β-葡聚糖内切酶PEGase-1基因及其表达产物和应用的制作方法

专利名称：β-葡聚糖内切酶PEGase-1基因及其表达产物和应用的制作方法
β-葡聚糖内切酶PEGase-1基因及其表达产物和应用
技术领域：
本发明涉及分子生物学，尤其涉及一种β-葡聚糖内切酶PEfeise-I基因及其表达产物和应用。
背景技术：
β-1,3 )-葡聚糖内切酶(Endo-β _1，3 ⑷-glucanase，Efeise,以下简称“ β-葡聚糖内切酶”，酶学分类号为EC3. 2.1.73)是一类能偶特异性的水解β-1,3 )-葡聚糖中与β_1，3糖苷键毗邻的β _1，4糖苷键的糖苷水解酶(glycosylhydrolases，GH)，水解产物通常为3 5个寡糖[1]。大麦芽是啤酒生产的主要原料，大麦胚乳细胞壁约70%的组分为β-1，30)_葡聚糖[2]。在啤酒酿造过程中，糖化过程变性的蛋白质会与过量的β-1，30)_葡聚糖结合会造成酵母早期沉积，从而影响发酵，并导致啤酒酿造过程中的双乙酰还原期延长；过量的 β-1,3 )-葡聚糖还会引起啤酒浑浊和沉淀，影响啤酒的品质。因此，啤酒在原料糖化后， 要添加适量的葡聚糖内切酶以水解原料中的β-1，30)_葡聚糖。麦片因纤维含量高、 营养价值高成为老年人喜爱的食品，但食用过量的麦片容易引起老年人消化不良，因此，在麦片中添加适量的β-葡聚糖内切酶或食用麦片后再食用几片含β-葡聚糖内切酶的多酶片可以有助于消化。玉米胚乳细胞壁中也含大量β-1，30)_葡聚糖，崽猪食用以玉米为主要原料的饲料时容易引起消化不良。因此，在饲料中添加适量的β-葡聚糖内切酶，让崽猪及早食用可消化的饲料，可以让崽猪及早断奶，从而提高生猪的生产效率。植物、真菌和细菌都含有β-葡聚糖内切酶，植物β-葡聚糖内切酶属于糖苷水解酶的GH17家族，而微生物β-葡聚糖内切酶则属于糖苷水解酶的GH16家族。尽管GH16和 GH17家族的β-葡聚糖内切酶有相似的功能，但他们在结构上却没有相似性，GH17家族成员的三级结构呈(β/α)8桶状[3]，而GH16家族成员的三级结构则呈β-三明治折叠卷状 Μ。大麦β-葡聚糖内切酶在种子萌芽早期表达量最高，其最适PH值(pH。pt)为4. 6、最适温度(T。pt)为45°C [5’6]。芽孢杆菌β-葡聚糖内切酶也能特异水解大麦β-1,3 )-葡聚糖，其pH。pt介于6.0 7.5、T。pt介于58°C 60°C [7_13]，但该类β-葡聚糖内切酶大多对酸环境敏感[1]。浸麻芽孢杆菌β-葡聚糖内切酶是最耐热的β-葡聚糖内切酶之一，T-为 65°C，在75°C时还有80%的活性，pH-为中性。淀粉液化芽孢杆菌的β-葡聚糖内切酶的 pH-为6.0，受酸性环境影响最小[14]。用淀粉液化芽孢杆菌葡聚糖内切酶N端的16个氨基酸替换浸麻芽孢杆菌β -葡聚糖内切酶N端的16个氨基酸组合成的杂合酶Η(Α16-Μ) 在80°C时还有80%的活性，对酸性环境耐受能力有所提高，对大麦β-1，30)_葡聚糖的特异性还比野生型浸麻芽孢杆菌β-葡聚糖内切酶还高40% [15]，但国内没有该类酶的知识产权，啤酒行业使用的β-葡聚糖内切酶目前主要依赖进口。真菌β-葡聚糖内切酶水解的底物比大麦和芽孢杆菌β-葡聚糖内切酶广泛，不仅能水解大麦β-1，30)_葡聚糖，还能水解羧甲基纤维素和昆布多糖[16_19]。尽管国内在芽孢杆菌β-葡聚糖内切酶和真菌β-葡聚糖内切酶上也有一定的研究[11_13’19’2°]，但能替代进口产品的β-葡聚糖内切酶还没有出现。

发明内容基于此，有必要提供一种能够表达具有葡聚糖内切酶活性的蛋白的葡聚糖内切酶PEfese-I基因，并提供其表达产物及应用。一种β -葡聚糖内切酶PEfeise-I基因，包括如下序列(a)、编码由SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸，或者所述多核苷酸的互补链；(b)、和编码由SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸具有至少 98%同源性的多核苷酸，或者所述多核苷酸的互补链；(C)、编码多肽的多核苷酸或所述多核苷酸的互补链，所述多肽由SEQ IDNo. 1所示的氨基酸序列组成，其中一个或多个氨基酸被缺失、替代或增加，且所述多肽具有β -葡聚糖内切酶活性；或(d)、编码多肽的多核苷酸或所述多核苷酸的互补链，所述多肽与由SEQ IDNo. 1所示的氨基酸序列组成的多肽具有至少98%的同源性。一种β-葡聚糖内切酶PEfeise-I基因，包括如下序列(a)、由SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，或者所述多核苷酸的互补链；(b)、和编码由SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少98%同源性的多核苷酸，或者所述多核苷酸的互补链；或(c)、编码多肽的多核苷酸或所述多核苷酸的互补链，所述多核苷酸序列由SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列组成，其中一个或多个密码子被缺失、替代或增加，所述多肽具有 β-葡聚糖内切酶活性。优选的，所述β -葡聚糖内切酶PEfese-I基因包括由SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸。一种基因表达载体，包括上述的β-葡聚糖内切酶PEfese-I基因。一种宿主细胞，包括如上述的基因表达载体，所述宿主细胞为真核生物细胞。优选的，所述真核生物细胞为酵母细胞或里氏木霉细胞。一种蛋白质的制备方法，包括如下步骤步骤一、提供上述的宿主细胞，诱导表达得到表达液； 步骤二、利用40 %和70 %的饱和硫酸铵将所述表达液分级沉淀，分离粗产物；步骤三、利用HiTrap Capto Q离子交换层析胶纯化粗产物，得到所述蛋白质。一种蛋白质，包括如下序列(a)、由SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列组成的多肽；(b)、和由SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列组成的多肽具有至少98%同源性的多肽；或(C)、由SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列组成的多肽，其中一个或多个氨基酸被缺失、替代或增加，且所述多肽具有β -葡聚糖内切酶活性。一种酶制剂，包括上述的蛋白质；所述酶制剂用于水解β-1，30)_葡聚糖。
优选的，所述酶制剂还包括用于提高酶活性的金属阳离子。从多头绒泡菌cDNA文库中筛选PSRI3K相关蛋白基因，分离出一段编码具有β-葡聚糖内切酶活性的β-葡聚糖内切酶类似蛋白的3' -cDNA片段。该3' -cDNA片段表达的β-葡聚糖内切酶类似蛋白具有如SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列，该3' -cDNA片段具有如SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列。上述β -葡聚糖内切酶PEfese-I基因能够表达具有β-葡聚糖内切酶活性的蛋白质，表达产物可以应用于啤酒酿造，以及作为药品、食品和饲料添加剂。

图1为PEfese-I与嗜热拟青霉的β -葡聚糖内切酶的氨基酸序列比对图。图2为模拟的嗜热拟青霉的β-葡聚糖内切酶与PEfese-I的三级结构示意图；其中，A为模拟的嗜热拟青霉β -葡聚糖内切酶的三级结构，B为模拟的PEfese-I的三级结构。图3为实施例2在大肠杆菌细胞内表达的Trx-PEGase-I与硫氧还蛋白标签蛋白进行SDS-PAGE后考马斯蓝染色的示意图。图4为实施例3在酵母细胞内表达的PEfese-I进行SDS-PAGE后考马斯蓝染色的示意图；其中，箭头指向表达的PEfese-1。图5为实施例4在里氏木霉细胞内表达的PEfese-I与阴性对照组同时进行 SDS-PAGE后考马斯蓝染色的示意图；其中，箭头指向表达的PEfeise-l。图6为从实施例4得到的表达PEfeise-I的T. reesei QM9414传代7次后，选择第 2代和第8代菌体提取基因组，PCR扩增PEfese-I基因片段后电泳的得到的电泳示意图。图7为从实施例4得到的表达PEfeise-I的T. reesei QM9414传代7次后，选择第 2代和第8代菌体表达分泌的PEfese-I水解大麦β -glucan的活力检测示意图。图8为实施例4中实验组和阴性对照组收集到的上清液，与实施例6中粗分离得到的粗酶液和纯化后得到的蛋白一起，进行SDS-PAGESDS-PAGE后考马斯亮蓝染色的示意图；其中，箭头指向纯化的PEfese-1。图9为实施例6得到的纯化PEGase-I水解大麦β -glucan的Lineweaver-Burk 双倒数方程曲线图。图10为实施例6得到的纯化PEfeise-I水解大麦β -glucan的活力随反应体系pH 的变化示意图。图11为实施例6得到的纯化PEfeise-I水解大麦β -glucan的活力随反应体系温度的变化图。图12为实施例6得到的纯化PEfeise-I在不同温度下水解大麦β -glucan活力随时间的变化图。图13为实施例6得到的纯化PEfeise-I在不同pH缓冲液中存放M小时后的水解大麦β-glucan活力变化图。图14为为实施例6得到的纯化PEfese-I在不同浓度不同种类的金属离子存在下水解大麦β-glucan活力的示意图。图15为PEfeise-I基因在里氏木霉QM9414重组转化的技术示意图。
具体实施方式下面结合附图及实施例对β -葡聚糖内切酶PEfese-I基因及其表达产物和应用做进一步的解释说明。以多头绒泡菌SR蛋白激酶PSRPK(GenBank序列号DQ140379)为饵蛋白，通过酵母双杂交，从多头绒泡菌cDNA文库中筛选PSRPK相关蛋白基因[22]，分离出一段编码具有 β-葡聚糖内切酶活性的β-葡聚糖内切酶类似蛋白的3' -cDNA片段。该3' -cDNA片段表达的β -葡聚糖内切酶类似蛋白具有如SEQ IDNo. 1所示的氨基酸序列，该3' -cDNA片段具有如SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列。提供一实施方式的β-葡聚糖内切酶PEfese-I基因，该基因编码具有β-葡聚糖内切酶活性的蛋白质。在较优的实施方式中，该β-葡聚糖内切酶PEfeise-I基因包括编码由SEQ IDNo. 1 所示的氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸，或者所述多核苷酸的互补链。特别的，该葡聚糖内切酶PEfese-I基因包括由SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，或者所述多核苷酸的互补链。该β -葡聚糖内切酶PEfeise-I基因还可以为包括和编码由SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸具有至少98%同源性的多核苷酸，或者所述多核苷酸的互补链；优选为至少具有至少99%同源性。特别的，该β-葡聚糖内切酶PEfese-I基因和编码由SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少98%同源性的多核苷酸， 或者所述多核苷酸的互补链；优选为至少具有至少99%同源性。该β -葡聚糖内切酶PEfese-I基因还可以为包括编码多肽的多核苷酸或所述多核苷酸的互补链，所述多肽由SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列组成，其中一个或多个氨基酸被缺失、替代或增加，且所述多肽具有葡聚糖内切酶活性。特别的，该葡聚糖内切酶PEfese-I基因包括编码多肽的多核苷酸或所述多核苷酸的互补链，所述多核苷酸序列由SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列组成，其中一个或多个密码子被缺失、替代或增加，所述多肽具有葡聚糖内切酶活性。该β -葡聚糖内切酶PEfese-I基因还可以为包括编码多肽的多核苷酸或所述多核苷酸的互补链，所述多肽与由SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列组成的多肽具有至少98% 的同源性；优选为至少具有至少99%同源性。这种β -葡聚糖内切酶PEfese-I基因能够表达具有β -葡聚糖内切酶活性的蛋白质，表达产物可以应用于啤酒酿造，以及作为药品、食品和饲料添加剂。由于蛋白编码基因的多态性及变异，天然存在的蛋白质会出现氨基酸的缺失、插入、取代或其它变异，从而导致蛋白质的氨基酸序列出现一个或多个氨基酸被缺失、替代或增加。事实上，存在着一些生理和生物活性上基本等同于无变异蛋白质的蛋白。这些结构不同于相应的蛋白质但与该蛋白质没有明显的功能差异的多肽或蛋白称为功能等同变异体。功能等同的变异体同样适用于通过缺失、插入和突变等人工手段改变一个或多个密码子，从而向一种蛋白质的氨基酸序列中导入这类变异而制成的多肽。尽管这样能获得更多不同形式的变异体，但所得的变异体作为功能等同变异体的前提是其生理活性基本等同于原始无变异蛋白质的活性。
例如，用淀粉液化芽孢杆菌β-葡聚糖内切酶N端的16个氨基酸替换浸麻芽孢杆菌β-葡聚糖内切酶N端的16个氨基酸组合成的杂合酶Η(Α16-Μ)在80°C时还有80 %的活性，对酸性环境耐受能力有所提高，对大麦β-1，30)_葡聚糖的特异性还比野生型浸麻芽孢杆菌β-葡聚糖内切酶还高40% [15]。此外，在用基因工程方法生产蛋白质时，常把所需蛋白质表达为融合蛋白质，例如，把源于其他蛋白质的N末端肽链加到所需蛋白质的N末端以提高所需蛋白质的表达，或者把一个合适的肽链加到所需蛋白的N或C末端，表达该蛋白并使用一种对所加肽链具有亲和力的载体使所需蛋白的纯化变得更加容易。就决定基因上特定氨基酸的密码子(三联体碱基组合)而言，每种氨基酸存在1 到6个密码子。因此尽管依赖于氨基酸序列，但仍有许多编码一种氨基酸的基因。在自然界中，基因并不稳定，常发生核酸变异。基因的变异可能不影响所编码的氨基酸序列(沉默变异)，这种情况下，会产生编码相同氨基酸序列的不同基因。因此，即使分离出了编码特定氨基酸序列的基因，随着含有该基因生物体的传代，仍不可避免地会产生编码相同氨基酸序列的不同基因。用各种基因工程技术人工产生编码相同氨基酸序列的各种基因并不困难。例如， 当编码所需蛋白质的天然基因的密码子在用于以基因工程技术产生蛋白质的宿主中可利用性较低、表达的蛋白量不够时，可以人工将密码子转变成在该宿主中可利用性高的另一密码子而不改变所编码的氨基酸序列，即可增强所需蛋白质的表达。因此，这类人工生产的不同多核苷酸也包括在本发明的范围内，只要它能编码出本发明公开的氨基酸序列即可。另外，由至少一种改变(如蛋白质的氨基酸序列中有一个或多个氨基酸残基的缺失、插入或取代)所得的多肽或蛋白一般具有功能上等同于所述蛋白质的活性，编码这类多肽或蛋白的基因也包括在本发明的范围内，不管它是从天然来源分离还是人工生产的。一般的，编码功能等同变异体的基因是同源的。因此，能与本发明的基因杂交且编码具有PEfese-I活性的蛋白质的核酸分子也包括在本发明的范围内。提供一实施方式的蛋白质，由上述β -葡聚糖内切酶PEfese-I基因表达得到。这种蛋白质为β-葡聚糖内切酶类似蛋白且具有β-葡聚糖内切酶活性。在较优的实施方式中，这种蛋白质包括由SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列组成的多肽。这种蛋白质还可以包括和由SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列组成的多肽具有至少 98%同源性的多肽。这种蛋白质还可以包括由SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列组成的多肽，其中一个或多个氨基酸被缺失、替代或增加，且所述多肽具有β -葡聚糖内切酶活性。提供一实施方式的基因表达载体，包括上述β-葡聚糖内切酶PEfese-I基因。一般的，可以选择将上述β -葡聚糖内切酶PEfese-I基因采用标准程序充足到各种常规标准载体，例如pPET-32a(+)、pPICZa A、pPIC-GST等，得到上述基因表达载体。将该基因表达载体转化到宿主细胞中，得到可以表达上述具有β-葡聚糖内切酶活性的β-葡聚糖内切酶类似蛋白。由于多头绒泡菌为真核细胞，宿主细胞一般选择真核生物细胞，例如酵母细胞和里氏木霉细胞。
酵母细胞作为宿主细胞时，不仅可以在0. 5 %的甲醇诱导下表达，还能将其分泌到细胞外。里氏木霉细胞作为宿主细胞，表达的β-葡聚糖内切酶类似蛋白可以经过较好的化学修饰，具有较高的活性。提供一实施方式的上述类似蛋白的制备方法，包括如下步骤步骤一、提供包括上述β-葡聚糖内切酶PEfese-I基因的基因表达载体的宿主细胞，诱导表达得到表达液。步骤二、利用40%和70%的饱和硫酸铵将所述表达液分级沉淀，分离粗产物。步骤三、利用HiTrap Capto Q离子交换层析胶纯化粗产物，得到所述蛋白质。通过上述方法制备得到β -葡聚糖内切酶类似蛋白，还需要对得到的蛋白质进行酶学性质测定，主要包括该葡聚糖内切酶类似蛋白的最适底物、酶动力学反应常数、最适反应温度、最适反应酸碱度、温度稳定性、PH稳定性、贮藏稳定性以及宿主细胞的遗传稳定性。具体测定方法和测定数据在具体实施例中介绍。提供一实施方式的酶制剂，主要用于水解β-1，30)_葡聚糖，这种酶制剂包括上述的β-葡聚糖内切酶类似蛋白。在较优的实施方式中，酶制剂还包括用于提高酶活性的金属阳离子。金属阳离子的存在下一般会使得上述β-葡聚糖内切酶类似蛋白的活性得到加强，具体的金属阳离子可以为:Cu2\ Ni2+、Zn2+、Fe2+、Ba2+、Mg2+、Ca2+、Mn2+ 和 Co2+。下面为具体实施例部分。以下实施例中，如无特别说明，所有操作均采用本领域标准操作过程，所采用的试剂或载体等均为常规试剂或常规载体，葡聚糖内切酶类似蛋白具有如SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列，β -葡聚糖内切酶PEfese-I基因具有如SEQ IDNo. 2所示的核苷酸序列。实施例1PEGase-I基因的筛选、扩增和结构分析。取IOOmg多头绒泡菌(湿重)，用RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN,德国)提取总 RNA，用Genefcicer Kit (Invitrogen，美国)将多头绒泡菌的完整mRNAs制备成cDNAs ；通过 5' -RLM RACE (RNA ligase—mediated rapid amplification of5' -cDNA ends)技术， 从多头绒泡菌完整cDNAs中扩增β-葡聚糖内切酶类似蛋白的5' -cDNA片段；通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，用DNA Ligation Kit (Takara，大连)的Solution I将经 AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (Axygen，美国)回收的目标 DNA 片段连接到 pMD18T 载体(Takara，大连)上，将连接产物转化大肠杆菌E. coli ToplO后测序，拼接5' -cDNA和 3' -cDNA序列，获得多头绒泡菌β-葡聚糖内切酶类似蛋白的完整cDNA序列。本专利将该 cDNA 编码的蛋白命名为 PEfeise-I (Physarum Endo- β -1, 3 (4) -glucanase 1)。PEGase-I 具有如SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列，PEGase-I基因具有如SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列。根据PEGase-I 完整 cDNA 的 ORF (Open Reading frame)序列，设计含 BamHI 酶切位点(带下划线的序列)的引物 5' -CGCGGATCCATGAACCCTAAAGTGTTCATTTTTG-3'和含 Hind III酶切位点的引物5 ‘ -GGGAAGCTTTTACTGTTGGTACACTTTGATGG-3 ‘，以多头绒泡菌完整cDNA为模版，通过PCR技术从多头绒泡菌完整cDNAs中扩增出PEfeise-I基因。将PEGase-I基因编码的氨基酸序列与嗜热拟青霉(Paecilomyces thermophila) 的β-葡聚糖内切酶氨基酸序列进行比对。如图1所示，PEGase-I基因编码的氨基酸序列与嗜热拟青霉的β -葡聚糖内切酶的氨基酸序列有44%的相似性。将模拟的PEfese-I三级结构与嗜热拟青霉的β -葡聚糖内切酶的三级结构进行对比。如图2所示，模拟的PEfese-I三级结构与嗜热拟青霉的β-葡聚糖内切酶的三级结构类似，二级结构以片层为主，都属于热稳定的蛋白结构。由此说明，PEGase-I的热稳定性与嗜热拟青霉Efese的热稳定性相似。实施例2PEGase-I基因在大肠杆菌细胞内的表达和鉴定。用DNA Ligation Kit 的 Solution I 将经 BamH I 和 Hind III 酶切的 PCR 片段连接到经同样内切酶酶切的pET3h(+)上，将连接产物转化到Ε. coli origami (DE3) (Invitrogen，美国)，在LB固体培养板(含50 μ g/ml Amp和30 μ g/ml Kan)上筛选阳性克隆，提取重组质粒pET32(a)-pegasel进行PCR、双酶切和测序鉴定。提取表达产物Trx-PEGase-I与该融合蛋白的标签蛋白(Thioredoxin，Trx，硫氧还蛋白)同时进行SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色后如图3所示。如图3所示，Trx-PEGase-I的相对分子质量(51kD)比该融合蛋白的标签蛋白 (Thioredoxin，Trx，硫氧还蛋白)的相对分子质量(17kD)多34kD，与PEfeise-I蛋白的理论分子质量接近，说明PEfeise-I在大肠杆菌细胞内没有受到明显的化学修饰。Trx-PEGase-I 也没有水解大麦β-1,3 )-葡聚糖(β-glucan)、海带多糖(Iaminarin)和羟甲基纤维素 (carboxymethyl cellulose, CMC)的酶活力。由此说明，原核细胞作为宿主细胞表达得到的PEfeise-l不具有β-葡聚糖内切酶活性。实施例3PEfeise-I基因在酵母细胞内的表达和鉴定。以质粒pET32(a)-pegasel 为模板，用含 EcoR I 位点的引物 5' -CCGGAATTCAA CCCTAAAGTGTTCATTTTTG-3 ‘和含 Xba I 位点的弓丨物 5 ‘ -GCTCTAGAAACTGT TGGTACACTTTGATGGA-3 ‘扩增 PEGase-I 的编码基因片段；用 DNA Ligation Kit 中的Solution I将EcoR I和)(ba I酶切的PCR片段连接到相同酶切的酵母表达质粒 PPICZaA(购自Invitrogen，美国)上，并转化到E. coli ToplO内克隆；提取重组质粒 pPICZ a A-pegasel进行PCR、双酶切和测序鉴定；用限制性内切酶Mc I将其线性化后，电转化到感受态P.pastoris GSl 15 (Invitrogen，美国)细胞内，在含50 μ g/ml Zeocin的 YPDS培养板上筛选阳性克隆菌落。挑取单克隆菌落，在含50 μ g/ml kocin的液体YPDS培养基中培养(30°C,250rpm)过夜，然后用 CTAB(Hexadecyl trimethyl ammonium bromide) 法[23]提取重组菌基因组DNA，通过PCR检测重组在酵母基因组上的PEfese-I基因。用 BMGY培养液将阴性对照酵母和含PEfese-I基因的重组酵母培养至0D_为2 6(30°C， 250rpm)，再将菌体转移到BMMY诱导培养液[每隔Mhr补充0. 5% (ν/ν)甲醇一次]中诱导PEGase-I表达、分泌，在培养后的0、6、12、24、36、48、60、72和84h各取2ml菌液，离心收集上清，通过SDS-PAGE检测重组酵母表达分泌的PEfese-1，得到图4，检测培养液中的 PEGase-I水解大麦β -glucan的酶活力。如图4所示，泳道M为标准分子量蛋白，泳道1 9分别对应为酵母细胞诱导后0、 6、12、24、36、48、60、72和84h得到的菌液上清。由图4可以看出，酵母细胞表达得到相对分子质量为45kD的PEfese-I蛋白，比大肠杆菌表达的PEfese-I蛋白的相对分子质量(34kD)多llkD。说明酵母表达分泌的 PEfese-I蛋白是化学修饰蛋白。该蛋白具有水解大麦β-1，30)_葡聚糖(β-glucan)的活力，但没有水解海带多糖和羟甲基纤维素的酶活力。由此说明，酵母细胞作为宿主细胞表达得到的PEfese-I具有的β-葡聚糖内切酶活性。实施例4PEGase-I基因在里氏木霉细胞内的表达和鉴定。以质粒 pET32 (a) -pegasel 为模板，用引物 5 ‘ -CGCAGCTAGTGTGCCTCTAGAGGAG CGGATGAACCCTAAAGTGTTCATTT-3 ‘和 5 ‘ -TTACTGTTGGTACACTTTGATGGAGTTGACC-3 ‘扩增PEfeise-I编码基因片段；用DNA Ligation Kit中的Solution I将该PCR片段连接到Eamll05I酶切的质粒pPIC-PST上，然后将连接产物转化Ε. coli ToplO克隆重组质粒pPIC-PST-pegasel，提取质粒pPIC-PST-pegasel进行PCR和测序鉴定。之后再以质粒 pPIC-PST-pegasel 为模板，用引物 5 ‘ -GATAGATCTAAAAAAATATGAGCGCAGGGACAAGCA-3 ‘和 5' -AGTGTCGACTGGTACTG GGATACACGAAGAGCG-3‘，扩增PEfeise-I 表达盒Pgpd-Pegasel-Tbhlt5 参考Penttil和刘刚等建立的方法[26'27]，取10 μ g表达盒Pgpd-pegasel-T。bhl和10 μ g质粒 PAN7-1 (总体积不超过 20 μ 1)，与 200 μ 1 浓度为 IO8 个 /ml 的 T. reesei QM9414 (ATCC,美国)原生质体溶液混合，48°C热激anin后，加50 μ 1 60%的PEG4000 (含50mmol/L CaCl2W 10mmol/L Tris · Cl 的缓冲液，pH 7. 5)混勻，20min (室温)后再加入 ^il 60% 的 PEG4000 混勻，5min后加anl STC混勻，8，OOOrpm离心15min后收集原生质体，用Iml STC溶液重悬原生质体并与IOml原生质体再生培养液(含1. 2mol/L山梨醇的Mandels基础培养液) 混合，于下培养Mh，离心20min收集菌体，用Iml STC溶液重悬菌体并涂布在5个含 100 μ g/ml潮霉素B的PDA培养板上，下培养2天；挖取培养板上的菌丝接种到新PDA 固体培养板上，28°C下继续培养7天。用无菌水收集培养板上的菌丝体，按1 5%的比例接种于20ml含100 μ g/ml潮霉素B的Mandels培养液(同时接种在PDA培养板上，待其长出孢子后，收集孢子用于保种)中，28°C下培养2天，再按1 5%比例转接于25ml Mandels 产酶培养液培养5天，250rpm)，收集上清液，通过SDS-PAGE检测重组酵母表达分泌的 PEfeise-I，并测定培养液中的PEfeise-I水解大麦β -glucan的酶活力。图15为PEfeise-I基因在里氏木霉QM9414重组转化的技术示意图，重组质粒 pPIC-pegasel,由 pPICZ α A 载体的 Puc ori、Zeocin、PEM7、PTEFl 和 A0X1TT 构件以及里氏木霉的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子、里氏木霉的纤维二糖水解酶II的信号肽基因和里氏木霉的纤维二糖水解酶I终止子。其中，PEGase-I基因插在纤维二糖水解酶II的信号肽基因和纤维二糖水解酶I终止子之间。同时进行阴性对照，对照组采用单一的携带潮霉素抗性基因的质粒pAN7-l转化到"Trichoderma reesei QM9414 (里氏木霉)，其他条件与实验组相同，收集上清液。采用实验组和阴性对照组收集到上清液进行SDS-PAGE，得到图5，泳道M为标准分子量蛋白，泳道1为实验组收集到的发酵液，泳道2为阴性对照组收集到的发酵液。由图5可以看出，里氏木霉表达分泌的PEfeise-I的相对分子质量为66kD，比大肠杆菌表达的PEfese-I相对分子质量多32kD ；比酵母表达分泌的PEfese-I相对分子质量多 21kD，说明里氏木霉表达分泌的PEfese-I比酵母表达分泌的PEfese-I的化学修饰程度还高。里氏木霉表达分泌的PEfese-I具有水解大麦β-1,3 )-葡聚糖的活力。实施例5实施例4中得到的含PEfese-I编码基因的里氏木霉的遗传稳定性实验。将实施例4中得到的表达PEfeise-I的T. reesei QM9414重组菌接种不含抗生素的PDA培养板上，长出的孢子后再接种到新的PDA培养板上，如此反复，传代7次。第2代和第8代菌体用CTAB法提基因组，PCR扩增PEfese-I基因片段进行鉴定， 结果如图6所示。将第2代和第8代菌体接到液体培养基，离心取上清，按常规方法测酶活力，结果如图7所示。由图6可以看出，传代7次后仍然能从重组菌的基因组DNA中扩增出PEfese-I基因。由图7可以看出，传代7次后的PEfese-I表达菌仍然具有水解大麦β-1,3 )-葡聚糖的活力。由此说明，PEGase-I表达菌在遗传上是稳定的，且保持着表达、分泌PEfese-I的功能。实施例6实施例4中里氏木霉表达分泌的PEGase-I的粗分离和纯化。PEGase-I 的粗分离。将表达PEfeise-I的T. reesei QM 9414重组菌接种于含100 μ g/ml潮霉素B 的Mandels基础培养液中培养( °C，250rpm) 2天后按1 5 %的比例接菌于Mandels 产酶培养基二8 °C下再培养4 5天，至培养液中的葡萄糖耗尽，之后在4°C下离心 (10，OOOrpm) 20min,收集发酵液上清加硫酸铵至40%饱和度，2hr后离心收集上清，加硫酸铵至70%饱和度，离心收集沉淀，用0. 05mol/LHAC · NaAC缓冲液(pH5. 5)溶解沉淀蛋白并透析3次，用3，000MW孔径的滤膜(Millipore，美国)将透析液超滤浓缩成細1粗酶液。用 BCA (BicinchoninincAcid)法[24]测定浓缩液的蛋白含量(试剂盒由北京CWBIO公司生产)， 并测定粗酶水解大麦β-glucan活力。PEGase-I 的纯化。用0. 05mol/L 的 HAC · NaAC 缓冲液(ρΗ4· 5)平衡预装好的 Hi Trap Capto Q 离子交换柱(GE Healthcare，美国)，取Iml粗酶液用0. 45 μ m滤膜过滤并上柱，用0. 05mol/ L HAC · NaAC缓冲液(pH4. 5)洗脱杂蛋白，用含0 lmol/L NaCl缓冲液(0. 05mol/L HAC · NaAC, pH4. 5)梯度洗脱蛋白，之后通过BCA法测定每个洗脱峰的蛋白含量，以及水解大麦β-glucan的酶比活力。将实施例4中实验组和阴性对照组收集到的上清液，与本实施例中粗分离得到的粗酶液和纯化后得到的蛋白一起，进行SDS-PAGE，结果如图8所示。其中，泳道M为标准分子量蛋白，泳道1为实施例4中阴性对照组收集到的上清液，泳道2为实施例4中实验组收集到的上清液，泳道3为HiTrap Capto Q离子交换胶层析分离、纯化后得到的PEfese-1， 泳道4为40% 70%的硫铵分级沉淀得到的粗酶液。BCA法测定蛋白含量，以及水解大麦β-glucan的酶比活力数据图下表所示表权利要求
1.一种β-葡聚糖内切酶PEfeise-I基因，其特征在于，包括如下序列(a)、编码由SEQID No. 1所示的氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸，或者所述多核苷酸的互补链；(b)、和编码由SEQID No. 1所示的氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸具有至少98%同源性的多核苷酸，或者所述多核苷酸的互补链；(c)、编码多肽的多核苷酸或所述多核苷酸的互补链，所述多肽由SEQIDNo. 1所示的氨基酸序列组成，其中一个或多个氨基酸被缺失、替代或增加，且所述多肽具有葡聚糖内切酶活性；或(d)、编码多肽的多核苷酸或所述多核苷酸的互补链，所述多肽与由SEQIDNo. 1所示的氨基酸序列组成的多肽具有至少98%的同源性。
2.一种β-葡聚糖内切酶PEfese-I基因，其特征在于，包括如下序列(a)、由SEQID No. 2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，或者所述多核苷酸的互补链；(b)、和编码由SEQID No. 2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少98%同源性的多核苷酸，或者所述多核苷酸的互补链；或(c)、编码多肽的多核苷酸或所述多核苷酸的互补链，所述多核苷酸序列由SEQID No. 2所示的核苷酸序列组成，其中一个或多个密码子被缺失、替代或增加，所述多肽具有 β-葡聚糖内切酶活性。
3.如权利要求2所述的β-葡聚糖内切酶PEfese-I基因，其特征在于，所述β-葡聚糖内切酶PEfese-I基因包括由SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸。
4.一种基因表达载体，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的葡聚糖内切酶 PEGase-I 基因。
5.一种宿主细胞，其特征在于，包括如权利要求4所述的基因表达载体，所述宿主细胞为真核生物细胞。
6.如权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述真核生物细胞为酵母细胞或里氏木霉细胞。
7.一种蛋白质的制备方法，其特征在于，包括如下步骤步骤一、提供如权利要求5所述的宿主细胞，诱导表达得到表达液；步骤二、利用40%和70%的饱和硫酸铵将所述表达液分级沉淀，分离粗产物；步骤三、利用HiTrap Capto Q离子交换层析胶纯化粗产物，得到所述蛋白质。
8.一种蛋白质，其特征在于，包括如下序列(a)、由SEQID No. 1所示的氨基酸序列组成的多肽；(b)、和由SEQID No. 1所示的氨基酸序列组成的多肽具有至少98%同源性的多肽；或 (C)、由SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列组成的多肽，其中一个或多个氨基酸被缺失、替代或增加，且所述多肽具有葡聚糖内切酶活性。
9.一种酶制剂，其特征在于，包括如权利要求8所述的蛋白质；所述酶制剂用于水解 β-1，30)_葡聚糖。
10.如权利要求9所述的酶制剂，其特征在于，所述酶制剂还包括用于提高酶活性的金属阳离子。
全文摘要
本发明公开一种从多头绒泡菌分离的β-葡聚糖内切酶PEGase-1基因，该基因编码的蛋白由309氨基酸组成，其氨基酸序列与嗜热拟青霉有44％的同源性，模拟的三级结构呈β-三明治折叠卷状，属于糖苷水解酶的GH16家族成员。将该基因重组到表达载体上后分别转化到酵母和里氏木霉内，表达的蛋白能分泌到细胞外，该蛋白可以通过40％～70％的硫铵分级沉淀粗分离，可以通过HiTrapTMCaptoTM Q离子交换层析胶纯化，并且能特异性的水解大麦β-1，3(4)-葡聚糖，其水解活力可在金属离子的存在下得到提高，从而可以应用于啤酒酿造，以及作为药品、食品和饲料添加剂。
文档编号C12R1/885GK102311965SQ201110266138
公开日2012年1月11日 申请日期2011年9月8日 优先权日2011年9月8日
发明者刘士德, 张建华, 李小青, 欧阳秋玲, 田生礼, 邢苗 申请人:深圳大学