专利名称：核酸扩增反应装置和方法及用于核酸扩增反应装置的基板的制作方法
技术领域：
本发明涉及核酸扩增反应装置、用于核酸扩增反应装置的基板以及核酸扩增反应方法。具体地，本发明涉及包括形成为核酸扩增反应的反应场所的锥形井形状的反应区域的核酸扩增反应装置。
背景技术：
通过诸如PCR(聚合酶链反应)和LAMP(环介导等温扩增)等方法的基因扩增代表了用于痕量核酸的定量分析的标准技术。该技术已经用于基因表达分析，用于测试遗传性疾病、癌症以及微生物和病毒感染。该技术还用于诸如SNP分析的基因分析。多种方法是已知的检测核酸扩增产物的常见方法，包括使用诸如在嵌入剂法和荧光标记探针法中的荧光物质的荧光检测法、以及使用浑浊物质的浊度检测法，浑浊物质是由诸如镁离子的金属离子结合到扩增过程中形成的副产物焦磷酸而形成的不溶于水的或水溶性差的盐，如JP-A-2008-237207、W0/2001/83817和日本专利第413347号所述。市场上有很多利用例如上述的用于基因表达分析、感染测试和诸如SNP分析的基因分析的核酸扩增产物检测方法的核酸扩增反应装置。
发明内容
这些核酸扩增反应装置通常使用圆柱井板，并且仍然需要提高检测灵敏度。因此，需要能够提高检测灵敏度的核酸扩增反应装置、用于核酸扩增反应装置的基板以及核酸扩增反应方法。本发明的一个实施方式涉及一种核酸扩增反应装置，包括反应区域，形成为沿着在核酸扩增反应过程中析出的物质沉降的光轴方向水平截面积减小的锥形井形状的核酸扩增反应场所；温度控制器，加热所述反应区域；照射器，对所述反应区域照射光；以及检测器，检测由所述析出的物质从所述反应区域散射出的光量。优选反应区域具有经过平滑处理的倾斜内表面。本发明的另一实施方式涉及一种用于核酸扩增反应的微芯片，包括反应区域，形成为核酸扩增反应场所，其中，所述反应区域是沿着在核酸扩增反应过程中析出的物质沉降的光轴方向水平截面积减小的锥形井。本发明的又一实施方式涉及一种核酸扩增反应方法，包括对作为核酸扩增反应场所的反应区域进行光的照射，并且检测由在扩增反应过程中析出的物质散射出的光量; 所述反应区域是沿着在核酸扩增反应过程中析出的物质沉降的光轴方向的水平截面积减小的锥形井。利用本发明实施方式提供的核酸扩增反应装置、基板以及核酸扩增反应方法可以提高检测灵敏度。
图1是示出了根据本发明实施方式的核酸扩增反应装置的示意图。图2A和图2B是根据本发明实施方式的用于核酸扩增反应的微芯片的反应区域沿着光轴方向的垂直截面图。
具体实施例方式以下将参考附图描述本发明的优选实施方式。应当注意，以下的实施方式仅是示例性地说明本发明，而不应该解释为对本发明范围的限制。1.核酸扩增反应装置(1)反应区域(a)基板(用于核酸扩增反应的微芯片)(b)核酸扩增反应(c)核酸扩增(产物)检测方法(2)温度控制器⑶照射器(4)检测器2.核酸扩增反应装置的操作(1)变型例(a) RT-LAMP 装置的操作(b) RT-PCR装置的操作<1.核酸扩增反应装置>图1是根据本发明实施方式的核酸扩增反应装置的示意图。图2A和2B是根据本发明实施方式的用于核酸扩增反应的微芯片的反应区域沿着光轴方向的垂直截面图。注意，为了方便说明，图中示出的装置的结构和其它细节已被简化。根据本发明实施方式的核酸扩增反应装置1可操作地控制核酸扩增反应，用于使用反应区域2、温度控制器3、照射器4和检测器5的核酸的扩增和定量。在本发明实施方式的核酸扩增反应装置1中，温度控制器3和反应区域2 (可分离地设置；基板6)置于照射器4和检测器5之间。此外，针孔7、滤光器(未示出)和聚光透镜(未示出)也可以适当地设置在反应区域2和照射器4之间，用于例如调节光量和光成分。而且，基板支撑体8、滤光器(未示出)和聚光透镜(未示出)也可以适当地设置在反应区域2和检测器5之间，用于支撑反应区域2并且用于例如调节光量和光成分。根据本发明实施方式的核酸扩增反应装置1还包括控制单元(未示出)，控制单元控制本发明实施方式的装置涉及的各种操作(包括例如光控制、温度控制、核酸扩增反应、 检测控制、检测出的光量的计算以及监视)。以下详细地描述每个元件的结构。(1)反应区域反应区域2是作为核酸扩增反应的反应场所的区域，并且形成为锥形井形状。这样形成锥形井反应区域的水平截面积沿着光轴方向变小，其中，在核酸扩增反应过程中析出的物质(析出物)P在光轴方向上沉降。
在例如圆柱井的普通井中，必须沿着光轴方向延长在反应区域中光传播距离(具体地，井的长度)以改善在反应早期的低散射状态下的检测灵敏度或检测精度。但是，对井的延长增加了与用于控制核酸扩增反应温度的热源的距离。这造成了井内大的温差，并且由于降低了核酸扩增反应的效率或者引起了不均勻的反应而会降低检测稳定性。但是，使用如本发明实施方式的形成为锥形井形状的反应区域，在反应场所析出并且沉降的物质在朝向井的底面方向具有更高的浓度，并且散射程度增高。具体地，锥形井形状使得能够控制光通过区域的散射截面积，由此局部地增加在反应区域的水平截面积中析出物的聚集度(agglomeration degree，凝集度)。这样，即使反应区域中的痕量核酸也可以被检测出，而不需要增加光传播距离。此外，提高了反应早期(低散射)的检测灵敏度， 并且监视也变得令人满意。这样，锥形井形状的反应区域令人满意地提高了通过核酸扩增反应的浊度检测的检测灵敏度和检测精度。而且，使用具有根据本发明实施方式的锥形井的用于核酸扩增反应的微芯片可以提高浊度检测的效率。此外，由于可以确保装置的性能和可靠性而不会增加散射距离，所以很容易减小核酸扩增反应装置的整体大小(特别是厚度)。图2A和图2B是一个反应区域2的通过反应区域2的底面21的中心的沿垂直平面的截面形状。由虚线示出圆柱井2C的垂直截面形状。反应区域2具有顶面22和底面21，顶面22和底面21优选是允许光在相同的光轴方向上通过的平面。优选地，这两个面是一对平行对置的面。具有底面21和顶面22的反应区域2还具有帮助析出物P沉降的倾斜面23。优选地，反应区域2的倾斜面23以如下方式形成反应区域2的宽度在垂直截面中沿着光轴方向朝向底面21变小。这些形状的例子包括截棱锥形状2A和凹抛物面形状2B。例如，反应区域2的内表面(倾斜面23)可以形成诸如截顶圆锥和多边形截椎体的截椎体、或绕光轴旋转的抛物面。其中，由于易于形成，所以优选截顶圆锥。通过控制由锥形倾斜面23形成的光通过区域的散射截面积，即使光通过区域与圆柱井2C具有相同的容积和相同的光传播距离，也可以提高检测灵敏度和检测精度。具体地，反应区域2的底面 21的面积优选地是顶面22的面积的1/2至1/5，更优选地是1/3至1/4。使用设置在该面积比内的底面21的面积，形成一个斜面以帮助析出物P沉降而不会被吸附在倾斜面23上。 因为在底面侧可以有效地局部增加析出物的聚集度，通过核酸扩增反应的浊度检测的检测灵敏度和检测精度变得令人满意。优选地，反应区域2的倾斜面23的内表面经过平滑处理。平滑处理进一步帮助防止析出物(粒子)P粘附到倾斜面，并且使得斜面更有效地在朝向井的底面侧产生较高的析出物P浓度。这使得浊度检测的检测灵敏度和检测精度变得更好。平滑处理可以是例如抛光或涂覆。抛光可以由例如使用抛光剂的化学机械抛光来执行。抛光剂的例子包括用于抛光塑料基板和玻璃基板的包含无机填料(粒子)的浆状抛光剂。无机填料例如可以是选自碳酸钙、氢氧化铝、氢氧化钙、氢氧化镁、二氧化钛、硅酸酐和硅石中的一种或多种。用于涂覆的涂覆剂可以是例如硅，并且可以优选使用具有高透射率的硅。具有高透射率的硅可以涂布在反应区域2的整个内表面，由此很好地提高用于核酸扩增反应的微芯片(具体地，包括反应区域2的基板)的制造效率。
(a)基板(用于核酸扩增反应的微芯片)例如，用于核酸扩增反应的微芯片等的反应室(例如，基板)优选包括一个或多个反应区域2。锥形井形状可以容易地在这样的反应室中形成。设置有反应区域2的用于核酸扩增反应的微芯片(基板6)可以由单个或多个基板形成。基板6的一个端表面是照射光的表面(顶面22侧)，而另一端表面是穿过反应区域的光射出的表面(底面21侧)。优选地，这两表面表示一对平行对置的表面。用光照射反应区域2的顶面22，然后光穿过反应区域2并从底面21射出。然后， 检测器5检测散射光量和透射光量。注意，还可以从用于核酸扩增反应的微芯片的反应区域2的底面侧一侧照射光来测量散射光量和透射光量。用于在基板6中形成反应区域2的方法没有特别的限制。优选地，例如，通过以下方式形成反应区域2 对玻璃基板层进行湿蚀刻或干蚀刻，或者对塑料基板层进行纳米压印、喷射模塑或切削。例如，如截棱锥形状2A或凹抛物面形状2B的一个或多个反应区域2可以通过研磨切削或模制形成在单个基板中，并且另一基板可以置于该基板的顶面。基板6的材料没有特别的限制，考虑诸如检测方法、加工容易度和耐久性等因素来适当地选择材料。根据所期望的检测方法从透光材料中适当地选择材料，例如，从玻璃材料和各种塑料(诸如聚丙烯、聚碳酸酯、环烯烃聚合物和聚二甲基硅氧烷)中进行选择。核酸扩增反应所需的试剂可以事先存储在如上所述地形成的反应区域2中。(b)核酸扩增反应本文所用的“核酸扩增反应”包括涉及温度循环的PCR(聚合酶链反应)反应和不涉及温度循环的各种等温扩增反应。等温扩增反应的例子包括LAMP (环介导等温扩增)、 SMAP(智能扩增处理(Smart Amplification Process))、NASBA(依赖核酸序列的扩增)、 ICAN (等温及嵌合引物引发的核酸扩增)、TRC(转录逆转录协同)法、SDA(链置换扩增)、TMA (转录介导扩增)和RCA (滚环扩增)。“核酸扩增反应”还包括涉及或不涉及温度改变并且用于核酸扩增的宽范围的核酸扩增反应。“核酸扩增反应”还包括涉及定量扩增核酸链的反应，诸如实时PCR(RT-PCR) 和 RT-LAMP。术语“试剂”是在核酸扩增反应中用于获得扩增的核酸链所需要的。具体例子包括具有与靶核酸链互补的碱基序列的寡核苷酸引物、核酸单体(dNTP)、酶、反应缓冲液(缓冲)溶质。PCR法涉及热变性(大约95°C )—引物退火(大约55到60°C )—延伸反应(大约72 °C )的连续的扩增循环。LAMP法是利用DNA环形成以在恒温下从DNA或RNA获得扩增产物dsDNA的技术。 作为例子，如下进行反应加入组分(i)、( )和(iii)，然后，内引物与模板核酸上的互补序列形成稳定的碱基对，并且在能够维持链置换聚合酶的酶活性的温度下培养该混合物。 培养温度优选为50°C到70°C，培养时间优选是约1分钟至约10小时。组分(i)两种内引物，额外加入两种外引物或两种环引物组分(ii)链置换聚合酶
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组分(iii)基质核苷酸(c)核酸扩增(产物)检测方法例如，可以通过使用浑浊物质、荧光物质或化学发光物质的方法来实施核酸扩增反应方法。例如，使用浑浊物质的方法可以是使用由通过核酸扩增反应获得的焦磷酸以及可以结合该焦磷酸的金属离子形成的析出物的方法。金属离子是单价或二价金属离子，并且在所述金属离子结合所述焦磷酸后，变成不溶于水的盐或难溶于水的盐的浑浊物质。这些金属离子的具体例子包括碱金属离子、碱土金属离子和二价过渡金属离子。 优选地，金属离子例如是选自以下的一种或多种碱土金属离子(诸如镁(II)、钙(II)和钡(II))以及二价过渡金属离子(诸如锌(II)、铅(II)、锰(II)、镍(II)和铁(II))。更优选镁(II)、锰(II)、镍(II)和铁(II)。在添加金属离子前的优选浓度范围为0. OlmM到100mM。检测波长优选为300nm到 800nmo使用荧光物质或化学发光物质的方法可以是例如使用通过特异性地插入双链核酸而发出荧光的荧光染料(衍生物)的插入法，或者使用通过将荧光染料结合到对扩增的核酸序列特异性的寡核苷酸而形成的探针的标记探针法。标记探针法的例子包括杂交(Hyb)探针法和水解(TaqMan)探针法。Hyb探针法是使用两个探针的方法，两个探针是被设计为彼此靠近的供体染料标记的探针和受体染料标记的探针。供体染料刺激受体染料，并且在两个探针与靶核酸杂交后，受体染料发出荧光。TaqMan探针法是使用由彼此靠近的报告染料和猝灭染料标记的探针。在核酸延伸期间，随着探针水解，猝灭染料和报告染料彼此分开，并且在被激发时，报告染料发出荧光。用于使用荧光物质的方法的荧光染料(衍生物)的例子包括SYBR Green I、 SYBR Green II、SYBR Gold、YO (噁唑黄)、TO (噻唑橙)、PG ( PiC0 Green)和溴化乙Iio用于使用化学发光物质的方法的有机化合物的例子包括鲁米诺、洛粉碱、光泽精和草酸盐。(2)温度控制器温度控制器3被设置为加热反应区域2。温度控制器3没有特别的限制，例如，可以使用佩尔蒂埃加热器(Peltier heater)和透光ITO加热器。温度控制器3可以具有例如薄膜或平板的形状。优选地，温度控制器3被设置在使热能很容易传递到反应区域2的位置。例如，温度控制器3优选设置为靠近反应区域2。具体地，温度控制器3可以被置于靠近反应区域2 的任何位置，包括在反应区域2的上面、下面和侧面，以及围绕反应区域2。例如，诸如针孔 7的其它元件可以插入它们之间。优选地，温度控制器3具有薄膜或平板的形状，并且被置于反应区域2的上面和/ 或下面。这里，温度控制器3可以被设置作为基板支撑体8，并且可在光轴上设置孔9以透过光。由于不需要在反应区域2中增加光传播距离，因此距热源的距离不会变长，并且可以容易地控制反应区域2内的温度。结果，提高了浊度检测的检测灵敏度和检测精度。
(3)照射器照射器4被配置为包括一个或多个光源10，并且使用由光源10发射出的光L来照射反应区域2。具体地，照射器4被配置为使用由光源10发射出的光L来照射反应区域2 的顶面22，以便检测由在核酸扩增反应过程中形成的析出物P散射的光量。例如，光源10 可以被置于反应区域2的顶面22上方，或者可以设置用于向反应区域2引导来自光源10 的发射光L的光导11。优选地，照射器4包括使来自光源10的发射光照射在反应区域2上的光导11。光导11具有光入射端，由一个或多个光源10发射的光入射到该光入射端。在光导11内设置将入射光L导向每个反应区域的元件(例如棱镜、反射镜和凹凸)。通过设置光导11，可以减少光源的数量，并且光可以均勻地照射到基板6的一个或多个反应区域2。而且，可以令人满意地提高浊度检测的检测灵敏度和检测精度。更少的光源使得能够减小整体大小(特别是装置的厚度)，并且可以降低功耗。光源10没有特别限制，优选是能够发射所期望的能够用于很好地检测靶核酸扩增产物的光源。光源10的例子包括激光光源、白色或单色发光二极管(LED)、汞灯和钨丝灯。在这些灯中，考虑到功耗和成本，LED是优选的。LED还具有通过使用各种滤光片能够产生所期望的光成分的优点。用于激光光源的激光类型没有特别限制，只要光源发射例如氩离子(AR)激光、氦氖(HE-NE)激光、染料激光和氪(CR)激光。可以自由地组合使用一种或多种激光光源。如图1所示，来自照射器4的光L到达反应区域2，并且被在反应区域中的扩增反应过程中形成的析出物(产生的浑浊物质)P反射或吸收。由浑浊物质P散射的光量、或透射光(光Li、I^)的光量通过诸如光圈(孔9)、聚光透镜和荧光滤光片等元件被检测器 5 (光学检测器)适当地检测。散射光可以是例如前向散射光、后向散射光或侧向散射光。在本装置中，前向散射光是有利的，这是因为可以容易地以良好的检测灵敏度检测到它。(4)检测器检测器5是能够检测从反应区域2的一端(具体地，从底面21)发射的光Ll和L2 的光量的机构。检测器5至少包括光学检测器。光学检测器没有特别的限制，可以例如是光电二极管(PD)阵列、区域成像器件 (诸如CCD图像传感器和CMOS图像传感器)、小型光传感器、线传感器扫描器或PMT(光电倍增管)，可以以适当的组合来使用它们。光学检测器检测由核酸扩增反应产生的浑浊物质 P等物质。激发滤光片或荧光滤光片可以被适当地置于本发明实施方式的核酸扩增反应装置1内。例如，激发滤光片可以被置于照射器4和反应区域2之间，或者荧光滤光片可以被置于反应区域2和检测器5之间。使用激发滤光片(未图示)，根据用于核酸扩增反应的检测方法，可以获得所期望的特定波长的光成分，或者可以除去不必要的光成分。使用荧光滤光片(未图示)，可以产生用于检测所必要的光成分(散射光、透射光、荧光)。这样，可以提高检测灵敏度和检测精度。<2.核酸扩增反应装置1的操作>
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以下描述核酸扩增反应装置1的操作，以及用于检测由浑浊物质P散射的光量的核酸扩增反应方法。光源10发射出光L。光L经过光入射端入射到光导11。然后，通过设置在光导11 内的棱镜和其它元件，入射光L被导向到反应区域2的入射端(顶面22)。光L落在形成为核酸扩增反应的反应场所的锥形井形状的反应区域2的一端(顶面22)，并且进入该锥形井。这里，由核酸扩增反应形成的析出物P由朝向井的底面侧的倾斜面23聚集，并且光散射程度增加。光L照射在反应区域2中核酸扩增反应过程中产生的析出物P。落在析出物P上的光L被反应区域2内的析出物P的表面反射或吸收，变成光 Ll (散射光和透射光)。当析出物P的量较小时出现光L2。光Ll和L2从反应区域2的另一端(底面21)射出。射出的光Ll和L2可以适当地通过荧光滤光片以产生所期望的光成分(例如，散射的光成分或透射的光成分)。然后，由检测器5 (光学检测器)检测射出的光 Ll和L2的光量。具体地，检测在扩增反应过程中产生的由析出物P散射的光的光量。因此，优选地是，经由核酸扩增反应进行的浊度检测通过如下步骤来进行照射形成为锥形井形状的反应区域，并且检测在反应过程中析出的物质散射的光量。此外，如上文所述，反应区域优选为沿着在核酸扩增反应过程中形成的析出物沉降的光轴方向截面积减小的锥形井形状。这样，通过金属离子与核酸扩增反应产生的焦磷酸结合形成的析出物的聚集度朝着井的底面侧增加，而不需要增加光的传播距离。由于析出物散射的光量(或透射光量) 更容易减少，因此可以提高检测灵敏度和检测精度。优选的是，反应区域的倾斜内表面经过平滑处理。还优选的是，反应区域的内表面形成圆形或多边形截椎体、或者凹旋转抛物面。而且，优选反应区域的底面面积是顶面面积的1/2至1/5。还优选的是，通过核酸扩增反应的检测通过使用LAMP法或PCR法的浊度检测来执行。这样，析出物更多地朝着井的底面侧聚集，使得可以令人满意地提高检测灵敏度和检测精度。(1)变形例本发明实施方式的核酸扩增反应装置还可以通过在反应之后例如将反应区域2 安装在温度控制器3中而用作核酸扩增检测装置。核酸扩增反应装置还可以用作LAMP装置或PCR装置，以通过浑浊物质检测来定量核酸。(a) RT-LAMP 装置的操作以下基于步骤Sll描述使用RT-LAMP装置的核酸检测方法。在温度控制步骤(步骤Sll)中，在为反应区域2设定的恒温(60°C到65°C )的条件下扩增每个反应区域2中的核酸。应当注意，LAMP法不需要从双链至单链的热变性，并且在等温条件下重复引物退火和核酸延伸。核酸扩增反应产生焦磷酸，其结合到金属离子并且形成作为浑浊物质的不溶性盐或难溶性盐(测量波长，300nm到800nm)。入射光(光L)落在浑浊物质上并且被散射(光 L1，L2)。然后，检测器5为了定量，实时地测量散射光的光量。也可以从透射光的光量来进
行定量。(b) RT-PCR装置的操作
以下基于步骤Spl (热变性)、步骤Sp2 (引物退火)和步骤Sp3 (DNA延伸)描述使用RT-PCR装置的核酸检测方法。在热变性步骤(步骤Spl)中，在温度控制器的控制下设置为95°C的反应区域2 中，双链DNA变性为单链DNA。在接下来的退火步骤(步骤Sp2)中，在设置为55°C的反应区域2中，引物结合到单链DNA的互补碱基序列。在DNA延伸步骤(步骤Sp3)中，反应区域2被控制在72°C以通过聚合酶反应来延伸cDNA，聚合酶反应由引物作为DNA合成起源而进行。通过步骤Spl到Sp3的重复温度循环来扩增每个反应区域2中的DNA。核酸扩增反应产生焦磷酸，并且检测浑浊物质以及如上所述地定量核酸量。根据本发明实施方式的核酸扩增反应装置使得能够进行高检测灵敏度的测量。通过水平截面积减小的锥形井形状反应区域使其成为可能，该反应区域局部地增加井的底面侧的析出物的聚集度。此外，因为不需要增加光传播距离，所以可以减小装置的整体大小， 特别是可以减小厚度，从而使得装置更加轻便。也可以进行可能需要的荧光检测。本发明包含2010年9月15日向日本专利局提交的日本在先专利申请JP 2010-206752所涉及的主题，其全部内容通过引用结合于此。本领域的技术人员应该理解，根据设计要求和其他因素，可以进行各种修改、组合、子组合和改变，只要它们在所附权利要求书或其等同物的范围之内。
权利要求
1.一种核酸扩增反应装置，包括反应区域，形成为沿着在核酸扩增反应过程中析出的物质沉降的光轴方向水平截面积减小的锥形井形状的核酸扩增反应场所； 温度控制装置，加热所述反应区域； 照射装置，对所述反应区域照射光；以及检测装置，检测由所述析出的物质从所述反应区域散射出的光量。
2.根据权利要求1所述的装置，其中，所述反应区域具有经过平滑处理的倾斜内表面。
3.根据权利要求1所述的装置，其中，所述反应区域具有形成了圆形或多边形截椎体、 或凹状旋转抛物面的内表面。
4.根据权利要求3所述的装置，其中，所述反应区域的底面面积是所述反应区域的顶面面积的1/2至1/5。
5.根据权利要求4所述的装置，其中，通过所述核酸扩增反应的检测是使用LAMP法或 PCR法的浊度检测。
6.一种用于核酸扩增反应的微芯片，包括反应区域，形成为核酸扩增反应场所，其中，所述反应区域是沿着在核酸扩增反应过程中析出的物质沉降的光轴方向水平截面积减小的锥形井。
7.根据权利要求6所述的微芯片，其中，所述反应区域具有经过平滑处理的倾斜内表
8. —种核酸扩增反应方法，包括对设置为核酸扩增反应场所的反应区域进行光的照射，并且检测由在扩增反应过程中析出的物质散射的光的光量，所述反应区域是沿着在核酸扩增反应过程中析出的物质沉降的光轴方向水平截面积减小的锥形井。
全文摘要
本发明涉及核酸扩增反应装置和方法及用于核酸扩增反应装置的基板。该核酸扩增反应装置包括反应区域，形成为沿着在核酸扩增反应过程中析出的物质沉降的光轴方向水平截面积减小的锥形井形状的核酸扩增反应场所；温度控制器，加热所述反应区域；照射器，对所述反应区域照射光；以及检测器，检测由析出的物质从所述反应区域散射出的光量。
文档编号C12M1/38GK102399677SQ20111026607
公开日2012年4月4日 申请日期2011年9月8日 优先权日2010年9月15日
发明者梶原淳志 申请人:索尼公司