乳腺癌易感基因快速检测试剂盒及检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种乳腺癌易感基因快速检测试剂盒，包括检测Foxp3、FGFR2、CD14、BRCA1基因所对应的5个SNP多态性检测。本发明还公开一种乳腺癌易感基因快速检测方法。本发明的有益效果如下：通过半巢式AS-PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测，根据DNA电泳条带进行基因分型，筛选出具有潜在乳腺癌易感的个体，从而达到预防乳腺癌的目的；此方法操作简便，检测时间短、成本低，此外还具有灵敏度高，特异性强，应用前景广阔。
【专利说明】乳腺癌易感基因快速检测试剂盒及检测方法
【技术领域】:
[0001]本发明涉及生物基因检测【技术领域】，具体为一种乳腺癌易感基因快速检测试剂盒及检测方法。
【背景技术】:
[0002]乳 腺癌(Breast cancer)被称之为女性杀手，发病率仅次于肺癌。据世界卫生组织国际癌症研究中心发布的癌症报告(GL0B0CAN2008)估计，全世界每年约有138万妇女罹患乳腺癌，约有54万乳腺癌患者死亡。2008年中国女性乳腺癌新发病例数约16.9万，世界人口标化发病率为21.6/10万，居女性所有恶性肿瘤第2位；死亡率为5.7/10万，居女性癌症死亡的第6位。
[0003]早诊断早发现，乳腺癌病情的治愈还是相当令人乐观的。在第IV期得到诊断的乳腺癌患者一只有20%能够存活到5年之后，而在第I期就确诊的患者一 100%活到5年之后。因此，乳腺癌的早期诊断是目前亟待解决的问题。
[0004]目前，临床上对乳腺癌检测有传统的检测方法，包括X线诊断、超声显象检查、细胞学及组织学诊断等，但这些检测手段针对性不强，检出率低，具有较大的局限性；还有一些基因检测手段，如免疫组化技术、荧光原位杂交技术、荧光定量PCR技术、基因芯片技术等。免疫组化技术可检测肿瘤和靶细胞蛋白表达情况，不能观察基因水平突变类型，FISH能直接和准确的判断靶基因是否存在扩增，但较昂贵和繁琐。基因芯片技术可检测人数多、位点多，时间短，但仅用于已公布的基因位点、重复准确性低，价格高。荧光定量PCR技术试剂昂贵，需精密仪器等。这些技术的缺点都大大的限制了乳腺癌早期诊断的应用。
[0005]国内外对乳腺癌易感基因的研究表明，乳腺癌患者在基因水平存在某些基因突变的现象，大多表现为SNP或碱基缺失多态性。乳腺癌具有发病率、死亡率高等特点，因此，通过早期基因筛查、风险评估和监测来规避乳腺癌的发生就显得尤为重要。
[0006]目前，乳腺癌与基因多态性关联性研究成果使乳腺癌易感基因筛查成为可能。研究表明，Foxp3、⑶14、FGFR2、BRCA14个基因多态位点突变与乳腺癌发生显著相关。4个基因中，Foxp3为调节性T细胞特异性转录因子，对其发育和功能起着重要的调节作用，Foxp3+⑶4+⑶25在肿瘤免疫逃逸机制中起重要作用。⑶14识别、结合LPS复合物，介导LPS所致的细胞反应，在LPS性炎症反应、内毒休克等病理反应中起重要作用，D14参与了乳腺癌，膀胱癌等肿瘤的发生过程；FGFR2指导细胞分裂、迁移和分化成更加具有功能性的细胞，FGFR2受体镶嵌在细胞表面，接受来自外部的信号，从而传递信号到内表面，最终指导细胞分化。FGFR2基因的突变，会引起细胞过度增生而引起癌症的发生；BRCA1主要作用是控制传递细胞繁殖的信息，如果出现变异，细胞将会无节制地繁殖，导致癌症。大约有10%的乳腺癌由遗传性的BRCAl基因突变引发的。
[0007]中国汉族乳腺癌人群中，广泛存在Foxp3、⑶14、FGFR2、BRCAl，4个基因的单核苷酸多态性改变，从而导致乳腺癌的发生，因此筛查该4个基因的多态位点突变对于防治乳腺癌具有特殊的意义。
【发明内容】
:
[0008]本发明的目的是以上述现有技术为基础，提供一种操作简易、多位点、高效率、低成本、高灵敏度的，对乳腺癌能起到预防作用的乳腺癌易感基因快速检测试剂盒。
[0009]本发明另一目的是提供一种乳腺癌易感基因快速检测方法。
[0010]为了实现本发明目的，本发明采取的技术方案是:乳腺癌易感基因快速检测试剂盒，包括检测Foxp3基因上rs2294021号多态位点的引物混合物，其中，检测Foxp3基因上rs2294021号多态位点的引物混合物为:
[0011]
【权利要求】
1.乳腺癌易感基因快速检测试剂盒，其特征在于，包括检测Foxp3基因上rs2294021号多态位点，其中检测Foxp3基因多态位点的引物混合物为:
SEQ N0.1:5’ -CCCGCAGGAAGGAGGAGGTCT-3’ ；
SEQ N0.2:5’ -TTCCGAACAGCATCGTCCT-3’ ；
SEQ N0.3:5’ -GGCAGGGGCTCATGGAC-3’ ；
SEQ N0.4:5’ -GGCAGGGGCTCATGGAT-3’。
2.根据权利要求1所述的乳腺癌易感基因快速检测试剂盒，其特征在于，还包括检测FGFR2基因上rsl219648和rs2981582号多态位点。 其中，检测FGFR2基因上rsl219648号多态位点的引物混合物为:
SEQ N0.1:5’ -ATAAATACATCCCTTGTTCTCGT-3’ ；
SEQ N0.2:5’ -TCTGGGCTCTCTATTCTGTTC-3’ ；
SEQ N0.3:5’ -CACGCCTATTTTACTTGACACATG-3’ ；
SEQ N0.4:5’ -CACGCCTATTTTACTTGACACATT-3’ ；
SEQ N0.5:5’ -ATAAATACATCCCTTGTTCTCGT-3’ ；
SEQ N0.6:5’ -TCTGGGCTCTCTATTCTGTTC-3’ ；
SEQ N0.7:5’ -CACGCCTATTTTACTTGACACATG-3’ ；
SEQ N0.8:5’ -CACGCCTATTTTACTTGACACATT-3’ ； 检测FGFR2基因上rs2981582号多态位点的引物混合物为:
SEQ N0.9:5’ -TCCAAGTATCACAGGGCAT-3’ ；
SEQ N0.10:5’ -CAAGAGGCAGTTCCATAATCG-3’ ；
SEQ N0.11:5’ -CACTTAATGAACCTGTTTTC-3’ ；
SEQ N0.12:5’ -CACTTAATGAACCTGTTTTT-3’。
3.根据权利要求2所述的乳腺癌易感基因快速检测试剂盒，其特征在于，还包括检测⑶14基因上rs2569190号多态位点，其中，检测⑶14基因多态位点的引物混合物为:
SEQ N0.13:5’ -GCAGCAACAAGCAGGACG-3’ ；
SEQ N0.14:5’ -TGGTGCCAACAGATGAGG-3’ ；
SEQ N0.15:5’ -ATGTTTCAGGGAGGGGTG-3’ ；
SEQ N0.16:5’ -ATGTTTCAGGGAGGGGTA-3’。
4.根据权利要求3所述的乳腺癌易感基因快速检测试剂盒，其特征在于，还包括检测BRCAl基因上rs2046210号多态位点，其中，检测BRCAl基因多态位点的引物混合物为:
SEQ N0.17:5’ -CGGTCATTACAACACAGAACTAT-3’ ；
SEQ N0.18:5’ -CACAGAACTAAACCACCAAGAG-3’ ；
SEQ N0.19:5’ -CTTTTATTTCAGGTAGATTT-3’ ；
SEQ N0.20:5’ -CTTTTATTTCAGGTAGATTC-3’。
5.根据权利要求1、2、3或者4所述的乳腺癌易感基因快速检测试剂盒，其特征在于，检测Foxp3基因上rs2294021号多态位点的引物混合物的摩尔数比为SEQ N0.1 =SEQ N0.2/SEQ N0.3: SEQ N0.4=1:1:1 ;检测FGFR2基因上rsl219648号多态位点的引物混合物的摩尔数比都为 SEQ N0.5:SEQ N0.6/SEQ N0.7: SEQ N0.8=1:1:1 ;检测 FGFR2 基因上 rs2981582号多态位点的引物混合物的摩尔数比都为SEQ N0.9:SEQ N0.10/SEQ N0.1liSEQ N0.12=1:1:1 ;检测CD14基因上rs2569190号多态位点的引物混合物的摩尔数比为SEQ N0.13 =SEQN0.14/SEQ N0.15:SEQ N0.16=1:1:1 ;检测 BRCAl 基因上 rs2046210 号多态位点的引物混合物的摩尔数比为 SEQ N0.17:SEQ N0.19/SEQ N0.19:SEQ N0.20=0.2-0.5:1:1。
6.根据权利要求1所述的乳腺癌易感基因快速检测试剂盒，其特征在于，还包括扩增试剂和扩增后的基因分型用试剂，所述扩增试剂包括PCR缓冲液、dNTPs混合物、热启动Taq酶和超纯水；所述扩增后的基因分型用试剂包括琼脂糖、TAE缓冲液、DNA分子量标准、DNA无毒染料和DNA上样缓冲液。
7.根据权利要求6所述的乳腺癌易感基因快速检测试剂盒，其特征在于，所述扩增试剂包括 IOX PCR buffer:其中，Tris-HCl pH8.0100mM;KC1500mM;MgCl215mM，各组分浓度为2.5mM的dNTPs混合物，5U/ μ I的热启动Taq酶用量为0.1-0.125 μ I。
8.根据权利要求1所述的乳腺癌易感基因快速检测试剂盒，其特征在于，扩增试剂由以下体积的组分组成:
9.一种乳腺癌易感基因快速检测方法，其特征在于，其步骤包括， (1)、检材基因组的DNA提取； (2)、扩增和扩增产物的检测分析；
【文档编号】C12Q1/68GK103966310SQ201410040644
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年1月27日 优先权日:2014年1月27日
【发明者】陈伟民, 娄婧婧 申请人:广州市体育科学研究所