激酶活性测定方法、atp衍生物及其用途及制造方法
【专利说明】激酶活性测定方法、ATP衍生物及其用途及制造方法 【技术领域】
[0001] 本发明设及测定样品中的激酶的活性的方法、ATP衍生物、含ATP衍生物的试剂盒 及制造ATP衍生物的方法。 【【背景技术】】
[0002] 作为激酶活性的测定方法，例如，有人提议作为磯酸基供体代替使用腺巧=磯酸 (W下也称为"ATP")而使用腺巧5' -0-(3-硫代S磯酸）（W下也称为"ATP丫S")的细胞 周期蛋白依赖性激酶的活性的测定方法（参照美国专利公开No. 2002/0164673)。
[0003] US专利公开No. 2002/0164673中记载的方法如下进行。首先，在细胞周期蛋白依 赖性激酶/细胞周期蛋白复合物的存在下，使底物蛋白质和ATP丫S反应，向所述底物蛋白 质的丝氨酸残基或苏氨酸残基导入ATP丫S来源的单硫代磯酸基。接下来，使标记巧光物质 或标记酶结合于导入的单硫代磯酸基的硫原子，得到标记的底物蛋白质。其后，由所述标记 的底物蛋白质的标记巧光物质来源的巧光量或标记酶的反应发生的生成物的量算出细胞 周期蛋白依赖性激酶的活性值。 【
【发明内容】
】
[0004] 【发明要解决的技术课题】
[0005] 但是，期望可W更高灵敏度测定激酶活性的方法。
[0006] 本发明的目的是，鉴于上述W往技术的实际情况，提供W更高灵敏度测定激酶活 性的方法、ATP衍生物、含其的试剂盒、及ATP衍生物制造方法。
[0007] 【解决课题的技术方案】
[000引本发明提供激酶活性的测定方法。此方法包括W下的工序。
[0009] (A)使含激酶的被检样品、上述激酶的底物和含二硝基苯基值NP)的腺巧S磯酸 (AT巧衍生物反应，得到含向上述底物导入DNP基的含有DNP基的底物的混合物的工序，
[0010] 炬）将上述工序（A)中得到的混合物和与上述DNP基结合的抗体混合，使含有上述 含DNP基的底物和上述抗体的复合物形成的工序，及
[0011] (C)通过检测上述复合物来测定上述激酶的活性的工序。
[0012] 在此方法中，ATP衍生物是DNP基经接头结合于ATP的丫位的磯酸基的化合物。
[0013] 本发明提供腺巧=磯酸（AT巧衍生物，其为二硝基苯基经接头结合于ATP的丫位 的磯酸基的ATP衍生物。
[0014] 本发明提供制造二硝基苯基经接头结合于腺巧S磯酸（ATP)的丫位的磯酸基的 ATP衍生物的方法。此方法包括W下的工序：
[00巧]使式（n):
[0016]DNP-R2 (II)
[0017] (式中，R2表示氨基酸残基，DNP表示二硝基苯基。）所表示的化合物、
[0018] 具有可与R2连结的第1反应基及可与X2连结的第2反应基的二官能性接头、和
[0019] 式（III);
[0020]
[0021](式中，X2表示反应基（但是，除含DNP的官能团之外））所表示的化合物反应的 工序。
[00巧【发明效果】
[0023] 由本发明可W更高灵敏度测定激酶活性。 【【附图说明】】
[0024] 【图1】是显示本实施方式中设及的激酶活性的测定方法的原理的概略说明图。 [002引【图2】（A)显示实施例1中使用的ATP丫S的吸光光谱、做显示实施例1中使用 的DNP-Lys的吸光光谱、（C)显示实施例1中得到的反应生成物的吸光光谱。
[0026]【图3】是显示实施例1的结果的图。
[0027]【图4】是显示实施例1的结果的图。
[002引【图5】是显示评价实施例2及比较例1各自的测定方法的结果的图。
[0029] 【实施方式】
[0030] 接下来参照附图描述本发明的优选的实施方式。
[003U 【ATP衍生物】
[0032] 本实施方式中设及的ATP衍生物WDNP基经接头与ATP的丫位的磯酸基结合作 为特征。本实施方式中设及的ATP衍生物由ATP部分和DNP基部分构成。
[0033] 再有，在本说明书中，"激酶"是指，从ATP等的有高能磯酸键的化合物将磯酸基转 移到底物而将底物磯酸化的酶。在设及的激酶中，包含将作为底物的低分子量的化合物磯 酸化的低分子量底物型的激酶、将作为底物的有特定的氨基酸序列的蛋白质磯酸化的蛋白 激酶等。作为上述低分子量底物型的激酶，可举出肌酸激酶、丙酬酸激酶等，但不特别限定。 另外，上述蛋白激酶被大分为丝氨酸/苏氨酸激酶和，酪氨酸激酶。作为上述丝氨酸/苏氨 酸激酶，例如，可举出细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK) 1、CDK2、CDK4、CDK6等的CDK ;Aktl、 I邸、PDK1、PK、PKA、PKC、PKN、Rskl、Rsk2、SGK、KSR、LKB1、MAPK1、MAPK2、PAK3、PKR、PLK1、 PRAK、P服2、Raf、化kl等，但不特别限定。作为上述酪氨酸激酶，例如，可举出Eck、EGF-R、 ErbB-2、化bB-3、ErbB-4、FGF-R、Flt-1、PDGF-R、TrkA、TrkB、TrkC、Tie-2等的受体型酪氨酸 激酶；Abl、FAK、Pyk2、化s、Csk、巧n、Lck、Tec、B化、JAKl、JAK2、JAK3、Src、Eck、Hck、Lyn、 Tyk2、BTK、Fgr、Syk等的非受体型酪氨酸激酶等，但不特别限定。在该些激酶中，优选为 CDK，更优选为CDK1及CDK2。
[0034] 作为本实施方式中设及的ATP衍生物，例如，可举出式（I);
[003引【化1】
[0036]
[0037] (式中，公表示直接键、氧原子或硫原子、L1表示接头部分、R1表示可与上述L1及 上述DNP的双方连结的反应基、DNP表示二硝基苯基）所表示的化合物等，但不特别限定。 再有，在本实施方式中，从确保ATP衍生物的制造的容易性的观点来看，R咬X1优选是互相 不同的官能团。
[003引在式（I)中，公是直接键、氧原子或硫原子。在该些XI中，从确保ATP衍生物的制 造的容易性的观点来看，优选是硫原子。
[0039] 在式（I)中，Li是接头部分。上述接头部分是通过使具有可与Ri连结的第1反应 基和可与公连结的第2反应基的二官能性接头与R1及X1连结而生成的部分。目P，在L1的 Ri侧末端的官能团是上述第1反应基来源的官能团下称为"Ri结合基"）。另外，Li的 公侧末端的官能团是上述第2反应基来源的官能团（W下称为"X1结合基"）。
[0040] Ri结合基可根据Ri的种类适宜选择。Ri是氨基酸残基时，作为上述Ri结合基，例 如，可举出幾基、氨基、琉基等，但不特别限定。上述R2结合基可根据X2的种类适宜选择。XI 是硫原子时，作为上述公结合基，例如，可举出马来酷亚胺基、漠己酷胺基、舰己酷胺基、二 硫基等，但不特别限定。上述接头部分，根据需要，也可在Ri结合基和X1结合基之间有间隔 物。作为上述间隔物，可举出任选有取代基的碳原子数1~12的亚烷基、任选有取代基的 碳原子数2~12的亚締基、任选有取代基的碳原子数2~12的亚诀基、（聚）氧基亚烷基 等，但不特别限定。亚烷基的碳原子数，从抑制ATP衍生物的ATP部分和DNP部分之间的立 体障碍而使ATP的功能充分地发挥，有效进行磯酸化反应的观点来看，优选为1W上、更优 选为2W上，从确保ATP衍生物的水溶性而确保操作的容易性的观点来看，优选为12W下， 更优选为8W下，再优选为6W下。作为碳原子数1~12的亚烷基，例如，可举出亚甲基、亚 己基、n-亚丙基、异亚丙基、n-亚了基、异亚了基、仲-亚了基、叔-亚了基、n-亚戊基、异亚 戊基、肥0亚戊基、亚己基等，但不特别限定。亚締基及亚诀基各自的碳原子数，从抑制ATP 衍生物的ATP部分和DNP部分之间的立体障碍而使ATP的功能充分地发挥，有效进行磯酸 化反应的观点来看，优选为2W上、更优选为3W上，从确保ATP衍生物的水溶性而确保操 作的容易性的观点来看，优选为12W下，更优选为8W下，再优选为6W下。作为碳原子数 2~12的亚締基，可举出亚己締基、亚丙締基、亚了締基、亚戊締基等，但不特别限定。作为 碳原子数2~12的亚诀基，例如，可举出亚己诀基、亚丙诀基、亚了诀基、亚己诀基等，但不 特别限定。作为上述取代基，例如，可举出哲基、氨基等，但不特别限定。作为（聚）氧基亚 烷基，例如，可举出氧基亚烷基的碳原子数是1~12、氧基亚烷基的附加摩尔数是1~8的 (聚）氧基亚烷基等，但不特别限定。氧基亚烷基的碳原子数，从抑制ATP衍生物的ATP部 分和DNP部分之间的立体障碍而使ATP的功能充分地发挥，有效进行磯酸化反应的观点来 看，优选为1W上、更优选为2W上，从确保ATP衍生物的水溶性而确保操作的容易性的观 点来看，优选为12W下，更优选为8W下，再优选为6W下。作为碳原子数1~12的氧基 亚烷基，例如，可举出甲醒基、氧己締基、氧丙締基、氧基亚了基等，但不特别限定。
[0041] 在式（I)中，Ri是可与Li及DNP的双方连结的反应基。作为上述可与Li及DNP 的双方连结的反应基，例如，可举出氨基酸残基、烷基的碳原子数是1~4的氨基烷基駿酸 等，但不特别限定。作为上述氨基酸残基，例如，可举出丙氨酸残基、甘氨酸残基、亮氨酸残 基、赖氨酸残基、甲硫氨酸残基、苯丙氨酸残基、脯氨酸残基、丝氨酸残基、苏氨酸残基、鄉氨 酸残基等，但不特别限定。再有，Ri中的氨基酸残基是指氨基酸来源的2价基。在Ri中，从 确保反应基的反应性及制造的容易性的观点来看，优选为赖氨酸残基。
[00创【ATP衍生物的制法】
[0043] 本实施方式中设及的ATP衍生物，例如，可通过使式（II);
[0044] DNP-R2(II)
[0045](式中，R2表示氨基酸残基，DNP与上述相同）所表示的含有DNP基的化合物和式 (III)：
[0046]
[0047](式中，X2表示反应基（但是除含DNP的官能团之外））所表示的ATP化合物和具 有可与R2连结的第1反应基及可与X2连结的第2反应基的二官能性接头反应等而制造。 再有，在本实施方式中，式（II)所表示的含有DNP基的化合物、式（III)所表示的ATP化合 物和上述二官能性接头的反应的顺序不特别限定。式（II)所表示的含有DNP基的化合物、 式（III)所表示的ATP化合物和二官能性接头的反应可通过例如，（1)使式（II)所表示的 含有DNP基的化合物和上述二官能性接头反应之后，使得到的制造中间体和式（III)所表 示的ATP化合物反应，（2)使式（III)所表示的ATP化合物和上述二官能性接头反应之后， 使得到的制造中间体和式（II)所表示的含有DNP基的化合物反应等来进行。
[0048] W下，作为例举上述（1)的制法进行说明，但不限于此。首先，使式（II)所表示的 含有DNP基的化合物和上述二官能性接头反应，得到式（IV):
[0049] DNP-R-L' (IV)
[0050] (式中，DNP及Ri与上述相同。L2是二官能性接头来源的接头部分）所表示的制 造中间体（工序1-1)。在工序1-1的反应，例如，可在N，N-二甲基甲酯胺等的有机溶剂中 进行。在工序1-1的反应时，反应温度只要是对于使含有上述DNP基的化合物和上述二官 能性接头反应而言充分的时间即可。上述反应温度不特别限定，但通常是15~40°C、优选 为25~35°C。另外，在工序1-1的反应时，反应时间只要是对于使含有上述DNP基的化合 物和上述二官能性接头反应而言充分的时间即可。上述反应时间通常是