斯特菌单克隆抗体包被的 PCR 管，含 Mg2+的 10XPCR Buffer 管，2. 5mM dNTP 管，5U TaqDNA 聚合酶管，10 pmol/μ L 引物 5，-CGGAGGTTCCGCAAAAGATG-3，和 5，-CCTCCAGAGTGATCGATGTT-3，各 1 管，灭菌 ddH20 管，阳性对照1管，阴性对照管，PBST洗涤缓冲液管。一种单核细胞增生性李斯特菌的IC-PCR检测试剂盒的使用方法，其主要特点是步骤为
(1)病原菌的纯化和富集在包被好单核细胞增生性李斯特菌单克隆抗体的PCR管中依次加入待检样品，阳性对照热灭活的单核细胞增生性李斯特菌，阴性对照无菌PBS，37°C 孵育4小时；之后用PBST洗涤缓冲液洗涤PCR管3次，每次lmin，弃去洗涤液；
(2)PCR 扩增在上述 PCR 管中加入含 Mg2+ 的 PCR 10 X PCR Buffer 5 μ L，2. 5mM dNTP 2 μ L, Taq DNA Polymerase 2. 5 U,弓 | 物 5’ -CGGAGGTTCCGCAAAAGATG-3 ’ 禾口 5，-CCTCCAGAGTGATCGATGTT-3，各 0. 6pmol/ μ L，用 ddH20 补足 50 μ L ；进行 PCR 扩增，扩增条件为 95°C预变性 20 min，95°C 30s, 55°C 45s, 62°C 30s,进行 35 个循环，72°C延伸 5min， 4°C保存；
(3)结果分析取10μ L扩增产物于1. 5%琼脂糖电泳检测目标条带并成像分析，若阳性对照和检测样品在234bp处可见特异性目标条带，阴性对照没有特异性目标条带，则判定检测样品为阳性。一种单核细胞增生性李斯特菌的IC-PCR检测试剂盒特异性PCR包被管的制备方法，其主要特点是步骤为
(1)用包被缓冲液将单核细胞增生性李斯特菌单克隆抗体稀释至5.ομ g/mL，稀释好的抗体按照每管50 μ L加入PCR管4°C包被抗体过夜；
(2)PBST洗涤PCR管3次，每次Imin ；甩干PCR管中的水分，-20°C保存；
(3)包被缓冲液配方无水碳酸钠1.59g/L、碳酸氢钠2. 93g/L、叠氮化钠0. 2g/L，调 pH至9. 6 ；PBST洗涤缓冲液配方氯化钠8g/L、无水磷酸氢二钠1. 15g/L、无水磷酸二氢钾 0. 2g/L、氯化钾 0. 2g/L、吐温 20 0. 5ml/L，调 pH 至 7. 4。一种单核细胞增生性李斯特菌的IC-PCR检测试剂盒食品中致病菌的检测方法， 其主要特点是步骤为
(1)称取25g食品与250ml无菌磷酸盐缓冲液混合，并以此混合液作为稀释液梯度稀释李斯特菌纯菌液；
(2)将制备好的梯度模拟菌液加入包被抗体的PCR管中孵育并进行IC-PCR扩增；
(3)磷酸盐缓冲液配方磷 酸二氢钾34g/500mL，调pH至7.2。本发明建立的单核细胞增生性李斯特菌IC-PCR检测技术，利用特异性的LM单克隆抗体和针对编码李氏溶血素O的hlyA基因设计的特异性引物，可以快速、灵敏、特异的检测LM。使用本发明试剂盒对LM标准菌株进行检测，可以扩增出234bp大小的目标片段。同时比较本发明试剂盒与Direct-PCR的检测灵敏度，实验证明本试剂盒灵敏度是Direct-PCR 的10倍，说明该试剂盒非常适合食品中微量LM的检测。 本发明单核细胞增生性李斯特菌的IC-PCR检测试剂盒将免疫学技术与分子生物学技术相结合，集病原浓缩、特异性抗体识别、PCR扩增为一体，是一种灵敏度极高、检测速度快、结果准确、使用方便的试剂盒，尤其适用于食品安全检测部门和进出口检疫部门对含有微量LM的食品的检测。本发明的有益效果是一种单核细胞增生性李斯特菌的IC-PCR检测试剂盒，涉及到检测四大食源性致病菌之一的单核细胞增生性李斯特菌的一种新技术。试剂盒依赖PCR 的分子检测技术，克服了现有的食源性致病菌检测技术灵敏性低、特异性差、检测周期长的缺点，可以迅速、特异、灵敏地捕获样本中的LM，减少了由于其他杂菌对PCR扩增的干扰而导致的假阳性和检测灵敏度下降的问题，同时还消除了一些食品成分对PCR的强抑制作用，大大降低假阳性和假阴性发生率，是可以替代传统方法的快速检测方法，提高了我国食品安全的检疫水平，同时为食源性致病菌防治策略的制定提供了依据。试剂盒特异性验证实验用单核细胞增生性李斯特菌的IC-PCR检测试剂盒检测单核细胞增生李斯特菌等20株食源性致病菌，结果显示除了以LM为模板的泳道扩增出了预期大小的片段(234bp)外，其余菌株均未得到该片段。说明本发明建立的IC-PCR方法具有高度特异性。试剂盒干扰性验证实验日常生活中通常会出现多种食源性致病菌感染同一食品的现象，我们用LM纯菌液与金黄色葡萄球菌等18株食源性致病菌纯菌液按1:1比例混合后，加入包被好抗体的PCR管中，进行IC-PCR扩增。干扰试验证明金黄色葡萄球菌等18 株常见食源性致病菌的对该法没有干扰。试剂盒灵敏度验证实验以不同浓度纯菌液为模板分别进行IC-PCR试剂盒检测和Direct-PCR检测，结果显示IC_PCR试剂盒最低检出限为104CFU/mL，Direct-PCR最低检出限为105CFU/mL。试剂盒灵敏度是Direct-PCR的10倍，证明IC-PCR试剂盒具有较高的敏感性。试剂盒模拟带菌验证实验选取日常生活中易受LM污染的6种食品(牛奶、果汁、 酸奶、雪糕、香肠、生猪肉)进行模拟带菌试验。过程称取25g样品与250ml无菌磷酸盐缓冲液混合，并以此混合液为稀释液梯度稀释LM纯菌液，以制备好的梯度模拟菌液为模板进行Direct-PCR和IC-PCR试剂盒检测。本试剂盒的优点是，不需提取DNA步骤，直接使用IC-PCR检测试剂盒7h就能得到检测结果，可灵敏、特异、快速的检出目标菌。
图1单核细胞增生性李斯特菌IC-PCR检测试剂盒检测原理图； 图2 IC-PCR试剂盒使用流程图3 IC-PCR试剂盒特异性验证结果；
图中1_20泳道分别为单核细胞增生李斯特菌ATCC 43251、金黄色葡萄球菌ATCC23213、金黄色葡萄球菌ATCC 27660、鼠伤寒沙门氏菌CTCC 22956、肠炎沙门氏菌ATCC 13076、猪霍乱沙门氏菌CTCC 21493、副溶血性弧菌ATCC 17802、坂崎肠杆菌ATCC 29004、 坂崎肠杆菌ATCC 29554、小肠结肠炎耶尔森氏菌ATCC 23715、单核细胞增生李斯特菌ATCC 7644、福氏志贺氏菌ATCC 12022、宋内氏志贺氏菌ATCC 25931、鲍氏志贺氏菌ATCC 9207、 痢疾志贺氏菌I型、大肠杆菌0157、乙型溶血性链球菌ATCC 10373、蜡样芽胞杆菌ATCC 11778、幽门螺旋杆菌 ATCC 43504、空肠弯曲菌 CICC 22937 ；M 为 IOObp DNA ladder。图4 IC-PCR试剂盒干扰性验证结果；
图中1，11泳道为LM纯菌液；2-10，12-20泳道为18株食源性致病菌与LM等量混合 (金黄色葡萄球菌ATCC 23213、金黄色葡萄球菌ATCC 27660、鼠伤寒沙门氏菌CTCC 22956、 肠炎沙门氏菌ATCC 13076、猪霍乱沙门氏菌CTCC 21493、副溶血性弧菌ATCC 17802、坂崎肠杆菌ATCC 29004、坂崎肠杆菌ATCC 29554、小肠结肠炎耶尔森氏菌ATCC 23715、福氏志贺氏菌ATCC 12022、宋内氏志贺氏菌ATCC 25931、鲍氏志贺氏菌ATCC 9207、痢疾志贺氏菌 I型、大肠杆菌0157、乙型溶血性链球菌ATCC 10373、蜡样芽胞杆菌ATCC 11778、幽门螺旋杆菌 ATCC 43504、空肠弯曲菌 CICC 22937) ;M 为 IOObp DNA ladder。图5 Direct-PCR, IC-PCR试剂盒灵敏度验证结果；
图中A为Direct-PCR扩增结果，B为IC-PCR试剂盒扩增结果；1-8泳道为IO9-IO2 CFU/ mL 纯菌液；M 为 IOObp DNA ladder。图6 Direct-PCR, IC-PCR试剂盒模拟带菌验证结果；
图中A1-A6为牛奶、果汁、酸奶、雪糕、香肠、生猪肉6种食品的Direct-PCR扩增结果； B1-B6为牛奶、果汁、酸奶、雪糕、香肠、生猪肉6种食品的IC-PCR试剂盒扩增结果；1-8泳道为 IO9-IO2 CFU/mL 模拟菌液；M 为 IOObp DNA ladder。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明， 并非用于限定本发明的范围。实施例1 一种单核细胞增生性李斯特菌的IC-PCR检测试剂盒，包括LM单克隆抗体包被的 PCR 管，含 Mg2+的 PCR Buffer(IOX) 1 管，2. 5mM dNTP 1 管，5U TaqDNA 聚合酶 1 管，10 pmol/μ L 弓丨物 5，-CGGAGGTTCCGCAAAAGATG-3，和 5，-CCTCCAGAGTGATCGATGTT-3，各 1管，灭菌ddH20 1管，阳性对照1管，阴性对照1管，PBST洗涤缓冲液1管。实施例2·.见图2，一种单核细胞增生性李斯特菌的IC-PCR检测试剂盒的使用方法，其主要特点是步骤为
(1)病原菌的纯化和富集在包被好LM单抗的PCR管中依次加入待检样品、阳性对照 (热灭活的单核细胞增生性李斯特菌)、阴性对照(无菌PBS)，37°C孵育4小时；之后用PBST 洗涤缓冲液洗涤PCR管3次，每次lmin，弃去洗涤液；
(2)PCR扩增在上述PCR管中加入PCR母液体系(10 X PCR buffer 5μ L,2. 5mM dNTP 2 μ L、Taq DNA Polymerase 2.5 U、引物 0. 6pmol/μ L、用 ddH20 补足 50 μ L)；进行 PCR 扩增，扩增条件为95°C预变性20 min，95°C 30s, 55°C 45s, 62°C 30s，进行35个循环，72°C延伸 5min，4°C 保存；
(3)结果分析取10μ L扩增产物于1. 5%琼脂糖电泳检测目标条带并成像分析，若阳性对照和检测样品在234bp处可见 特异性目标条带，阴性对照没有特异性目标条带，则判定检测样品为阳性。实施例3 —种单核细胞增生性李斯特菌的IC-PCR检测试剂盒特异性PCR包被管的制备方法，其特征是步骤为
(1)用包被缓冲液将LM单克隆抗体稀释至5.0 μ g/mL，稀释好的抗体按照每管50 μ L 加入PCR管4°C包被抗体过夜；
(2)PBST洗涤PCR管3次，每次Imin ；甩干PCR管中的水分，_20°C保存；
(3)包被缓冲液配方无水碳酸钠1.59g/L、碳酸氢钠2. 93g/L、叠氮化钠0. 2g/L，调 pH至9. 6 ；PBST洗涤缓冲液配方氯化钠8g/L、无水磷酸氢二钠1. 15g/L、无水磷酸二氢钾 0. 2g/L、氯化钾 0. 2g/L、吐温 20 0. 5ml/L，调 pH 至 7. 4。实施例4 见图3，单核细胞增生李斯特菌等20株食源性致病菌的IC-PCR试剂盒特异性验证实验
分别取2株单核细胞增生李斯特菌和18株常见食源性致病菌(金黄色葡萄球菌ATCC 23213、金黄色葡萄球菌ATCC 27660、鼠伤寒沙门氏菌CTCC 22956、肠炎沙门氏菌ATCC 13076、猪霍乱沙门氏菌CTCC 21493、副溶血性弧菌ATCC 17802、坂崎肠杆菌ATCC 29004、 坂崎肠杆菌ATCC 29554、小肠结肠炎耶尔森氏菌ATCC 23715、福氏志贺氏菌ATCC 12022、 宋内氏志贺氏菌ATCC 25931、鲍氏志贺氏菌ATCC 9207、痢疾志贺氏菌I型、大肠杆菌0157、 乙型溶血性链球菌ATCC 10373、蜡样芽胞杆菌ATCC 11778、幽门螺旋杆菌ATCC 43504、空肠弯曲菌CICC 22937)加入到包被好抗体的PCR管中，37°C孵育4小时；之后用PBST洗涤缓冲液洗涤PCR管3次，每次lmin，弃去洗涤液；在上述PCR管中加入PCR母液体系(10XPCR buffer 5μ L>2. 5mM dNTP 2 μ L、Taq DNA Polymerase 2. 5 U、弓丨物 0. 6pmol/μ L、用 ddH20 补足 50 μ L);进行 PCR扩增，扩增条件为 95°C预变性 20 min、95°C 30s、55°C 45s,62°C 30s， 进行35个循环，72°C延伸5min，4°C保存。最后取10 μ L扩增产物于1. 5%琼脂糖电泳检测目标条带并成像分析。实验结果如图3所示，除了以LM为模板的泳道扩增出了预期大小的片段(234bp) 夕卜，其余均未得到该片段。说明本发明建立的IC-PCR方法具有高度特异性。实施例5 见图4，金黄色葡萄球菌等18株食源性致病菌对单核细胞增生性李斯特菌IC-PCR试剂盒的干扰性验证实验
将LM纯菌液与金黄色葡萄球菌等18株食源性致病菌纯菌液(金黄色葡萄球菌ATCC 23213、金黄色葡萄球菌ATCC 27660、鼠伤寒沙门氏菌CTCC 22956、肠炎沙门氏菌ATCC 13076、猪霍乱沙门氏菌CTCC 21493、副溶血性弧菌ATCC 17802、坂崎肠杆菌ATCC 29004、 坂崎肠杆菌ATCC 29554、小肠结肠炎耶尔森氏菌ATCC 23715、福氏志贺氏菌ATCC 12022、 宋内氏志贺氏菌ATCC 25931、鲍氏志贺氏菌ATCC 9207、痢疾志贺氏菌I型、大肠杆菌0157、 乙型溶血性链球菌ATCC 10373、蜡样芽胞杆菌ATCC 11778、幽门螺旋杆菌ATCC 43504、空肠弯曲菌CICC 22937)按1:1比例混合作为模板，加入到包被好抗体的PCR管中，37°C孵育 4小时；之后用PBST洗涤缓冲液洗涤PCR管3次，每次lmin，弃去洗涤液；在上述PCR管中加入 PCR母液体系(10 X PCR buffer 5μ L,2. 5mM dNTP 2 μ L,Taq DNA Polymerase 2.5 U、 引物0. 6pmol/yL、用ddH20补足50yL)；进行PCR扩增，扩增条件为95°C预变性20 min、 95°C 30s,55°C 45s,62°C 30s，进行 35 个循环，72°C延伸 5min，4°C保存。最后取 10 μ L 扩增产物于1. 5%琼脂糖电泳检测目标条带并成像分析。实验结果如图4所示，金黄色葡萄球菌等18株常见食源性致病菌的对该法没有干扰。实施例6 见图5，LM梯度菌液Direct_PCR、IC-PCR试剂盒灵敏度验证实验
LM标准菌株用脑心浸液肉汤37°C培养18h后取ImL纯菌液，用PBS依次稀释 IO1-IO7倍，共8个浓度梯度(依次标记为1-8号)。取1-8号梯度菌液ImL加入15mL 的脑心浸液琼脂中，37 °C培养18h后进行平板计数，1-8号梯度菌液计数结果分别为
1.15X IO9-L 15X102CFU/mL。以此梯度菌液为模板分别进行Direct-PCR、IC_PCR试剂盒检测。Direct-PCR母液体系为 10XPCR buffer 5μ L,2. 5mM dNTP 2 μ L,Taq DNA Polymerase
2.5 U、引物 0· 6ρπιο1/μ L、模板 5μ L、用；扩增条件为 95°C预变性 20 min、 95°C 30s,55°C 45s,62°C 30s，进行 35 个循环，72°C延伸 5min，4°C保存。最后取 10 μ L 扩增产物于1. 5%琼脂糖电泳检测目标条带并成像分析。IC-PCR检测过程为梯度菌液加入到包被好抗体的PCR管中，37°C孵育4小时； 之后用PBST洗涤缓冲液洗涤PCR管3次，每次lmin，弃去洗涤液；在上述PCR管中加入 PCR 母液体系(10 X PCR buffer 5μ L,2. 5mM dNTP 2 μ L、Taq DNA Polymerase 2.5 U、弓 | 物0. 6ρπιο1/μ L、用ddH20补足50 μ L)；进行PCR扩增，扩增条件为95°C预变性20 min、 95°C 30s,55°C 45s,62°C 30s，进行 35 个循环，72°C延伸 5min，4°C保存。最后取 10 μ L 扩增产物于1. 5%琼脂糖电泳检测目标条带并成像分析。实验结果如图5，在图5Α中，1-5号泳道扩增后能观察到目标条带，即Direct-PCR 最低检出限为105CFU/mL。图5B中，1-6号泳道能观察到目标条带，且亮度依次减弱，即 IC-PCR最低检出限为104CFU/mL，灵敏度是Direct-PCR的10倍，证明IC-PCR方法具有较高的敏感性。实施例7 见图6，Direct-PCR, IC-PCR试剂盒模拟带菌验证实验
选取日常生活中易受LM污染的6种食品(牛奶、果汁、酸奶、雪糕、香肠、生猪肉)进行模拟带菌试验。过程称取25g样品与250ml无菌磷酸盐缓冲液混合，并以此混合液为稀释液梯度稀释LM纯菌液，制备梯度模拟菌液。最后以此梯度模拟菌液为模板进行Direct-PCR 和IC-PCR试剂盒检测。 Direct-PCR 母液体系为 10XPCR buffer 5μ L,2. 5mM dNTP 2 μ L、Taq DNA Polymerase 2. 5 U、引物 0. 6pmol/μ L、模板 5 μ L、用 ddH20 补足 50 μ L ；扩增条件为 95°C预变性 20 min、95°C 30s,55°C 45s,62°C 30s，进行 35 个循环，72°C延伸 5min，4°C保存。最后取10 μ L扩增产物于1. 5%琼脂糖电泳检测目标条带并成像分析。IC-PCR检测过程为梯度菌液加入到包被好抗体的PCR管中，37°C孵育4小时； 之后用PBST洗涤缓冲液洗涤PCR管3次，每次lmin，弃去洗涤液；在上述PCR管中加入 PCR 母液体系(10 X PCR buffer 5μ L,2. 5mM dNTP 2 μ L、Taq DNA Polymerase 2.5 U、弓 | 物0. 6ρπιο1/μ L、用ddH20补足50 μ L)；进行PCR扩增，扩增条件为95°C预变性20 min、 95°C 30s,55°C 45s,62°C 30s，进行 35 个循环，72°C延伸 5min，4°C保存。最后取 10 μ L 扩增产物于1. 5%琼脂糖电泳检测目标条带并成像分析。实验结果如图6，两种方法的检测灵敏度详见表1。由表1可见，牛奶、果汁、雪糕、 香肠、生猪肉5种食品的IC-PCR检测灵敏度是Direct-PCR的10倍；酸奶中LM的检测结果显示，Direct-PCR 灵敏度为 106CFU/mL，IC-PCR 灵敏度为 104CFU/mL (是 Direct-PCR 的 100 倍)。结果表明，IC-PCR技术在实际样品的检测中具有比Direct-PCR至少高10倍的灵敏度，即每反应体系中只要有10个细菌就可检出，该试剂盒完全可用于食品中单核细胞增生性李斯特菌的检测。显示对应的拉丁字符的拼音字典。
表1 Direct-PCR、IC-PCR试剂盒模拟带菌实验检测灵敏度比较
权利要求
1.一种单核细胞增生性李斯特菌的IC-PCR检测试剂盒，其特征是包括有单核细胞增生性李斯特菌单克隆抗体包被的PCR管，含Mg2+的10 XPCR Buffer管，2. 5mM dNTP 管，5U TaqDNA 聚合酶 1 管，10 pmol / μ L 弓| 物 5，-CGGAGGTTCCGCAAAAGATG-3，禾口 5’ -CCTCCAGAGTGATCGATGTT-3’各1管，灭菌ddH20 1管，阳性对照管，阴性对照管，PBST洗涤缓冲液管。
2.—种单核细胞增生性李斯特菌的IC-PCR检测试剂盒的使用方法，其特征是步骤为(1)病原菌的纯化和富集在包被好单核细胞增生性李斯特菌单克隆抗体的PCR管中依次加入待检样品，阳性对照热灭活的单核细胞增生性李斯特菌，阴性对照无菌PBS，37°C 孵育4小时；之后用PBST洗涤缓冲液洗涤PCR管3次，每次lmin，弃去洗涤液；(2)PCR 扩增在上述 PCR 管中加入含 Mg2+ 的 PCR 10 X PCR Buffer 5 μ L，2. 5mM dNTP 2 μ L, Taq DNA Polymerase 2. 5 U,弓 | 物 5’ -CGGAGGTTCCGCAAAAGATG-3 ’ 禾口 5，-CCTCCAGAGTGATCGATGTT-3，各 0. 6pmol/ μ L，用 ddH20 补足 50 μ L ；进行 PCR 扩增，扩增条件为 95°C预变性 20 min，95°C 30s, 55°C 45s, 62°C 30s,进行 35 个循环，72°C延伸 5min， 4°C保存；(3)结果分析取10μ L扩增产物于1. 5%琼脂糖电泳检测目标条带并成像分析，若阳性对照和检测样品在234bp处可见特异性目标条带，阴性对照没有特异性目标条带，则判定检测样品为阳性。
3.—种单核细胞增生性李斯特菌的IC-PCR检测试剂盒特异性PCR包被管的制备方法， 其特征是步骤为(1)用包被缓冲液将单核细胞增生性李斯特菌单克隆抗体稀释至5.0 μ g/mL，稀释好的抗体按照每管50 μ L加入PCR管4°C包被抗体过夜；(2)PBST洗涤PCR管3次，每次Imin ；甩干PCR管中的水分，_20°C保存；(3)包被缓冲液配方无水碳酸钠1.59g/L、碳酸氢钠2. 93g/L、叠氮化钠0. 2g/L，调 pH至9. 6 ；PBST洗涤缓冲液配方氯化钠8g/L、无水磷酸氢二钠1. 15g/L、无水磷酸二氢钾 0. 2g/L、氯化钾 0. 2g/L、吐温 20 0. 5ml/L，调 pH 至 7. 4。
4.一种单核细胞增生性李斯特菌的IC-PCR检测试剂盒食品中致病菌的检测方法，其特征是步骤为(1)称取25g食品与250ml无菌磷酸盐缓冲液混合，并以此混合液作为稀释液梯度稀释李斯特菌纯菌液；(2)将制备好的梯度模拟菌液加入包被抗体的PCR管中孵育并进行IC-PCR扩增；(3)磷酸盐缓冲液配方加入磷酸二氢钾34g/500mL，调pH至7.2。
全文摘要
本发明涉及一种针对四大食源性致病菌之一的单核细胞增生性李斯特菌(Listeriamonocytogenes，LM)分子水平的免疫捕捉PCR(Immuno-capturePCR，IC-PCR)检测试剂盒，可以用于食品中单核细胞增生性李斯特菌的常规检测。试剂盒主要包括LM单克隆抗体包被的PCR管，含Mg2+的PCRBuffer(10×)管，2.5mMdNTP管，5UTaqDNA聚合酶管，10pmol/μL引物5′-CGGAGGTTCCGCAAAAGATG-3′和5′-CCTCCAGAGTGATCGATGTT-3′各1管、灭菌ddH2O管，阳性对照管，阴性对照管，PBST洗涤缓冲液1管。本试剂盒的优点是，不需提取DNA步骤，直接使用IC-PCR检测试剂盒7h就能得到检测结果，可灵敏、特异、快速的检出目标菌。
文档编号C12R1/01GK102286630SQ20111026573
公开日2011年12月21日 申请日期2011年9月8日 优先权日2011年9月8日
发明者刘箐, 刘雅莉 申请人:刘箐, 刘雅莉