一种基于二代测序检测Rett综合症致病基因SNP位点的试剂盒及其检测方法
【专利摘要】一种基于二代测序检测Rett综合症致病基因SNP位点的试剂盒及其检测方法。本发明属于涉及基因检测领域，其检测方法是：(1)、样品DNA的提取；(2)、DNA模板多重PCR反应；(3)、DNA片段化；(4)、DNA末端修复；(5)、接头连接；(6)、连接产物纯化；(7)、PCR富集；(8)、PCR产物纯化；(9)、文库质量检测；(10)、高通量测序；(11)、测序结果的生物信息学分析；本发明具有检测通量高、灵敏度、特异性强及操作简便且安全，而且本发明操作能够更迅速、更准确、更全面；不含有毒有害物质，对试验人员以及环境都无危害。
【专利说明】
一种基于二代测序检测Rett综合症致病基因 SNP位点的试剂 盒及其检测方法
技术领域
[0001 ]本发明涉及基因检测领域，特别是涉及Rett综合症基因突变位点的检测。
【背景技术】
[0002] Rett综合征(Rett syndrome，RTT)是一种X连锁的神经发育障碍性遗传病，严重影 响儿童精神运动发育，在女童中的发病率为1/10000-1/15000; Rett综合征是仅次于21三体 综合症引起散发性严重智力障碍的主要原因之一;典型的Rett的临床特症为:婴幼儿出生 后6~18个月生长发育基本正常，随后出现神经发育停滞或倒退，丧失已获得的技能（如手 的功能、语言等），头围增长缓慢，呼吸异常，出现手的刻板动作（如搓手、绞手、吃手等），伴 有孤独症样行为;此外，惊厥发作也是Rett综合症常见的症状之一，而且到了 Rett综合症后 期，患病儿童还可能会出现骨骼改变、脊柱侧弯及强直等一系列的症状;临床上Rett综合症 分为典型和不典型二大类:典型的Rett综合症病程通常分为4个时期，即发育停滞期、快速 倒退期、假性静止期和运动恶化期;不典型的Rett综合症病程通常分5种类型，即早发惊厥 型、保留语言变异型、先天型、顿挫型和晚发退化型。
[0003] 1999年相关研究首次公布Rett于MECP2基因突变连锁，已证实40%~80%的典型 Rett患儿存在该基因突变，但Rett家族和非典型Rett患儿该基因突变的检出率相对较低， 分别为20%~29%和10%~50%;人类MECP2基因位于Xq28,基因全长76kb，包括5端非翻译 区、4个外显子以及3端非翻译区;MECP2蛋白的表达具有组织和细胞特异性，在脑、肺、脾的 表达水平最高，目前有限出现于成熟神经元中；MECP2蛋白在DNA甲基化调苄基因转录过程 中起着重要作用，是一种高度的染色质结合蛋白，广泛表达，但MECP2基因突变却仅引起神 经系统特异的发育性疾病;利用基因敲除技术造成小鼠 MECP2基因完全缺失或选择性脑组 织缺失，均出现与人类Rett类似的表型，且突出表现为中枢神经系统异常，这提示发育的中 脑比其他组织更依赖MECP2蛋白的转录抑制作用，推测致病机制为MECP2基因突变导致蛋白 结构和功能异常，使胚胎发育时期应当转录静止的基因继续转录，而这种"转录噪音"对神 经系统的生长发育具有致病作用;在典型的Rett患儿中，已报道了近200种MECP2基因突变， 包括点突变、缺失、插入，其突变多发生于外显子3和4,其中热点突变是位于8个CpG位点的C >T(约占70 % )，MBD区以错义突变为主，TRD、C末端以无义突变和移码突变为主;RTT的主要 致病基因是MECP2,近年来在不典型Rett的中还发现了⑶KL5和F0XG1基因突变，这提示着 CDKL5和F0XG1基因可能与MECP2基因一样共同在Re 11的致病过程中发挥作用。
[0004] 目前，对于Rett综合症的诊断多是通过临床表现进行判断，然而仅仅通过临床表 现进行诊断难免没有说服性，因此建立基因测定辅助临床早期确诊Rett患者是十分必要 的；现阶段对于Rett的基因检测大部分是关于MECP2基因突变的检测，主要通过普通PCR扩 增及一代测序的方法进行，一次可检测的样本及位点少，灵敏度低，耗时长，操作繁琐；因此 我们采用高通量测序对疑似Rett患者进行MECP2、CDKL5以及F0XG1基因突变检测，一次可检 测多个突变位点、灵敏度高、操作简便、用时短，可快速进行Rett综合症的早期辅助诊断。
【发明内容】
[0005] 本发明针对现有技术存在的不足，提出一种通过高通量测序检测待测样本中 MECP2、CDKL5以及F0XG1基因中热点SNP位点的试剂盒，用以辅助诊断Rett综合症的方法;该 试剂盒检测通量高、灵敏度高、特异性强，一次检测能够覆盖数百个热点SNP位点。
[0006] 本发明为了解决其技术问题所采用的技术方案是:一种基于二代测序检测Rett综 合症致病基因 SNP位点的试剂盒，所述试剂盒能够一次性检测Rett综合症致病基因 MECP2、 CDKL5以及F0XG1的共57个SNP位点，
[0007] 其中，所述MECP2的24个SNP位点：c.98dupA、c.316C>T、c.317G>A、c.378delT、 c.397C>T、c.401C>G、c.419C>T、c.423C>G、c.455C>G、c.468C>G、c.473C>T、c.502C>T、 c.582C>T、c.587C>G、c.590C>T、c.602C>T、c.608C>T、c.674C>G、c.695G>C、c.710delG、 c. 763C>T、c. 806de 1G、c. 808OT、c. 808de 1C;
[0008] 所述 CDKL5 的 18 个 SNP 位点：c.ll9C>T、c.l75C>T、c.l83delT、c.215T>A、c.352C>T、 c.380A>G、c.455G>T、c.464G>A、c.525A>T、c.532C>T、c.607G>T、c.ll96A>C、c.l311dupC、 c. 1648C>T、c. 1675C>T、c. 1708G>T、c. 2343delG、c. 25000T;
[0009] 所述F0XG1 的 15个SNP位点：c. 256C>T、c. 256dupC、c.460dupG、c.460dupG、 c.552dupC、c.577G>A、c.624C>G、c.643T>C、c.700T>C、c.730C>T、c.757A>G、c.765G>A、 c.969delC、c.1200C>G、c.1248C>G。
[0010]其中，SNP:单核苷酸多态性指的是由单个核苷酸一A，T，C或G的改变而引起的DNA 序列的改变，造成包括人类在内的物种之间染色体基因组的多样性。
[0011] 3即位点的表示方法：如(：.31601'表示核酸的第316位置上的碱基由(：变成了1'; c. 98dupA表示核酸第98位置上的碱基A重复出现了； 806delG表示核酸第806位置上的碱基G 缺失。
[0012] 引物:为正向引物及反向引物等所有引物的统称，所述引物是人工合成的两段寡 核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域 另一端的另一条DNA模板链互补;在PCR(聚合酶链式反应)技术中，已知一段目的基因的核 苷酸序列，根据这一序列合成引物，利用PCR扩增技术，目的基因 DNA受热变性后解链为单 链，引物与单链相应互补序列结合，然后在DNA聚合酶作用下进行延伸，如此重复循环，延伸 后得到的产物同样可以和引物结合。
[0013] 其检测方法，包括以下具体步骤：
[0014] 1、样品DNA提取：
[0015]抽取10例Rett综合症病患和10例健康人的血液样本各lml，共20例，将抽取的血液 样本分别置于20个1.5ml、加入抗凝剂的离心管中，后通过采用特异性结合DNA的离心吸附 柱系统进行血液样本DNA的提取，得到含有DNA的DNA溶液;提取完后再对DNA溶液中的DNA进 行完整性、浓度及纯度测定；测定过程中，如电泳条带无弥散，则证明所提取的DNA是完整 的、未降解的；另外，采用紫外分光光度计检测DNA的纯度和浓度，通常情况下，高纯度的DNA 的0D26Q/0D28()应介于1.8~2.0之间，后将所测定过的、包含有完整的及未降解的DNA的DNA溶 液放置于_20°C的环境中备用；
[0016]所述离心吸附柱系统提取DNA的原理:在离心吸附柱内使用一种特殊的硅基质滤 膜，这种滤膜在低PH值、高浓度盐存在的条件下，可以选择性吸附DNA片段，而蛋白质和其它 杂志不会被吸附。再通过一系列漂洗、离心等步骤将残留的杂质蛋白以及细胞中的其它有 机化合物去除，最后用低盐、高PH值的洗脱缓冲液将DNA从滤膜上洗脱下来;得到含有DNA的 DNA溶液；
[0017] 2、DNA模板多重PCR反应：
[0018] 在新的PCR管中加入如下试剂：提取好的DNA溶液4.5ul、PCR缓冲液4ul、 MgChl. 5ul、DNA聚合酶1.5ul、ddH204ul、正向引物2.75ul和反向引物2.75ul，将上述混合物 混匀后放入PCR仪中进行多重PCR扩增，上述扩增反应程序步骤为:95 °C反应3min，后95 °C反 应15s，后60 °C反应30s，最后72 °C反应20s，上述反应从95 °C反应3min到72 °C反应20s共反应 13个循环，13个循环反应结束后即得:经过多重PCR反应的DNA溶液;所述经过多重PCR反应 的DNA溶液用于测序文库的构建；
[0019] 其中，PCR:又称聚合酶链式反应，是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高 温变性、低温退火及适温延伸等反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具 有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点；它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分 析等基础研究，还可用于疾病的诊断或任何有DNA、RNA的地方；另外，PCR又称为无细胞分子 克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术；
[0020] 多重PCR扩增:一般PCR仅应用一对引物，通过PCR扩增产生一个核酸片段，主要用 于单一致病因子等的鉴定.多重PCR，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一 PCR反应体系 里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作 过程与一般PCR相同；
[0021] 3、测序文库构建：
[0022] (1)、DNA 片段化：
[0023] 将上述经过多重PCR反应的DNA溶液放入超声波破碎仪中进行DNA的破碎，经过超 声波破碎仪破碎后的DNA变成150-400bp的小片段，即得到片段化的DNA;
[0024] 超声波破碎仪:是一种利用强超声在液体中产生空化效应，对物质进行超声处理 的多功能、多用途的仪器，能用于多种动植物细胞、病毒细胞的破碎，DNA以及RNA的剪切，以 及用来乳化、分离、提取、消泡、清洗及加速化学反应等等。现已经被广泛应用于生物化学、 微生物学、药物化学、动物学、农学等领域。此处我们主要是通过超声波破碎仪将DNA剪切成 150-400bp小片段，得到片段化的DNA，用于测序文库的构建；
[0025] (2)、DNA 末端修复：
[0026]将上述片段化的DNA进行5,末端以及3,末端的修复，在新的PCR管中配制加入如下 试剂：片段化的DNA溶液2ul、末端快速修复反应缓冲液10ul、末端修复酶3ul、 10mMrATP10ul、ddH 20补足到50ul;使用移液器吹打，充分混匀上述溶液后，将混合溶液置入 PCR仪中进行下述温度反应:22°C反应lOmin，后再72°C反应lOmin，上述反应结束后静置4°C 保温，得到末端修复的DNA溶液；
[0027] (3)、接头连接：
[0028]在上述完成末端修复的DNA溶液的PCR管中接着加入以下试剂：快速连接缓冲液 l〇ul、连接酶2ul、接头2.5ul，得到的PCR管中溶液总体积为64.5ul;用移液器吹打上述混合 溶液，待混合溶液充分吹打混匀后，再将上述混合溶液置于PCR仪中进行下述温度反应:22 °C反应15min，最终得到连接了接头的DNA溶液；
[0029] 其中，接头:在基因工程技术中，使两个DNA分子或一个DNA分子的两端经酶切可以 配对再经连接酶共价连接的序列；
[0030] (4)、连接产物纯化：
[0031] 1)、向上述64.5ul已经连接接头的PCR管中继续加入35.5ul超纯水，使PCR管中溶 液体积增至l〇〇ul，
[0032] 2)、取90ul涡旋震荡混匀的磁珠至于上述PCR管中，用移液器将加入纯化磁珠的混 合溶液吹打10次，充分混匀上述混合溶液;在18-25Γ的室温条件下，静置孵育5min，
[0033] 其中，磁珠分离纯化DNA原理:磁珠是由具有超顺磁性的磁核表面包裹二氧化硅等 材料构成，利用这些磁珠可以实现核酸提取以及纯化的自动化操作，磁珠可以特异性地吸 附DNA，通过洗涤，去除DNA以外的RNA、蛋白质、多糖、脂质、色素等杂质，再用洗脱液解离吸 附在磁珠上的DNA，得到纯度很高的DNA，可用于PCR模板、基因工程等；
[0034] 3)、5min后将PCR管置于离心机中离心10s，后将离心后的PCR管置于磁力架中对上 述加入磁珠的混合溶液进行分离，分离后得到上层液相杂质及下层固相磁珠，，移液器移除 上层液相杂质，
[0035] 4)、保持PCR管始终置于磁力架中，后于PCR管中加入200ul新鲜配制的80%乙醇， 用以漂洗混合溶液中的磁珠，漂洗结束后，将漂洗后的溶液置于18-25Γ的室温条件下，静 置孵育30s后，再次得到上层含有乙醇的液相杂质及下层被乙醇漂洗过的固相磁珠，移液器 移除上层的液相杂质，
[0036] 5)、为了充分漂洗去除磁珠混合溶液中的杂质，完成上述步骤以后重复步骤4);
[0037] 6)、取出置于磁力架中的PCR管，将PCR管置于离心机中离心10s，此时PCR管中会有 残留液，移液器吸尽PCR管中残留液；
[0038] 7)、将PCR管从离心机中取出，再次置于磁力架中并保持PCR管始终置于磁力架中， 打开PCR管盖将被乙醇漂洗过的固相磁珠暴露于空气中直至磁珠干燥;时间为1 Omin;
[0039] 8)、10min后，将PCR管从磁力架中取出，将PCR管中加入25ul无菌超纯水洗脱吸附 于磁珠表层的DNA，使用移液器吹打无菌超纯水和DNA的混合溶液，充分混匀后，将PCR管置 于离心机中离心10s，后再放置于磁力架中，待混合溶液澄清后，得到上层无菌超纯水和DNA 的混合溶液及下层磁珠，移液器吸取上层无菌超纯水和DNA的混合溶液至新的PCR管中，所 得上层无菌超纯水和DNA的混合溶液即为连接接头的纯化DNA溶液，
[0040] (5)、PCR 富集：
[0041 ]再取新的PCR管，在新的PCR管中加入如下反应试剂：连接接头的纯化DNA溶液 23ul、PCR反应混合液25ul、接头引物2ul，混合上述溶液，后用移液器吹打上述混合溶液，充 分混匀后，将上述PCR管放入PCR仪中进行温度反应，反应程序如下:98°C反应30s，后98°C反 应10s，后65°C反应30s，后72°C反应30s，上述反应中98°C反应30s需要一个循环，从98°C反 应10s，后65°C反应30s，后72°C反应30s共反应6-15个循环，最后再72°C反应lmin-个循环， [0042]其中，当起始DNA量为lyg时，PCR循环数为6个循环;起始DNA的量为50ng时，10个循 环;起始DNA的量为5ng时，建15个循环;PCR循环数也可根据实验需要进行优化，得到富集的 PCR产物；
[0043] (6)、PCR 产物纯化：
[0044] 将上述富集的PCR产物进行纯化，纯化步骤如下：
[0045] 1)、取45ul涡旋震荡混匀的磁珠至于上述PCR管中，用移液器将加入磁珠的混合溶 液吹打10次，充分混匀上述混合溶液;在18-25Γ的室温条件下，静置孵育5min，
[0046] 2)、5min后将PCR管置于离心机中离心10s，后将离心后的PCR管置于磁力架中，所 述磁力架对加入磁珠的混合溶液进行分离，分离后得到新的上层液相杂质及下层固相磁 珠，移液器移除上层液相杂质，
[0047] 3)、保持PCR管始终置于磁力架中，后于PCR管中加入200ul新鲜配制的80%乙醇， 用以漂洗混合溶液中的磁珠，漂洗结束后，将漂洗后的溶液置于18-25Γ的室温条件下，静 置孵育30s后，再次得到新的上层含有乙醇的液相杂质及下层被乙醇漂洗过的固相磁珠，移 液器移除上层的液相杂质，
[0048] 4)、为了充分漂洗去除磁珠混合溶液中的杂质，完成上述步骤以后再重复步骤3);
[0049] 5)、取出置于磁力架中的PCR管，将PCR管置于离心机中离心10s，此时PCR管中会有 残留液，移液器吸尽PCR管中残留液；
[0050] 6)、将PCR管从离心机中取出，再次置于磁力架中并保持PCR管始终置于磁力架中， 打开PCR管盖将被乙醇漂洗过的固相磁珠暴露于空气中直至磁珠干燥;时间为1 Omin;
[0051 ] 7)、10min后，将PCR管从磁力架中取出，将PCR管中加入25ul无菌超纯水洗脱吸附 于磁珠表层的DNA，使用移液器吹打无菌超纯水和DNA的混合溶液，充分混匀后，将PCR管置 于离心机中离心10s，后再放置于磁力架中，待混合溶液澄清后，得到上层无菌超纯水和DNA 的混合溶液及下层磁珠，移液器吸取上层无菌超纯水和DNA的混合溶液至新的PCR管中，得 到纯化的PCR产物，即为测序文库；
[0052] (7)、测序文库质量检测：
[0053] 富集后的PCR产物在进行高通量测序之前需要进行质量检测，制备好的测序文库 可用琼脂糖凝胶电泳、全自动毛细管电泳系统检测测序文库中的片段长度分布范围；
[0054] (8)、高通量测序：
[0055]将制备好的测序文库置于高通量测序仪上进行测序，读长250BP，测序深度3000X， 每个样本产生90M的数据量，数据量等于传统测序的3000次克隆测序的覆盖，测序的深度保 证结果的准确性，可以测出比例非常低的突变位点，高通量测序完成以后对结果进行生物 信息学分析；
[0056]测序深度:测序深度是指测序得到的总碱基数与待测基因组大小的比值。假设一 个基因大小为2M，测序深度为10X，那么获得的总数据量为20M;
[0057]其检测方法中，所述基因 SNP位点对应PCR正向及反向引物序列如下：
[0061]其中，所述试剂盒包含以下试剂：
[0062] (1)、用于从所述样品DNA提取的试剂，包括:缓冲液GE、缓冲液GB、漂洗液PW、洗脱 液TB、吸附柱等；
[0063] (2)、利用所述引物对进行多重PCR反应的试剂，包括:PCR缓冲液、MgCl2、DNA聚合 酶、正向及反向引物等；
[0064] (3)、用于处理扩增产物以使得扩增产物能用于高通量测序技术中的试剂，包括： 磁珠、末端快速修复反应缓冲液、末端修复酶、快速连接缓冲液、连接酶、接头等。
[0065] 其中，所述D N A测序文库构建的接头如下：5'_ AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3 '（SEQ ID N0·25)和
[0066] 5 '-TGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3'(SEQ ID NO.26)；
[0067] 其中，NNNNNN:表示用于区分样本的序列，该序列为A、T、C和G随机组合的6碱基，根 据不同的组合方式确定不同的样本，主要有以下20种组合，用于区分20个样本ATCACG、 CGATGT、TTAGGC、TGACCA、ACAGTG、GCCAAT、CAGATC、ACTTGA、GATCAG、TAGCTT、GGCTAC、CTTGTA、 ACTACG、TTACGG、AGACTG、CATCGA、GATGCA、GCTACG、TCGGTA、TGACAC 〇
[0068] 所述测序文库构建的接头引物为：
[0069] 5，-AATGATACGGCGACCACC-3，（SEQIDN0.27#P
[0070] 5，-CAAGCAGAAGACGGCATA-3，（SEQ ID N0.28)。
[0071] 本发明的技术优点在于:通过高通量测序检测待测样本中MECP2、⑶KL5以及F0XG1 基因中热点SNP位点：（1 )、检测通量高，一次反应可以检测数个易感位点；（2)、灵敏度高； (3)、特异性强:针对特定SNP设计引物，获得MECP2、⑶KL5以及F0XG1基因特定位置附近的全 部碱基序列，特异性极强；（4)、操作简便且安全，整个体系不包含有毒有害物质，对试验人 员以及环境都无危害;而且本发明能够更迅速、更准确、更全面的得到关于RTT患者基因突 变的相关信息，以更加准确的辅助筛查、诊断Rett综合症。
【附图说明】
[0072] 图1是本发明的检测流程图。
【具体实施方式】
[0073]下面结合【附图说明】就【具体实施方式】，进一步阐明本发明，应理解这些实施方式仅 用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本 发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
[0074]为了理解本发明，下面对本发明进行进一步的详细说明。
[0075] 一种基于二代测序检测Rett综合症致病基因 SNP位点的试剂盒，所述试剂盒能够 一次性检测Rett综合症致病基因 MECP2、CDKL5以及F0XG1的共57个SNP位点，
[0076] 其中，所述MECP2的24个SNP位点：c.98dupA、c.316C>T、c.317G>A、c.378delT、 c.397C>T、c.401C>G、c.419C>T、c.423C>G、c.455C>G、c.468C>G、c.473C>T、c.502C>T、 c.582C>T、c.587C>G、c.590C>T、c.602C>T、c.608C>T、c.674C>G、c.695G>C、c.710delG、 c. 763C>T、c. 806de 1G、c. 808OT、c. 808de 1C，
[0077] 所述 CDKL5 的 18 个 SNP 位点：c.ll9C>T、c.l75C>T、c.l83delT、c.215T>A、c.352C>T、 c.380A>G、c.455G>T、c.464G>A、c.525A>T、c.532C>T、c.607G>T、c.ll96A>C、c.l311dupC、 c. 1648C>T、c. 1675C>T、c. 1708G>T、c. 2343delG、c. 25000T，
[0078] 所述F0XG1 的 15个SNP位点：c. 256C>T、c. 256dupC、c.460dupG、c.460dupG、 c.552dupC、c.577G>A、c.624C>G、c.643T>C、c.700T>C、c.730C>T、c.757A>G、c.765G>A、 c.969delC、c.1200C>G、c.1248C>G。
[0079] 其检测方法如下：
[0080] (一）、实验材料准备：
[00811 1、本实验涉及的样本来自10例Rett综合症病患和10例健康人的血液，样本采集 后，放入-80°C的冰箱中保存待用；
[0082] 2、涉及的相关试剂有：用于从所述样品DNA提取的试剂，如：缓冲液GE、缓冲液GB、 漂洗液PW、洗脱液TB、吸附柱等；
[0083] 利用所述引物对进行多重PCR反应的试剂，如:PCR缓冲液、MgCl 2、DNA聚合酶、正向 及反向引物等；
[0084] 用于处理扩增产物以使得扩增产物能用于高通量测序技术中的试剂，包括:磁珠、 末端快速修复反应缓冲液、末端修复酶、快速连接缓冲液、连接酶、接头等。
[0085] (二）、主要仪器：
[0086] 测序仪、PCR仪、离心机、漩涡震荡仪、冰箱、灭菌锅等；
[0087](三）、检测步骤：
[0088] 1、样品DNA提取：
[0089]抽取10例Rett综合症病患和10例健康人的血液样本各lml，共20例，将抽取的血液 样本分别置于20个1.5ml、加入抗凝剂的离心管中，后通过采用特异性结合DNA的离心吸附 柱系统对上述20个离心管分别进行血液样本DNA的提取，在20个离心管中分别得到20例含 有DNA的DNA溶液;再分别对上述20例分别提取完的DNA溶液中的DNA进行完整性、浓度及纯 度测定;通常情况下，测定过程中，如电泳条带无弥散，则证明所提取的DNA是完整的、未降 解的；另外，采用紫外分光光度计检测DNA的纯度和浓度，通常情况下，高纯度的DNA的OD 260/ 0D28Q应介于1.8~2.0之间，后将所测定过的、包含有完整的及未降解的DNA的DNA溶液放置 于-20°C的环境中备用。
[0090] 2、DNA模板多重PCR反应：
[0091] 在新的PCR管中加入如下试剂：提取好的DNA4.5ul、PCR缓冲液4ul、MgCl2l. 5ul、 DNA聚合酶1.5ul、ddH204ul、正向引物2.75ul和反向引物2.75ul，将上述混合物混匀后置于 PCR仪中进行多重PCR扩增，多重PCR扩增反应的步骤为:95°C反应3min，后95°C反应15s，后 60°C反应30s，最后72°C反应20s，上述反应从95°C反应3min到72°C反应20s共反应13个循 环，13个循环反应结束后即得:经过多重PCR反应的DNA溶液;所述经过多重PCR反应的DNA溶 液用于测序文库的构建；
[0092] 3、测序文库构建：
[0093] (1)、DNA 片段化：
[0094] 将上述经过多重PCR反应的DNA溶液放入超声波破碎仪中进行DNA的破碎，经过超 声波破碎仪破碎后的DNA变成150-400bp的小片段，即得到片段化的DNA;
[0095] (2)、DNA 末端修复：
[0096]将上述片段化的DNA进行5,末端以及3,末端的修复，再取新的PCR管，在新的PCR管 中配制加入如下试剂:片段化的DNA溶液2ul、末端快速修复反应缓冲液10ul、末端修复酶 3ul、10mMrATP10ul、ddH 20补足到50ul;使用移液器将上述混合溶液进行吹打，充分混匀上 述溶液后，将混合溶液置入PCR仪中进行下述温度反应：22°C反应lOmin，后再72°C反应 lOmin，上述反应结束后静置4°C保温，得到末端修复的DNA溶液；
[0097] (3)、接头连接：
[0098]在上述完成末端修复的DNA溶液的PCR管中接着加入以下试剂：快速连接缓冲液 l〇ul、连接酶2ul、接头2.5ul，得到的PCR管中溶液总体积为64.5ul;用移液器吹打上述混合 溶液，待混合溶液充分吹打混匀后，再将上述混合溶液置于PCR仪中进行下述温度反应:22 °C反应15min，最终得到连接了接头的DNA溶液；
[0099] (4)、连接产物纯化：
[0100] 1)、向上述已经得到的连接了接头的DNA的PCR管中继续加入35.5ul超纯水，使PCR 管中溶液体积增至lOOul，
[0101] 2)、再取90ul涡旋震荡混匀的磁珠至于上述PCR管中，用移液器将加入磁珠的混合 溶液吹打10次，充分混匀上述混合溶液;在18-25Γ的室温条件下，静置孵育5min，
[0102] 3)、5min后将PCR管置于离心机中离心10s，后将离心后的PCR管置于磁力架中，所 述磁力架对加入磁珠的混合溶液进行分离，分离后得到上层液相杂质及下层固相磁珠，移 液器移除上层液相杂质，
[0103] 4)、保持PCR管始终置于磁力架中，后于PCR管中加入200ul新鲜配制的80%乙醇， 用以漂洗混合溶液中的磁珠，漂洗结束后，将漂洗后的溶液置于18-25Γ的室温条件下，静 置孵育30s后，再次得到上层含有乙醇的液相杂质及下层被乙醇漂洗过的固相磁珠，移液器 移除上层的液相杂质，
[0104] 5)、完成上述步骤以后重复步骤4);
[0105] 6)、取出置于磁力架中的PCR管，将PCR管置于离心机中离心10s，此时PCR管中会有 残留液，移液器吸尽PCR管中残留液；
[0106] 7)、将PCR管从离心机中取出，再次置于磁力架中并保持PCR管始终置于磁力架中， 打开PCR管盖将被乙醇漂洗过的固相磁珠暴露于空气中直至磁珠干燥;时间为1 Omin;
[0107] 8)、10min后，将PCR管从磁力架中取出，将PCR管中加入25ul无菌超纯水洗脱吸附 于磁珠表层的DNA，使用移液器吹打无菌超纯水和DNA的混合溶液，充分混匀后，将PCR管置 于离心机中离心10s，后再放置于磁力架中，待混合溶液澄清后，得到上层无菌超纯水和DNA 的混合溶液及下层磁珠，移液器吸取上层无菌超纯水和DNA的混合溶液至新的PCR管中，所 得上层无菌超纯水和DNA的混合溶液即为连接接头的纯化DNA溶液，
[0108] (5)、PCR 富集：
[0109] 再取新的PCR管，在新的PCR管中加入如下反应试剂：连接接头的纯化DNA溶液 23ul、PCR反应混合液25ul、接头引物2ul，混合上述溶液，后用移液器吹打上述混合溶液，充 分混匀后，将上述PCR管放入PCR仪中进行温度反应，反应程序如下:98°C反应30s，后98°C反 应10s，后65°C反应30s，后72°C反应30s，上述反应中98°C反应30s需要一个循环，从98°C反 应10s，后65 °C反应30s，后72 °C反应30s共反应6-15个循环，最后再72 °C反应lmin-个循环， 最终得到富集的PCR产物；
[0110] (6)、PCR 产物纯化：
[0111] 将上述富集的PCR产物进行纯化，纯化步骤如下：
[0112] 1)、取45ul涡旋震荡混匀的磁珠至于上述PCR管中，用移液器将加入磁珠的混合溶 液吹打10次，充分混匀上述混合溶液;在18-25Γ的室温条件下，静置孵育5min，
[0113] 2)、5min后将PCR管置于离心机中离心10s，后将离心后的PCR管置于磁力架中，所 述磁力架对加入磁珠的混合溶液进行分离，分离后得到新的上层液相杂质及下层固相磁 珠，移液器移除上层液相杂质，
[0114] 3)、保持PCR管始终置于磁力架中，后于PCR管中加入200ul新鲜配制的80%乙醇， 用以漂洗混合溶液中的磁珠，漂洗结束后，将漂洗后的溶液置于18-25Γ的室温条件下，静 置孵育30s后，再次得到新的上层含有乙醇的液相杂质及下层被乙醇漂洗过的固相磁珠，移 液器移除上层的液相杂质，
[0115] 4)、为了充分漂洗去除磁珠混合溶液中的杂质，完成上述步骤以后再重复步骤3);
[0116] 5)、取出置于磁力架中的PCR管，将PCR管置于离心机中离心10s，此时PCR管中会有 残留液，移液器吸尽PCR管中残留液；
[0117] 6)、将PCR管从离心机中取出，再次置于磁力架中并保持PCR管始终置于磁力架中， 打开PCR管盖将被乙醇漂洗过的固相磁珠暴露于空气中直至磁珠干燥;时间为1 Omin;
[0118] 7)、lOmin后，将PCR管从磁力架中取出，将PCR管中加入25ul无菌超纯水洗脱吸附 于磁珠表层的DNA，使用移液器吹打无菌超纯水和DNA的混合溶液，充分混匀后，将PCR管置 于离心机中离心10s，后再放置于磁力架中，待混合溶液澄清后，得到上层无菌超纯水和DNA 的混合溶液及下层磁珠，移液器吸取上层无菌超纯水和DNA的混合溶液至新的PCR管中，得 到纯化的PCR产物，即为测序文库；
[0119] 4、测序文库质量检测：
[0120] 富集后的PCR产物在进行高通量测序之前需要进行质量检测，制备好的测序文库 可用琼脂糖凝胶电泳、全自动毛细管电泳系统检测测序文库中的片段长度分布范围；为了 得到高质量的测序结果，需要对测序文库进行精确定量，首先推荐使用实时荧光定量PCR (Real-time PCR)方法对测序文库进行绝对定量;此外，还可使用荧光染料法。制备好的测 序文库可用琼脂糖凝胶电泳、全自动毛细管电泳系统检测测序文库中的片段长度分布范 围。
[0121] 5、高通量测序：
[0122] 将制备好的测序文库置于高通量测序仪上进行测序，读长250BP，测序深度3000X， 每个样本产生90M的数据量，高通量测序完成以后对结果进行生物信息学分析;数据量等于 传统测序的3000次克隆测序的覆盖，测序的深度保证结果的准确性，可以测出比例非常低 的突变位点，为筛查辅助诊断RTT相关致病基因突变提供一种非常先进的方法。
[0123] 6、测序结果的生物信息学分析：
[0124] 测试数据处理分析包括测序数据的转换、拼接、质控和突变位点分析等过程，通过 数据的处理最终获得Rett综合症患者和健康人检测样本中相关基因 SNP位点的信息；参考 基因组hgl9是人类(Homo sapiens)标准参考基因组(GRCh37/hgl9)，是国际通用作为筛选 目标序列突变位点或SNP位点的参考基因序列，根据软件分析的结果，筛选出与参考基因组 hg 19不同的位点;通过比对设计的引物pane 1和位点信息，筛选出MECP2、⑶KL5以及F0XG1基 因上SNP位点（如下表所示）；结果显示本发明检测结果与临床检测结果一致，Rett综合症患 者在表中的热点SPN位点上有突变，而正常人群则没有；因此本发明可以较好地作为Rett综 合症早期发现和治疗的辅助手段。
[0125] 表:二代测序检测Rett综合症患者SPN位点突变结果
【主权项】
1. 一种基于二代测序检测Rett综合症致病基因 SNP位点的试剂盒，其特征在于，所述试 剂盒能够一次性检测Rett综合症致病基因 MECP2、CDKL5以及F0XG1的SNP位点， 其中，所述MECP2的24个SNP位点：c · 98dupA、c · 316C>T、c · 317G>A、c · 378delT、c · 3970 T、c.401C>G、c.419C>T、c.423C>G、c.455C>G、c.468C>G、c.473C>T、c.502C>T、c.582C>T、 c.587C>G、c.590C>T、c.602C>T、c.608C>T、c.674C>G、c.695G>C、c.710delG、c.763C>T、 c. 806de 1G、c. 808OT、c. 808de 1C; 所述 CDKL5的18 个 SNP 位点：c. 119C>T、c. 175C>T、c. 183delT、c.215T>A、c.352C>T、 c.380A>G、c.455G>T、c.464G>A、c.525A>T、c.532C>T、c.607G>T、c.ll96A>C、c.l311dupC、 c. 1648C>T、c. 1675C>T、c. 1708G>T、c. 2343delG、c. 25000T; 所述F0XG1 的 15个SNP位点：c · 256C>T、c · 256dupC、c · 460dupG、c · 460dupG、c · 552dupC、 c.577G>A、c.624C>G、c.643T>C、c.700T>C、c.730C>T、c.757A>G、c.765G>A、c.969delC、 c.1200C>G、c.1248C>G。2. -种权利要求1所述的一种基于二代测序检测Rett综合症致病基因 SNP位点的试剂 盒的检测方法，其特征在于，包括以下具体步骤： 2.1、 样品DNA提取： 抽取10例Rett综合症病患和10例健康人的血液样本各lml，共20例，将抽取的血液样本 分别置于20个1.5ml、加入抗凝剂的离心管中，后通过采用特异性结合DNA的离心吸附柱系 统进行血液样本DNA的提取，得到含有DNA的DNA溶液;提取完后再对DNA溶液中的DNA进行完 整性、浓度及纯度测定；后将所测定过的、包含有完整的及未降解的DNA的DNA溶液放置于-20°C的环境中备用； 2.2、 DNA模板多重PCR反应： 在新的PCR管中加入如下试剂:提取好的DNA溶液4.5ul、PCR缓冲液4ul、MgCl2l. 5ul、DNA 聚合酶1.5ul、ddH204ul、正向引物2.75ul和反向引物2.75ul，将上述混合物混匀后置于PCR 仪中进行多重PCR扩增，多重PCR扩增反应的步骤为:95 °C反应3min，后95 °C反应15s，后60 °C 反应30s，最后72°C反应20s，上述反应从95°C反应3min到72°C反应20s共反应13个循环，13 个循环反应结束后即得:经过多重PCR反应的DNA溶液;所述经过多重PCR反应的DNA溶液用 于测序文库的构建； 2.3、 测序文库构建： (1) 、DNA片段化： 将上述经过多重PCR反应的DNA溶液放入超声波破碎仪中进行DNA的破碎，经过超声波 破碎仪破碎后的DNA变成150-400bp的小片段，即得到片段化的DNA; (2) 、DNA末端修复： 将上述片段化的DNA进行5,末端以及3,末端的修复，再取新的PCR管，在新的PCR管中配 制加入如下试剂：片段化的DNA溶液2ul、末端快速修复反应缓冲液10ul、末端修复酶3ul、 10mMrATP10ul、ddH 20补足到50ul;使用移液器将上述混合溶液进行吹打，充分混匀上述溶 液后，将混合溶液置入PCR仪中进行下述温度反应:22°C反应lOmin，后再72°C反应lOmin，上 述反应结束后静置4°C保温，得到末端修复的DNA溶液； (3) 、接头连接： 在上述完成末端修复的DNA溶液的PCR管中接着加入以下试剂:快速连接缓冲液10ul、 连接酶2ul、接头2.5ul，得到的PCR管中溶液总体积为64.5ul;用移液器吹打上述混合溶液， 待混合溶液充分吹打混匀后，再将上述混合溶液置于PCR仪中进行下述温度反应:22°C反应 15min，最终得到连接了接头的DNA溶液； (4) 、连接产物纯化： 1) 、向上述已经得到的连接了接头的DNA的PCR管中继续加入35.5ul超纯水，使PCR管中 溶液体积增至l〇〇ul， 2) 、再取90ul涡旋震荡混匀的磁珠至于上述PCR管中，用移液器将加入磁珠的混合溶液 吹打10次，充分混匀上述混合溶液;在18-25Γ的室温条件下，静置孵育5min， 3) 、5min后将PCR管置于离心机中离心10s，后将离心后的PCR管置于磁力架中，所述磁 力架对加入磁珠的混合溶液进行分离，分离后得到上层液相杂质及下层固相磁珠，移液器 移除上层液相杂质， 4) 、保持PCR管始终置于磁力架中，后于PCR管中加入200ul新鲜配制的80%乙醇，用以 漂洗混合溶液中的磁珠，漂洗结束后，将漂洗后的溶液置于18-25Γ的室温条件下，静置孵 育 30s后，再次得到上层含有乙醇的液相杂质及下层被乙醇漂洗过的固相磁珠，移液器移除 上层的液相杂质， 5) 、完成上述步骤以后重复步骤4); 6) 、取出置于磁力架中的PCR管，将PCR管置于离心机中离心10s，此时PCR管中会有残留 液，移液器吸尽PCR管中残留液； 7) 、将PCR管从离心机中取出，再次置于磁力架中并保持PCR管始终置于磁力架中，打开 PCR管盖将被乙醇漂洗过的固相磁珠暴露于空气中直至磁珠干燥;时间为lOmin; 8) 、10min后，将PCR管从磁力架中取出，将PCR管中加入25ul无菌超纯水洗脱吸附于磁 珠表层的DNA，使用移液器吹打无菌超纯水和DNA的混合溶液，充分混匀后，将PCR管置于离 心机中离心l〇s，后再放置于磁力架中，待混合溶液澄清后，得到上层无菌超纯水和DNA的混 合溶液及下层磁珠，移液器吸取上层无菌超纯水和DNA的混合溶液至新的PCR管中，所得上 层无菌超纯水和DNA的混合溶液即为连接接头的纯化DNA溶液， (5) 、PCR 富集： 再取新的PCR管，在新的PCR管中加入如下反应试剂:连接接头的纯化DNA溶液23ul、PCR 反应混合液25ul、接头引物2ul，混合上述溶液，后用移液器吹打上述混合溶液，充分混匀 后，将上述PCR管放入PCR仪中进行温度反应，反应程序如下:98°C反应30s，后98°C反应10s， 后65°C反应30s，后72°C反应30s，上述反应中98°C反应30s需要一个循环，从98°C反应10s， 后65°C反应30s，后72°C反应30s共反应6-15个循环，最后再72°C反应lmin-个循环，最终得 到富集的PCR产物； (6) 、PCR产物纯化： 将上述富集的PCR产物进行纯化，纯化步骤如下： 1) 、取45ul涡旋震荡混匀的磁珠至于上述PCR管中，用移液器将加入磁珠的混合溶液吹 打10次，充分混匀上述混合溶液;在18-25Γ的室温条件下，静置孵育5min， 2) 、5min后将PCR管置于离心机中离心10s，后将离心后的PCR管置于磁力架中，所述磁 力架对加入磁珠的混合溶液进行分离，分离后得到新的上层液相杂质及下层固相磁珠，移 除上层液相杂质； 3) 、保持PCR管始终置于磁力架中，后于PCR管中加入200ul新鲜配制的80%乙醇，用以 漂洗混合溶液中的磁珠，漂洗结束后，将漂洗后的溶液置于18-25Γ的室温条件下，静置孵 育30s后，再次得到新的上层含有乙醇的液相杂质及下层被乙醇漂洗过的固相磁珠，移液器 移除上层含有乙醇的的液相杂质， 4) 、完成上述步骤以后再重复步骤3); 5) 、取出置于磁力架中的PCR管，将PCR管置于离心机中离心10s，此时PCR管中会有残留 液，移液器吸尽PCR管中残留液； 6) 、将PCR管从离心机中取出，再次置于磁力架中并保持PCR管始终置于磁力架中，打开 PCR管盖将被乙醇漂洗过的固相磁珠暴露于空气中直至磁珠干燥;时间为lOmin; 7) 、10min后，将PCR管从磁力架中取出，将PCR管中加入25ul无菌超纯水洗脱吸附于磁 珠表层的DNA，使用移液器吹打无菌超纯水和DNA的混合溶液，充分混匀后，将PCR管置于离 心机中离心l〇s，后再放置于磁力架中，待混合溶液澄清后，得到上层无菌超纯水和DNA的混 合溶液及下层磁珠，移液器吸取上层无菌超纯水和DNA的混合溶液至新的PCR管中，得到纯 化的PCR产物，即为测序文库； 2.4、 测序文库质量检测： 富集后的PCR产物在进行高通量测序之前需要进行质量检测，制备好的测序文库可用 琼脂糖凝胶电泳、全自动毛细管电泳系统检测测序文库中的片段长度分布范围； 2.5、 高通量测序： 将制备好的测序文库置于高通量测序仪上进行测序，读长250BP，测序深度3000X，每个 样本产生90M的数据量，高通量测序完成以后对结果进行生物信息学分析。3.-种权利要求2所述的一种基于二代测序检测Rett综合症致病基因 SNP位点的试剂 盒的检测方法，其特征在于，所述基因 SNP位点对应PCR正向及反向引物序列如下：4. 根据权利要求1所述的一种基于二代测序检测Rett综合症致病基因 SNP位点的试剂 盒，其特征在于，所述试剂盒包含以下试剂： (1) 、用于从所述样品DNA提取的试剂，包括:缓冲液GE、缓冲液GB、漂洗液PW、洗脱液TB、 吸附柱等； (2) 、利用所述引物对进行多重PCR反应的试剂，包括:PCR缓冲液、MgC 12、DNA聚合酶、正 向及反向引物等； (3) 、用于处理扩增产物以使得扩增产物能用于高通量测序技术中的试剂，包括:磁珠、 末端快速修复反应缓冲液、末端修复酶、快速连接缓冲液、连接酶、接头等。5. -种权利要求2所述的一种基于二代测序检测Rett综合症致病基因 SNP位点的试剂 盒的检测方法，其特征在于，所述测序文库构建的接头序列如下：5'_ AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3 '（SEQ ID NO·25)和 5 '-TGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3 ' (SEQ ID NO.26)。6. -种权利要求2所述的一种基于二代测序检测Rett综合症致病基因 SNP位点的试剂 盒的检测方法，其特征在于，所述测序文库构建的接头引物为： 5'-AATGATACGGCGACCACC-3'（SEQIDN0.27WP 5'-CAAGCAGAAGACGGCATA-3'（SEQ ID N0.28)。
【文档编号】C12Q1/68GK105950774SQ201610542608
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年7月11日
【发明人】曾骥孟, 蒙明慧, 许晓玲, 唐振洲, 胡鹏
【申请人】江苏医诺万细胞诊疗有限公司