专利名称：靶向GPMV NP、M基因shRNA的重组慢病毒的制备的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种靶向GPMV NP、M基因shRNA的重组慢病毒的制备，特别是涉及一种靶向鹅源副粘病毒NA-I株NP、M基因shRNA的重组慢病毒的制备方法，属于ー种新的抗 病育种方法，应用于禽类动物疫病防治领域。
背景技术：
新城疫是由I型禽副粘病毒引起的鸡和火鸡急性高度接触性传染病，是危害养禽业最重要的传染病之一。传统理论认为“鸡、火鸡、珠鸡及野鸡对新城疫有易感性；而水禽不能自然感染新城疫”。但是自1997年在我国多个县市的鹅群中发生和流行ー种具有高度发病率和死亡率的鹅传染病。该病是以消化系统发生病变为主要的临床症状和病变特征的传染病，经过流行病学分析并通过对分离毒株的生物学和分子生物学特性鉴定，确定为血清I型副粘病毒，也就是新城疫病毒，并定名为鹅副粘病毒病。扭转了曾经认为新城疫仅侵害鸡，水禽即使以强毒感染也不致病的传统理论。目前，鹅副粘病毒病已经成为现代集约化养鹅业的主要疫病之一。在我国鹅副粘病毒病发生和流行十分严重，毎年的经济损失很大，严重威胁着我国养鹅业的健康发展。且目前尚未发现对GPMV有特效的药物，GPMV防制必须以预防为主，有计划地做好鹅群的免疫监测和疫苗接种工作是防制本病发生和流行的重要措施。尽管有多种强毒疫苗和灭活疫苗用于免疫预防，但是仍然不能控制鹅副粘病毒病的发生。同时在我国还未见有分离出或研究鹅源副粘病毒弱毒株病毒的报道。目前研究结果均表明，利用新城疫病毒强毒苗或灭活苗甚至是传统的Lasota弱毒疫苗来免疫预防鹅源副粘病毒病不能起到完全免疫保护作用。因此，对于鹅源副粘病毒我们须寻求ー种新的预防思路和技术手段。传统分子抗病育种工作进展缓慢目前畜禽抗病育种的方法主要有三种(1)传统的育种方法-基于表型性状进行直接或间接选择；(2)利用DNA多态标记进行标记辅助选择(Marker assisted selection, MAS)(3)在获得抗病基因的基础上进行转基因抗病育种。遗传抗病性主要是由免疫系统控制的多基因性状，由于影响动物个体抗病性的基因相当复杂，到目前为止，定位和克隆抗病相关的DNA标记或主效基因的成功报道寥寥无几。因此依靠DNA标记进行辅助选择和通过制备转抗病基因的转基因动物来进行分子抗病育种的エ作进展非常缓慢。慢病毒载体介导RNAi的转基因动物方面的研究，慢病毒载体介导在建立转基因动物模型和哺乳动物基因组改造方面，已经成为很有发展前景的ー种新方法。虽然传统的显微注射转基因方法已经成功的培育出成活的转基因动物个体，但是其转基因效率相对较低，所以有待我们进一歩探寻能够提高转基因效率的方法。慢病毒载体介导的转基因方法与传统方法相比，能够将外源基因高效整合到宿主细胞基因组当中，特别是未分裂的细胞，其介导的外源基因能够长期稳定的表达，从而可以提高转基因效率。慢病毒载体与SiRNA技术结合抑制特异基因的表达制备转基因动物，对于改良畜牧动物生长性状、提高饲料利用率和抗病能力等都有重要价值。二者结合使用可能成为制备抗病毒动物的有用方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种靶向GPMV NP、M基因shRNA的重组慢病毒的制备，该方法容易操作，可获得滴度较高的重组慢病毒颗粒，且该重组病毒即可感染分裂期细胞，也可感染非分裂期细胞，由该重组慢病毒颗粒介导的RNAi可在不同细胞系中持续稳定的表 达。本发明的技术方案是这样实现的靶向GPMV NP、M基因shRNA的重组慢病毒的制备，其特征在于首先分别设计针对鹅源副粘病毒NA-I株NP、M基因的SiRNA干扰序列，然后将其与酶切后的慢病毒载体连接，经PCR和测序鉴定；将鉴定正确的重组慢病毒载体质粒与其他2个慢病毒包装系统中的辅助质粒共转染293T细胞，进行重组慢病毒的包装；包装后测定该重组慢病毒的滴度；将滴度较高的重组慢病毒感染293T细胞或veix)细胞，48h后观察荧光蛋白表达情況，并通过PCR方法鉴定，具体步骤如下
1.针对鹅源副粘病毒NA-I株NP、M基因RNAi靶位的设计
根据GeneBank上GPMV NA-I株NP、M基因序列及Ambion公司网站设计siRNA干扰 序列，设计结果见表I
2.shRNA序列与pLKD-EGFP载体连接，转化及鉴定
siRNA上下游序列退火后形成shRNA，将其与酶切线性化的pLKD-EGFP载体4°C连接过夜，将连接产物转化入DH5a感受态细胞中，挑去菌落，应用OMEGA质粒提取试剂盒提取质粒，通过PCR及测序鉴定结果显示该重组慢病毒重组载体构建成功分别命名为pLKD-shNPl、pLKD-shNP2、pLKD-shNP3、pLKD-shMl、 pLKD_shM2 、pLKD_shM3 、pLKD_shC0N。结果如图1、2
3.慢病毒包装及其滴度測定
将构建成功的慢病毒重组载体与慢病毒包装系统中2个辅助质粒(pCMV-dR8. 2和pCMV-VSV-G)共转染293T细胞，进行重组慢病毒的包装。包装后，超速离心将重组慢病毒进行浓缩并測定其滴度，结果如图3
4.重组慢病毒感染细胞检测
将重组慢病毒感染veix)细胞，48h后观察荧光蛋白表达情況，并提取细胞基因组 DNA,通过PCR方法检测EGFP基因序列。本发明的积极效果是可为禽类动物分子抗病育种奠定分子生物学基础；同时为新城疫等动物源性病毒病的防治提供新的途径，其具有深远的研究性和广泛的应用性。
图I为重组慢病毒载体PCR鉴定結果。图2为重组慢病毒载体测序結果。图3为重组慢病毒滴度测定結果。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做详细说明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为 常规方法。实施例I RNAi靶位的设计及shRNA慢病毒载体的构建
应用Ambion公司的siRNA在线设计软件和设计原则，对GPMV NA-I株NP、M基因进行RNAi靶位筛选，同时将得到的靶位序列在GenBank中进行BLAST分析；将靶位siRNA寡核苷酸序列送上海生工合成，合成的寡核苷酸序列退火形成双链，与经内切酶Age I和EcoR I双酶切后线性化的pLKD-EGFP载体连接，转化感受态大肠杆菌DH5a，挑取重组阳性克隆进行PCR及测序鉴定(上海生エ公司进行测序分析)，产生pLKD-shNP、pLKD-shM慢病毒载体。PCR 鉴定阳性克隆的引物序列F :5’ -AATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTG-3’，
R :5’ -TGTCTGTTGCTATTATGTCTACTATTCT- 3’，PCR 反应循环条件94°C预变性 2 min ；94°C变性 30s，59°C退火 30s，72°C延伸 30s (30 个 cycles);最后 72°C延伸 10 min。实施例2慢病毒包装
转染前24h，将处于对数生长期的293T细胞用O. 25%胰蛋白酶消化，并细胞计数，将细胞密度调整为5X IO6个/ml，重新接种于T75的细胞培养瓶，当细胞密度达到70%_80%时进行转染。将慢病毒包装系统中质粒的DNA溶液pLKD-shNP或pLKD-shM :9Pg ;pCMV-dR8. 2 :6. 75μδ和pCMV-VSV-G :2. 25Pg加入到500μ1无双抗，无血清的DMEM培养液与54μ I,混合均匀，在室温下温育20min。将DNA与FuGENG HD转染试剂混合液转移至293T细胞的培养液中混匀，于37°C、5% C02细胞培养箱中培养，培养6h后弃去含有转染混和物的培养基，每个培养皿中加入含10% FBS血清的细胞培养基12ml，于37°C、5% C02培养箱内继续培养48 h。收集转染48 h后的293T细胞上清液。于4°C，4，000r/m离心10 min，除去细胞碎片。以O. 45ΜΠ1滤器过滤上清液于超速离心管中，4°C，50000r/m离心。然后将病毒沉淀用小体积双无DMEM重悬，分装后-80°C长期保存。实施例3 LaSRT法测定慢病毒滴度
293T细胞以2X IO4/孔接种于96孔培养板，12h后以8孔为I组，更换成含8 μδ/πι1的Polybrene和10% FBS的DMEM培养液，90μ1/孔。第一孔中加入待测慢病毒原液ΙΟμΙ，此后每孔依次10 I倍比稀释，设立并测定3组复孔。感染48h后，以浓度自高到低的方向，在荧光倒置显微镜下观察各孔GFP阳性细胞数量的变化，确定计量孔(第η孔)，并计数阳性细胞数m，病毒滴度(TU/ml)=mX10n+1。实施例4重组慢病毒感染细胞检测
将重组慢病毒感染细胞48h后观察荧光蛋白表达情況，并提取感染后细胞的基因组，以 IyL (50 IOOng)细胞基因组 DNA 为模板，2 X Taq Mix 12. 5μ L (含 Mg2+、25mM dNTPs,Taq酶)，上下游引物以EGFP序列设计，EGFP-Pl:
5' -CGGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3';EGFP-P2:5'-CGGGATCCTTACTTGTACAGCTCGTC-3' 为引物)各 O. 5yL (lOpmol/μ L)，加 ddH20 10. 5 μ L，总体系 25 μ し反应条件95 °C预变性5 min后，94°C变性30 s，60°C退火30 s，72°C延伸30 S，30个循环，最后72°C延伸
5min, 4°C保存。PCR扩增获得EGFP基因片段，取PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
权利要求
1.一种靶向鹅源副粘病毒NA-I株NP、M基因ShRNA的重组慢病毒的制备方法，其特征在于首先分别设计针对鹅源副粘病毒NA-I株NP、M基因的SiRNA干扰序列，然后将其连接到酶切后的慢病毒载体的多克隆位点处，经PCR和测序鉴定；将鉴定正确的重组慢病毒载体质粒与其他2个慢病毒包装系统中的辅助质粒共转染293T细胞，进行重组慢病毒的包装；包装后测定该重组慢病毒的滴度；将滴度较高的重组慢病毒感染293T细胞或vero细胞，48h后观察荧光蛋白表达情况，并通过PCR方法鉴定，具体步骤如下 1)根据GeneBank上GPMVNA-I株NP、M基因序列及Ambion公司网站设计siRNA干扰序列； 2)shRNA序列与pLKD-EGFP载体连接，转化，挑去菌落，应用OMEGA质粒提取试剂盒提取质粒，通过PCR及测序鉴定结果显示该重组慢病毒重组载体构建成功； 3)慢病毒包装及其滴度测定； 4)将重组慢病毒感染veix)细胞，48h后观察荧光蛋白表达情况，并提取细胞基因组DNA,通过PCR方法检测EGFP基因序列。
2.根据权利要求I所述的一种靶向鹅源副粘病毒NA-I株NP、M基因shRNA的重组慢病毒的制备方法，其特征在于所设计的特异性siRNA序列，与含有禽U6启动子的自身复制缺陷型慢病毒表达载体pLKD-EGFP构建成重组载体pLKD-EGFP-shNP/M。
3.根据权利要求2所述的一种靶向鹅源副粘病毒NA-I株NP、M基因shRNA的重组慢病毒的制备方法，其特征在于重组慢病毒载体的构建方法如下 1)特异性siRNA靶序列选择及设计合成； 2)将合成的寡核苷酸siRNA序列退火形成双链，与经内切酶AgeI和EcoR I双酶切后线性化的pLKD-EGFP载体连接，转化感受态大肠杆菌DH5a，挑取重组阳性克隆进行PCR及测序鉴定。
全文摘要
本发明是一种利用慢病毒载体介导RNAi的方法，具体是先对鹅源副粘病毒NA-1株NP、M基因的核酸序列进行同源性分析，找出保守区域，设计出针对保守区的siRNA；将siRNA克隆到慢病毒表达质粒pLKD-EGFP后，再与pCMV-dR8.2和pCMV-VSV-G共同转染293T细胞中，收集转染后细胞上清，经超速离心、纯化、浓缩后形成了表达siRNA的高滴度的慢病毒载体，然后将其转导入靶细胞，使其在细胞内稳定表达，发挥抗病毒效应。本发明因其高效的转导率及严格的控制体系可以真实的评价siRNA在体内的抗病毒作用，可为禽类动物分子抗病育种奠定分子生物学基础；同时为新城疫等动物源性病毒病的防治提供新的途径。
文档编号C12N15/867GK102618581SQ201210069488
公开日2012年8月1日 申请日期2012年3月16日 优先权日2012年3月16日
发明者丁壮, 丛彦龙, 党源, 姜翠翠, 朱利塞, 李想, 杨建新, 王泽 , 郭育培, 韩明明 申请人:吉林大学