从自160倍的稀释物的反应液再回收的珠 称为"琼脂糖珠B"、将从自640倍的稀释物的反应液再回收的珠称为"琼脂糖珠C"、将从自 2560倍的稀释物的反应液再回收的珠称为"琼脂糖珠D"。将琼脂糖珠A~D各自用珠清洗 液A〔组成；lw/v%NP-40 及 50mMTris盐酸（pH7. 4))清洗 2 次。
[0121] 接下来，将清洗后的琼脂糖珠A~D各自用珠清洗液B〔组成；300mM氯化钢及 50mMTris盐酸（pH7. 4))清洗1次。其后，将上述琼脂糖珠A~D各自用珠清洗液C〔组成； 50mMTris盐酸（pH7. 4))清洗 1 次。
[0122] 接下来，向清洗后的琼脂糖珠A~D各自添加CDK底物溶液〔组成aOOng/yL生 物素标记CDK2底物肤巧nzo公司制、商品名；CDK2底物（生物素化的））、式（x2)所表示的 化合物2、54mMTris盐酸（pH7. 4)及20mM氯化儀）50yL得到混合物A~D。化合物2的 浓度是在362皿的吸光度成为2的浓度。此吸光度与实施例1(2)同样地测定。生物素标 记CDK2 底物肤的结构如下；生物素-Ahx-His-His-Ala-Ser-Pr〇-Arg-Lys(SEQIDN0:2)。 再有，"Biotin"表示生物素、"Ahx"表示氨基己酸（氨基己酸）。
[0123] 通过将得到的混合物A~D各自振荡着于37°C温育20分钟来进行由激酶的磯酸 基转移反应。通过进行设及的反应，向生物素标记底物肤导入DNP基。磯酸化反应结束后， 将各反应液W760Xg离屯、分离5分钟，回收各滤液。
[0124]【（3)使用化学发光的激酶的活性的检测】
[0125] 向上述（2)中得到的各滤液50yL添加含有0. 5v/v%链霉亲和素标记磁性珠的 肥PES缓冲液30yL。通过将得到的各混合物于37°C振荡着温育10分钟，在磁性珠上捕获 生物素标记CDK底物肤。其后，从各滤液，由磁石集合生物素标记CDK底物肤捕获的磁性珠 的同时，除去上清。在W下中，将从混合物A的反应液得到的磁性珠称为"磁性珠A"、将从 混合物B的反应液得到的磁性珠称为"磁性珠B"、将从混合物C的反应液得到的磁性珠称 为"磁性珠C"、将从混合物D的反应液得到的磁性珠称为"磁性珠D"。
[01 %] 将得到的磁性珠A~D各自用磁性珠清洗液〔组成；0.Iw/v%吐温（Tween) 20及 SOmMTris盐酸（pH7. 4)及138mM氯化钢)清洗3次。接下来，向清洗后的磁性珠A~D添加 含碱性磯酸酶（AL巧标记抗DNP抗体的溶液（抗体量；作为ALP活性1单位）100yL。将得 到的各混合物振荡着于37°C温育20分钟，使DNP和ALP标记抗DNP抗体反应。再有，作为 上述ALP标记抗DNP抗体，使用使ORIENTAL酵母公司制的ALP经氨基结合于ORIENTAL酵 母公司制的小鼠来源抗DNP抗体的被标记抗体。接下来，由磁石集合反应后的磁性珠A~ D的同时，除去上清。
[0127] 将得到的磁性珠A~D用上述磁性珠清洗液清洗3次。接下来，向清洗后的磁性 珠A~D添加含化学发光底物2-氯-5-(甲氧基螺{1,2-二氧杂环了烧-3,2' -(5' -氯）S环化 3. 1.I3'7]癸烧}-4-基）苯基磯酸二钢（Disodium2-chlor〇-5-(metho:xyspi;ro{l, 2-dioxetane-3, 2' -巧' -chloro)tricyclo[3. 3. 1.l3'7]decan}-4-yl)phenylphosphate)〔AppliedBiosystems公司制、商品名；CDP-star)的底物溶液150yL。通过将得到的各混 合物振荡着于37°C温育5分钟，进行由ALP的磯酸醋水解反应。
[0128] 反应结束后，将得到的反应液移到黑色96孔板。其后，将放入反应液的黑色96孔 板放到发光计〔BMGLABTECH公司制）中，测定各反应液的发光强度。将使用抗CDK1抗体之 时的发光强度称为"发光强度A1"、将使用抗CDK2抗体之时的发光强度称为"发光强度A2"。
[0129]【（4)背景的发光强度的测定】
[0130] 在上述（2)及（3)中，除代替抗CDK1抗体或抗CDK2抗体而作为对照使用兔免疫 球蛋白G(IgG)(化化iochem公司制）之外，进行与上述（2)及（3)同样的操作，测定各反应 液的发光强度。将使用兔IgG之时的发光强度称为"发光强度B"。
[0131]【（5)本实施方式中设及的测定法的定量性的探讨】
[0132] 使用发光强度A1、发光强度A2及发光强度B，根据式（A)或炬）；
[013引式（A);基于CDK1活性的特异性发光强度C1 =发光强度A1-发光强度B(A)
[0134] 式炬）；基于CDK2活性的特异性发光强度C2=发光强度A2-发光强度B
[0135] ，求出基于CDK1活性的特异性发光强度C1及基于CDK2活性的特异性发光强度 C2。
[0136] 通过研究混合物A~D各自中的CDK1或CDK2的浓度（增溶样品浓度）和使用混 合物A~D得到的各反应液的与特异性发光强度C1或特异性发光强度C2的关系，评价本 实施方式中设及的测定法的定量性。在实施例1中，研究增溶样品浓度（CDK1浓度）和基 于CDK1活性的特异性发光强度的关系的结果示于图3。在实施例1中，研究增溶样品浓度 (CDK2浓度）和基于CDK2活性的特异性发光强度的关系的结果示于图4。
[0137] 从图3所示的结果知，伴随CDK1浓度的增加（增溶样品浓度的增加）而基于CDK1 活性的特异性发光强度增加。另外，从图4所示的结果知，伴随CDK2浓度的增加（增溶样 品浓度的增加）而基于CDK2活性的特异性发光强度增加。从该些的结果知，由本实施方式 中设及的测定法可定量测定CDK1、CDK2等的激酶的活性。
[013引【实施例2】
[0139]【（l)ATP丫DNP的合成】
[0140] 由与实施例1同样的方法，得到式（x2)所表示的化合物2。
[0141]【（2)激酶反应（磯酸基转移反应）】
[0142] 向96孔滤器板（亲水性PVDF膜、Millipore公司制）的孔放入免疫沉降用缓冲 液〔含0. 1质量％NonidetNP-40和50mMTris盐酸（pH7. 4)的缓冲液）70yL。其后，向孔 中的免疫沉降用缓冲液添加含抗CDK1抗体的peron公司制）16yg的抗体溶液20yL和包 被蛋白A的20体积％琼脂糖珠佑E肥ALTHCARE公司制）30yL。
[0143] 接下来，将K562细胞增溶剂〔组成；0.1 w/v%表面活性剂NP-40(聚氧己締（9)辛 基苯基離）、1X浓度的蛋白酶抑制剂〔Roche公司制、（商品名；Complete))、在50mM氣化 钢、ImM正饥酸钢及50mMTris盐酸（PH7.4))中，通过由微量移液器的吸吐揽拌增溶，得到 细胞破碎物。将得到的细胞破碎物WISOOOXg离屯、分离5分钟而回收上清，得到7. 58mg/ mL的K562增溶样品。将上述K562增溶样品用上述增溶剂稀释86倍。将得到的稀释物 30yL添加到各孔。其后，通过使添加稀释物之后的96孔滤器板振荡着于4°C温育2小时 来使CDKl和抗CDKl抗体反应。
[0144] 反应结束后，从得到的反应液回收珠。将回收的珠用珠清洗液A〔组成；lw/v% NP-40及50mMTris盐酸（pH7.4))清洗2次。接下来，将清洗后的珠用珠清洗液B〔组成； 300mM氯化钢及50mMTris盐酸（pH7.4))清洗1次。再者，将清洗后的珠用珠清洗液C〔组 成；50mMTris盐酸（pH7.4))清洗1次。
[0145] 接下来，向清洗后的珠添加CDK底物溶液〔组成aOOng/yL生物素标记CDK2底 物肤巧nzo公司制）、式（x2)所表示的化合物2、54mMT;ris盐酸（pH7. 4)及20mM氯化儀） 50y以得到混合物。化合物2的浓度是在362nm处的吸光度成为2的浓度。此吸光度与实 施例1(2)同样地测定。
[0146] 通过使得到的混合物振荡着于37°C温育20分钟来进行由激酶的磯酸基转移反 应。通过进行设及的反应，向生物素标记底物肤导入DNP基。磯酸化反应结束后，将得到的 反应液W760Xg(2000iDm)离屯、分离5分钟，回收滤液。
[0147] 【（3)使用化学发光的激酶的活性的测定】
[0148] 向上述（2)中得到的滤液lOuL添加0.5v/v%含有链霉亲和素标记磁性珠的 肥PES缓冲液30yL。通过使得到的混合物振荡着于37°C温育10分钟，在磁性珠上捕获生 物素标记CDK2底物肤。其后，从滤液，由磁石集合生物素标记CDK2底物肤捕获的磁性珠的 同时，除去上清。
[0149] 将得到的磁性珠用磁性珠清洗液〔组成；0.Iw/v%吐温（Tween) 20及20mMTris盐 酸（pH7.4)及138mM氯化钢)清洗3次。接下来，向清洗后的磁性珠添加含抗DNP抗体（小 鼠来源抗DNP抗体、ORIENTAL酵母公司制）的溶液（抗体量；0.Ing/yL) 100yL。使得到 的混合物振荡着于37°C温育20分钟，使DNP和抗DNP抗体反应。接下来，由磁石集合反应 后的磁性珠的同时，除去上清。
[0150] 将得到的磁性珠用上述磁性珠清洗液清洗3次。接下来，向清洗后的磁性珠添加 含辣根过氧化物酶（W下也称为"HRP")标记抗小鼠IgG抗体（MM^公司制）的溶液（抗 体量；1000倍稀释）100yL。使得到的混合物振荡着于37°C温育60分钟，使抗DNP抗体的 IgG和HRP标记抗小鼠IgG抗体反应。接下来，由磁石集合反应后的磁性珠的同时，除去上 清。
[0151] 将得到的磁性珠用上述磁性珠清洗液清洗3次。接下来，向清洗后的磁性珠添加 含化学发光底物〔Pierce公司制、商品名；SuperSi即a化LISAFemto)的底物溶液120uL。 使得到的混合物振荡着于37°C温育5分钟。
[0152] 温育结束后，将得到的反应液移到黑色96孔板。其后，将放入反应液的黑色96孔 板放入发光计〔BMGLABTECH公司制）中，测定反应液的发光强度A1。
[0153] 【（4)背景的发光强度的测定】
[0154] 在上述（2)及（3)中，除代替抗CDK1抗体而作为对照使用兔免疫球蛋白G(IgG) (化化iochem公司制）之外，进行与上述（2)及（3)同样的操作，测定反应液的发光强度B。 [0155]【比较例1】
[0156] 【（1)激酶反应（磯酸基转移反应）】
[0157] 向96孔滤器板（亲水性PVDF膜、Millipore公司制）的孔放入免疫沉降用缓冲 液〔含0. 1质量％NonidetNP-40和50mMTris盐酸（pH7. 4)的缓冲液）70yL。其后，向孔 中的免疫沉降用缓冲液添加含抗CDKl抗体（操纵子公司制）16yg的抗体溶液20yL和包 被蛋白A的20体积％琼脂糖珠佑E肥ALTHCARE公司制）30yL。
[0158] 接下来，将K562细胞在增溶剂〔组成；0.Iw/v%表面活性剂NP-40 (聚氧己締巧） 辛基苯基離）、1X浓度的蛋白酶抑制剂〔Roche公司制、商品名；Complete)、50mM氣化钢、 ImM正饥酸钢及50mMTris盐酸（pH7. 4))中，通过由微量移液器的吸吐揽拌增溶，得到细胞 破碎物。将得到的细胞破碎物W18, 000Xg离屯、分离5分钟而回收上清，得到10. 2mg/mL的 K562增溶样品。将上述K562增溶样品用上述增溶剂