一种单细跑海带粉及海带寡糖的制备方法
【专利摘要】本发明涉及利用微生物分泌的胞外酶降解海带，具体是涉及一种单细胞海带粉及海带寡糖一次性的制备方法，经过菌株的筛选、粗酶液的制备、海带的降解及离心、沉淀、冻干/蒸发浓缩等工艺步骤，该方法简单，成本低，易于操作，制备的海带单细胞具备很高的营养价值及药用价值，制备的海带寡糖具备较高的生物活性，促进植物根的生长、抗菌、抗肿瘤、提高免疫力、增强体力等。
【专利说明】一种单细跑海带粉及海带寡糖的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及利用微生物分泌的胞外酶降解海带，具体是涉及一种单细跑海带粉及海带寡糖的制备方法，其产品作为食品添加剂、保健品、生物农药及饲料添加剂等用途。
【背景技术】
[0002]海带，又名昆布，叶片似宽带，梢部渐窄，一般长2~4米，宽20~30厘米(在海底生长的海带较小，长I~2米，宽15~20厘米)。海带通体呈橄榄褐色，干燥后变为深褐色、黑褐色，上附白色粉状物。海带素有“长寿菜”、“海上之蔬”、“含碘冠军”的美誉，从营养价值来看，是一种保健长寿的食品。除了作为海洋食品以外，由于其富含具有生理活性且可发酵得海藻多糖，如褐藻胶、褐藻糖胶和褐藻淀粉等，因此在食品、医药、农业、能源等领域极具开发潜力。
[0003]目前，利用微生物法制备单细胞海带粉的技术还未见报道，本发明利用本实验室筛选到的海洋菌株Aewi/oaJierofflmasstrain:HAS产生的酶作用于海带发现,该酶在短时间内能把海带降解为泥状，显微镜下能观察到单个的海带细胞，并且对降解完的上清液进行还原糖及总糖含量测定发现两种糖类含量均非常高。制备出的海带单细胞及海带寡糖经干燥后可以制备成食品、保健品、调味料、水产动物及畜牧动物的饲料等。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种单细跑海带粉及海带寡糖的制备方法，该方法利用筛选到的海洋菌株Aewt/oaJierofflmasstrain:HAS产生的酶降解海带,产生海带单细胞及海带寡糖；方法简单，成本低，易于操作。
[0005]为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案为:一种单细胞海带粉及海带寡糖的制备方法，具体制备方法为:
1、菌株的筛选
以海藻酸钠为唯一碳源，将海边采集的腐烂海带放入无菌生理盐水充分涮洗，得到冲洗液，吸取Iml冲洗液进行10倍、100倍和1000倍三个梯度稀释，每个梯度在用固体筛选培养基制备而成的平板上进行涂布，将涂布好的平板置于30°C恒温培养箱中培养，72h后观察平板，挑取周围有凹陷或者晕圈的单菌落确定为实验菌株，经16srRNA鉴定后属于假交替单胞菌属HAS。
[0006]2、粗酶液的制备
挑取该菌株的单菌落，接入液体发酵培养基中，24h后以4%的接种量进行传代，连续传4代待菌株状态稳定后，对发酵液经行离心，4000r/min，4°C，30min，所得上清液即为粗酶液。
[0007]3、海带的降解
用蒸馏水充分冲洗海带表面泥沙，将洗好的海带放入三角瓶中，加入一定量的灭菌海水，使海带的含量为10-50%，再接入2-10%的粗酶液，放入20-40°C的摇床中，150r/min旋转震荡 12-48h。
[0008]4、一次性获得单细胞海带和海带寡糖
降解完后对降解产物进行离心，2000-5000r/min下离心10_30min，把海带细胞及细小组织与可溶性糖类分开。将沉淀物在_50°C下进行冷冻干燥10-20h，得到单细胞海带粉，上清液进行选装蒸发浓缩，经除盐除蛋白处理后在_50°C冷冻干燥8-12h，制备海带寡糖。
[0009]步骤I中的固体筛选培养基为(w/v):海藻酸钠2%，NaNO3 0.1%，NaCl 1.5%，KH2PO4
0.05%, MgSO4JH2O 0.05%, FeSO4JH2O 0.001%,琼脂 1%，蒸馏水，pH 为 7.2。
[0010]步骤2中液体发酵培养基为(w/v):海藻酸钠0.7%，蛋白胨0.3%, NaCl 2.5%,MgSO4?7H20 0.025%, KH2P04 0.5%, NaNO3 0.025%, FeSO4.7Η20 0.001%, pH 为 7.2。
[0011]菌株HAS的生理生化特征为:乳白色菌落、海洋细菌、革兰氏阴性、杆状细菌、氧化酶阳性、不产芽胞、能产生脂酶和明胶酶、最适生长温度I (TC -30°c，最适NaCl浓度1%-10%。
[0012]本发明的有益效果在于:该方法利用筛选到的海洋菌株Pseudoalteromonasstrain:HAS产生的酶降解海带，降解后可同时制备海带单细胞及海带寡糖；方法简单，成本低，易于操作，制备的海带单细胞具备很高的营养价值及药用价值，制备的海带寡糖具备较高的生物活性，促进植物根的生长、抗菌、抗肿瘤、提高免疫力、增强体力等。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1为琼脂平板上菌落状态。
[0014]图2为肉眼观察不同时段海带的降解情况。
[0015]图3为显微镜下观察不同时段海带的降解情况。
[0016]图4为不同降解时段上清液中总糖浓度变化。
[0017]图5为不同降解时段上清液中还原糖糖浓度变化。
【具体实施方式】
[0018]下面结合实施例对本发明进行详细说明。
[0019]实施例1.一种单细跑海带粉及海带寡糖的制备方法，具体制备方法为:
1、菌株的筛选
以海藻酸钠为唯一碳源，将海边采集的腐烂海带放入无菌生理盐水充分涮洗，得到冲洗液，吸取Iml冲洗液进行10倍、100倍和1000倍三个梯度稀释，每个梯度在用固体筛选培养基制备而成的平板上进行涂布，将涂布好的平板置于30°C恒温培养箱中培养，72h后观察平板，挑取周围有凹陷或者晕圈的单菌落进行条件优化，最后确定实验菌株，有凹陷或者晕圈的单菌落如图1琼脂平板上菌落状态所示，经16srRNA鉴定后属于假交替单胞菌属，现命名为-Fseudoal teromonas strain:HAS0
[0020]固体筛选培养基为(w/v):海藻酸钠2%，NaNO3 0.1%，NaCl 1.5%, KH2PO4 0.05%,MgSO4JH2O 0.05%, FeSO4JH2O 0.001%，琼脂 1%，蒸馏水，pH 为 7.2。
[0021 ] 2、降解海带粗酶液的制备
挑取该菌株的单菌落，接入液体发酵培养基中，24h后以4%的接种量进行传代，连续传4代待菌株状态稳定后，对发酵液经行离心，4000r/min，4°C，30min，所得上清液即为粗酶液。
[0022]液体发酵培养基(w/v):海藻酸钠0.7%，蛋白胨0.3%，NaCl 2.5%，MgSO4.7Η200.025%, ΚΗ2Ρ04 0.5%, NaNO3 0.025%, FeSO4*7Η20 0.001%, pH 7.2。
[0023]3.海带的降解
用蒸馏水充分冲洗海带表面泥沙，将洗好的海带放入三角瓶中，加入灭菌海水，使海带的含量为10-50%，再接入2-10%的粗酶液，放入20-40°C的摇床中，150r/min旋转震荡12-48h。
[0024]肉眼观察0h、12h、24h、36h、48h时海带被降解的情况如图2所示，观察结果为: 随着降解时间的延长，海带碎片逐渐增加，大块的海带组织正在慢慢减少，48h左右，海
带以基本被完全降解，仅剩少量碎片。
[0025]显微镜下观察不同时段海带降解情况如图3所示，观察结果分析:
a、未被降解
海带细胞排列紧密有规则；
b、已开始被降解
细胞间隙逐渐增大，排列松散；
C、降解完全
单细胞逐渐脱落，直到均变为海带单细胞悬液。
[0026]总糖和还原糖含量检测
用硫酸苯酚和DNS法分别检测海带降解上清液中总糖和还原糖含量，结果分别如图4和图5所示，表明开始随着降解时间的延长，上清液中总糖和还原糖的含量都在逐渐增加，二者均在24h达到最高值，然后随着降解时间的延长，总糖和还原糖含量均呈下降趋势。
[0027]4、一次性获得单细胞海带和海带寡糖 降解完后对降解产物进行离心，2000-5000r/min下离心10_30min，把海带细胞及细小组织与可溶性糖类分开。将沉淀物在_50°C下进行冷冻干燥10-20h，得到单细胞海带粉，上清液进行选装蒸发浓缩，经除盐除蛋白处理后在_50°C冷冻干燥8-12h，制备海带寡糖。
【权利要求】
1.一种单细胞海带粉及海带寡糖的制备方法，其特征在于具体制备方法为: (1)、菌株的筛选 以海藻酸钠为唯一碳源，将海边采集的腐烂海带放入无菌生理盐水充分涮洗，得到冲洗液，吸取Iml冲洗液进行10倍、100倍和1000倍三个梯度稀释，每个梯度在用固体筛选培养基制备而成的平板上进行涂布，将涂布好的平板置于30°C恒温培养箱中培养，72h后观察平板，挑取周围有凹陷或者晕圈的单菌落确定为实验菌株，经16srRNA鉴定后属于假交替单胞菌属HAS ； (2)、粗酶液的制备 挑取该菌株的单菌落，接入液体发酵培养基中，24h后以4%的接种量进行传代，连续传4代待菌株状态稳定后，对发酵液经行离心，4000r/min，4°C，30min，所得上清液即为粗酶液； (3)、海带的降解 用蒸馏水充分冲洗海带表面泥沙，将洗好的海带放入三角瓶中，加入一定量的灭菌海水，使海带的含量为10-50%，再接入2-10%的粗酶液，放入20-40°C的摇床中，150r/min旋转震荡 12-48h ； (4)、一次性获得单细胞海带和海带寡糖 对降解产物进行离心，2000-5000r/min下离心10_30min，将沉淀物在_50°C下进行冷冻干燥10_20h，得到单细胞海带粉，上清液进行选装蒸发浓缩，经除盐除蛋白处理后在_50°C冷冻干燥8-12h，制备海带寡糖。
2.根据权利要求1所述的一种单细跑海带粉及海带寡糖的制备方法，其特征在于所述步骤(1)中的固体筛选培养基为(w/v):海藻酸钠2%，NaNO3 0.1%，NaCl 1.5%，KH2PO4 0.05%,MgSO4JH2O 0.05%, FeSO4JH2O 0.001%，琼脂 1%，蒸馏水，pH 为 7.2。
3.根据权利要求1所述的一种单细跑海带粉及海带寡糖的制备方法，其特征在于所述步骤(2)中液体发酵培养基为(w/v):海藻酸钠0.7%，蛋白胨0.3%，NaCl 2.5%，MgSO4.7Η200.025%, ΚΗ2Ρ04 0.5%, NaNO3 0.025%, FeSO4.7Η20 0.001%, pH 为 7.2。
4.根据权利要求1所述的一种单细跑海带粉及海带寡糖的制备方法，其特征在于所述步骤(3) (4)中海带经酶解后一次性获得单细胞海带粉和寡糖。
【文档编号】C12P19/14GK103834610SQ201410040785
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2014年1月28日 优先权日:2014年1月28日
【发明者】吴海歌, 姚子昂, 李倩, 张玉娟 申请人:大连大学