高致病性猪繁殖与呼吸综合症特异性转移因子的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种高致病性猪繁殖与呼吸综合症特异性转移因子的制备方法，属于兽药【技术领域】。其包括下述步骤：（1）无菌采用经过高致病性猪繁殖与呼吸综合症病毒抗原免疫的猪的脾脏，去除被膜和结缔组织，冲洗，剪碎；（2）加入无菌生理盐水，用高速组织捣碎机绞碎，制成匀浆；（3）匀浆反复冻融8次后，于4℃下4000r/min离心15min，收取上清液；（4）将上清液置于透析袋内进行透析，收集透析外液，过滤除菌，加入冷冻保护剂，混合后分装，-20℃保存。本发明能够特异性提高猪繁殖与呼吸综合征疫苗的免疫效果，改善或增强猪的免疫功能和抗感染能力，具有预防和治疗猪繁殖与呼吸综合症，降低发病率和死亡率的作用。
【专利说明】高致病性猪繁殖与呼吸综合症特异性转移因子的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及兽药【技术领域】。
【背景技术】[0002]猪繁殖与呼吸综合症(porcinereproductive and respiratory syndromes,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)引起猪的一种以繁殖障碍和呼吸道症状为特征的急性接触性传染病，是严重危害我国养猪业的重要疫病之一。PRRSV在体内主要侵害单核/巨噬细胞，引起机体天然和特异性免疫功能抑制，因此PRRSV感染猪容易发生链球菌、猪支原体肺炎、猪圆环病毒2型、猪流感病毒等病原的继发感染，使危害更加严重。2006年以来，疫情在我国各地暴发流行，大量仔猪、母猪发病致死，给养猪行业造成巨大损失，农业部组织专家开展流行病学、病原学等科技攻关，最后证实疫情是由猪繁殖与呼吸综合症病毒变异株引起的一种高致病性传染病。这种高致病性猪繁殖与呼吸综合症发病和死亡率高，仔猪发病率达到100%、死亡率达50%以上，母猪流产率达30%以上，育肥猪死亡率20%-30%。
[0003]目前对PRRS没有有效治疗药物，免疫接种是预防该病的主要措施，但疫苗的免疫效果并不理想。因此，研发新的免疫增强剂和防治制剂具有重要意义。转移因子(transferfactor, TF)是由具有免疫活性的T淋巴细胞释放的一类可透析的、分子量为3-5 kDa小分子物质，是核酸和多肽相连且不含蛋白质的杂合分子，具有传递免疫信息、调节和增强机体免疫功能等作用，不仅能够提高受体的淋巴细胞转化率，增强白细胞吞噬能力和游走活性，促进抗体产生，而且对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌以及寄生虫等病原有明显抑制作用，已有用TF治疗结核病、疱疹病毒感染、肺包虫病等疾病的实验报道，而且受体在接受TF后能够快速(4-24 h)获得相应的细胞免疫功能，并可维持数月或更长时间。TF分子量小，无热原，无抗原性，不引起过敏反应，无明显毒副作用和种属差异，是一种新型、安全的免疫增强剂和免疫治疗制剂。根据免疫特性的不同，TF分为非特异性TF和特异性TF(specific TF, STF)两大类。STF是指采用某种特定抗原免疫或病原感染后的动物，再提取的含该抗原特异活性的转移因子。STF可将特异性免疫信息传递到受体动物，激发其特异性免疫，STF的保护作用高于非特异性TF。目前尚无高致病性PRRS特异性TF (PRRS-STF)供临床需要。
【发明内容】
[0004]本发明提供一种猪繁殖与呼吸综合症特异性转移因子的制备方法，能够特异性提高猪繁殖与呼吸综合征疫苗的免疫效果，改善或增强猪的免疫功能和抗感染能力，具有预防和治疗猪繁殖与呼吸综合症，降低发病率和死亡率的作用。
[0005]本发明所采取的技术方案是:
一种高致病性猪繁殖与呼吸综合症特异性转移因子的制备方法，包括下述步骤:
(I)无菌采取经过高致病性猪繁殖与呼吸综合症病毒抗原免疫猪的脾脏，去除脾脏的被膜和结缔组织，用生理盐水冲洗,称重,剪碎；
(2)按照其重量加入1.5-3倍的无菌生理盐水，用高速组织捣碎机2500 r/min绞碎，制成匀浆；
(3)匀浆_20°C冷冻和室温融化，反复冻融8次后，于41:下4000 r/min离心15 min,收取上清液；
(4)将上清液置于透析袋内，用无热源的等体积无菌生理盐水在0-4°C环境下透析36-48h，收集透析外液，用直径为0.22 的滤膜过滤除菌，加入冷冻保护剂，混匀，即得到高致病性猪繁殖与呼吸综合症特异性转移因子溶液，分装，-20 °C保存。
[0006]步骤(I)中抗原免疫过程为:将高致病性猪繁殖与呼吸综合症活毒疫苗用生理盐水稀释后，肌肉注射给2头3月龄健康猪，间隔2周免疫一次，首次注射2头份/头，第2-4次免疫4头份/头；第四次免疫10天后，前腔静脉采血，分离血清，经ELISA检测抗PRRSV抗体水平为阳性即合格。
[0007]高致病性猪繁殖与呼吸综合症活毒疫苗为JXAl-R毒株。高致病性猪繁殖与呼吸综合症活疫苗(JXAl-R毒株)安全性高，副作用小，抗体产生较快，抗体转阳率高，免疫效果好。
[0008]步骤(4)中透析袋孔径为7.0kD。
[0009]步骤(4)中采用蔗糖作为冷冻保护剂，特异性转移因子溶液中蔗糖的质量浓度为
3.4%。加入蔗糖保护剂对本发明的转移因子起到良好的保护作用，可以抑制在贮藏期内多肽的变性，从而保证转移因子的生物学活性。
[0010]采用上述技术方案所产生的有益效果在`于:
1.本发明的转移因子能够特异性提高猪繁殖与呼吸综合征疫苗的免疫效果，改善或增强猪的免疫功能和抗感染能力，具有预防和治疗猪繁殖与呼吸综合症，降低发病率和死亡率的作用。
[0011]2.本发明的转移因子采用活毒疫苗抗原免疫过的猪脾脏提取，抗原诱导的免疫应答反应全面，免疫效果明显高于灭活疫苗，转移因子的组成成分更加全面，为进一步研发PRRS疫苗免疫增强剂及免疫治疗制剂提供实验依据。
[0012]3.采用透析的方法进行转移因子的提取，制备方法更加便捷，成本低廉，能够有效阻止相关成分的丢失。
[0013]4.采用蔗糖作为冷冻保护剂能够阻止转移因子结构的改变，对冷冻及贮藏期内生物大分子的聚集和伸展，保证转移因子的生物学活性起显著作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明。
[0015]图1是本发明PRRSV-STF氨基酸组成的高效液相色谱分析图；
图2是本发明PRRSV-STF对小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬活性的影响示意图；
图3是本发明PRRSV-STF对小鼠外周血淋巴细胞增殖活性影响示意图；
图4是本发明PRRSV-STF对PRRS活疫苗免疫猪外周血淋巴细胞的增殖活性影响示意图。【具体实施方式】
[0016]以下实施例中，高致病性PRRS活疫苗(JXA1-R株)为吉林省元亨生物技术有限公司生产。3月龄健康猪(杜洛克X长白X大约克夏三元杂交)，均购自河北保定某规模化猪场，所购猪均没有接种过PRRS疫苗。
[0017]实施例1
(1)将高致病性PRRS活疫苗(JXAl-R毒株)疫苗用生理盐水稀释后，肌肉注射给2头3月龄健康猪，间隔2周免疫一次，首次注射2头份/头，第2-4次免疫4头份/头；第四次免疫10天后，前腔静脉采血，分离血清，经ELISA检测抗PRRSV抗体水平为阳性即合格。无菌采用经过猪繁殖与呼吸综合症抗原免疫的猪的脾脏，去除脾脏的被膜和结缔组织，用生理盐水冲洗,称重,剪碎；
(2)按照其重量加入1.5倍的无菌生理盐水，用高速组织捣碎机2500 r/min绞碎，制成匀浆；
(3)匀浆_20°C冷冻和室温融化，反复冻融8次后，于41:下4000 r/min离心15 min,收取上清液；
(4)将上清液置于孔径为7.0kD透析袋内，用无热源的等体积无菌生理盐水在0-4 °C环境下透析40h，收集透析外液，用直径为0.22 y m的滤膜过滤除菌，加入蔗糖作为冷冻保护剂，混匀，即得到高致病性猪繁殖与呼吸综合症特异性转移因子溶液，分装，-20 °C保存。特异性转移因子溶液中蔗糖的质量浓度为3.4%。
[0018]实施例2
(1)将高致病性PRRS活疫苗(JXAl-R`毒株)疫苗用生理盐水稀释后，肌肉注射给2头3月龄健康猪，间隔2周免疫一次，首次注射2头份/头，第2-4次免疫4头份/头；第四次免疫10天后，前腔静脉采血，分离血清，经ELISA检测抗PRRSV抗体水平为阳性即合格。无菌采用经过猪繁殖与呼吸综合症抗原免疫的猪的脾脏，去除脾脏的被膜和结缔组织，用生理盐水冲洗,称重,剪碎；
(2)按照其重量加入3倍的无菌生理盐水，用高速组织捣碎机2500r/min绞碎，制成匀
浆；
(3)匀浆_20°C冷冻和室温融化，反复冻融8次后，于41:下4000 r/min离心15 min,收取上清液；
(4)将上清液置于孔径为7.0kD透析袋内，用无热源的等体积无菌生理盐水在0-4 °C环境下透析48h，收集透析外液，用直径为0.22 y m的滤膜过滤除菌，加入蔗糖作为冷冻保护剂，混匀，即得到高致病性猪繁殖与呼吸综合症特异性转移因子溶液，分装，-20 °C保存。特异性转移因子溶液中蔗糖的质量浓度为3.4%。
[0019]实施例3
(1)将高致病性PRRS活疫苗(JXAl-R毒株)疫苗用生理盐水稀释后，肌肉注射给2头3月龄健康猪，间隔2周免疫一次，首次注射2头份/头，第2-4次免疫4头份/头；第四次免疫10天后，前腔静脉采血，分离血清，经ELISA检测抗PRRSV抗体水平为阳性即合格。无菌采用经过猪繁殖与呼吸综合症抗原免疫的猪的脾脏，去除脾脏的被膜和结缔组织，用生理盐水冲洗,称重,剪碎；
(2)按照其重量加入2倍的无菌生理盐水，用高速组织捣碎机2500r/min绞碎，制成匀浆；
(3)匀浆_20°C冷冻和室温融化，反复冻融8次后，于41:下4000 r/min离心15 min,收取上清液；
(4)将上清液置于孔径为7.0kD透析袋内，用无热源的等体积无菌生理盐水在0-4 °C环境下透析36h，收集透析外液，用直径为0.22 y m的滤膜过滤除菌，加入蔗糖作为冷冻保护剂，混匀，即得到高致病性猪繁殖与呼吸综合症特异性转移因子溶液，分装，-20 °C保存。特异性转移因子溶液中蔗糖的质量浓度为3.4%。
[0020]对本发明的转移因子PRRS-STF进行性能检测:
1.理化性质的检测
经检测，STF呈淡黄色的澄清液体，有微弱的腥味，pH值为6.44。与20%磺基水杨酸反应无沉淀生成，与茚三酮反应溶液呈蓝紫色，生理盐水对照显示茚三酮的颜色(淡黄色)；与硝酸和钥酸铵反应有黄色沉淀生成，生理盐水对照无沉淀生成；紫外分光光度计测定的OD260 ?和OD280 ?的平均值分别为0.43和0.155，两者的比值(0D26Q/0D28(l)为2.77，核酸的含量为21.5 mg/mL。上述结果表明，PRRSV-STF溶液内不含蛋白质，而含有核酸和氨基酸，与TF的理化性质相符。
[0021]2.PRRS-STF中氨基酸种类及其含量的测定取I mL样品加入9 mL 6.0mol/L的盐酸，110°C下水解14 h，冷却至室温；取水解液5 mL真空抽干，再加入0.1 mol/L的盐酸
1.0 mL溶解后，再经过氨基酸衍生后，用高效液相色谱仪(Agilent 1200)检测STF中的氨
基酸组成及其含量。
`[0022]经高效液相色谱仪(Agilent 1200)分析得知，PRRSV-STF含有18种水解氨基酸(见图1，其中I-18分别为天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、丝氨酸、精氨酸、甘氨酸、苏氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、酪氨酸、牛磺酸)，经计算得出18中氨基酸的含量(见表I)。其中谷氨酸的含量最高，为0.642 mg/mL，其次为非蛋白氨基酸一牛磺酸，含量为0.298 mg/mL，此后依次为甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸等，每mL中含氨基酸总量为3.479 mg。
[0023]表I高致病性PRRSV-STF的氨基酸种类及其含量
【权利要求】
1.一种高致病性猪繁殖与呼吸综合症特异性转移因子的制备方法，其特征在于其包括下述步骤: (1)无菌采取经过高致病性猪繁殖与呼吸综合症病毒抗原免疫猪的脾脏，去除脾脏的被膜和结缔组织，用生理盐水冲洗,称重,剪碎； (2)按照其重量加入1.5-3倍的无菌生理盐水，用高速组织捣碎机2500 r/min绞碎，制成匀浆； (3)匀浆-20°C冷冻和室温融化，反复冻融8次后，于41:下4000 r/min离心15 min,收取上清液； (4)将上清液置于透析袋内，用无热源的等体积无菌生理盐水在0-4°C环境下透析36-48h，收集透析外液，用直径为0.22 y m的滤膜过滤除菌，加入冷冻保护剂，混匀，即得到高致病性猪繁殖与呼吸综合症特异性转移因子溶液，分装，-20 °C保存。
2.根据权利要求1所述的高致病性猪繁殖与呼吸综合症特异性转移因子的制备方法，其特征在于步骤(I)中抗原免疫过程为:将高致病性猪繁殖与呼吸综合症活毒疫苗用生理盐水稀释后，肌肉注射给2头3月龄健康猪，间隔2周免疫一次，首次注射2头份/头，第2-4次免疫4头份/ 头；第四次免疫10天后，前腔静脉采血，分离血清，经ELISA检测抗PRRSV抗体水平为阳性即合格。
3.根据权利要求2所述的高致病性猪繁殖与呼吸综合症特异性转移因子的制备方法，其特征在于所述高致病性猪繁殖与呼吸综合症活毒疫苗为JXAl-R毒株。
4.根据权利要求1所述的高致病性猪繁殖与呼吸综合症特异性转移因子的制备方法，其特征在于步骤(4)中透析袋孔径为7.0kD。
5.根据权利要求1所述的高致病性猪繁殖与呼吸综合症特异性转移因子的制备方法，其特征在于步骤(4)中采用蔗糖作为冷冻保护剂，特异性转移因子溶液中蔗糖的质量浓度为 3.4%。
【文档编号】A61K39/12GK103446182SQ201310338679
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年8月6日 优先权日:2013年8月6日
【发明者】宋勤叶, 袁洪兴, 逯纪成, 陈桂清, 孙泰然 申请人:河北农业大学