一种生产猪细小病毒vp2蛋白的重组菌株的制作方法
【专利摘要】本发明的目的是提供一种生产猪细小病毒VP2蛋白的重组菌株，本发明提供的表达猪细小病毒VP2蛋白的巴斯德毕赤酵母菌X33?VP2，其保藏编号为CCTCC NO:M 2016098。本发明构建了带有猪细小病毒VP2蛋白基因的高效表达载体，获得了在毕赤酵母菌中的高效表达猪细小病毒VP2蛋白的重组菌株，该表达产物为可溶性蛋白。这为工业化生产猪细小病毒亚单位疫苗奠定了坚实的基础。CCTCC NO: M 201609820160309
【专利说明】
一种生产猪细小病毒VP2蛋白的重组菌株
技术领域
[0001] 本发明属于分子生物学和生物技术领域，特别涉及一种生产猪细小病毒VP2蛋白 的重组菌株及其应用。
【背景技术】
[0002] 猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)是引起母猪繁殖障碍的重要病原之一，可 导致母猪流产、早产、产死胎、木乃伊胎、弱仔及母猪不育和新生仔猪大量死亡。我国自20世 纪80年代后相继从各地分离到PPV，经调查发现一些猪群中该病的血清学阳性率可达85% 以上。PPV常呈隐性感染存在，尤其是低剂量持续感染的现象经常发生。该病毒除引起母猪 的繁殖障碍，还可与其他病原体协同作用引起多种疾病，给养猪业造成很大的经济损失。猪 细小病毒血清型单一、具有较高的免疫原性，疫苗接种是控制PPV感染的有效措施。
[0003]完整的病原体含有许多抗原，但并非所有抗原都能刺激宿主产生保护性应答。其 中某些抗原还能引起过敏，免疫抑制和其他副作用，这是使用完整的病原体做疫苗的缺陷。 并且目前国内应用的灭活苗生产制备抗原过程繁琐，而弱毒疫苗现也有接种疫苗发病情况 存在。而用亚单位疫苗则可以解决这个问题，尤其是这种疫苗除了具有抗原稳定性高，纯度 高，特异性强，敏感性高，不产生其他不相关抗体，免疫效果检测方法方便准确外，还十分易 于生产。不用动物体或是胚体生产，不会带有组织残留物，但安全性高。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种生产猪细小病毒VP2蛋白的重组菌株及其应用，为大规 模工业化生产中能生产出高效、安全、价廉的优良亚单位疫苗和诊断试剂服务。
[0005] 本发明提供的表达猪细小病毒VP2蛋白的巴斯德毕赤酵母菌X33_VP2(Pichia pastoris X33-VP2)，已经于2016年3月9日保藏于位于中国武汉、武汉大学的中国典型培养 物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:Μ 2016098。
[0006] 将上述猪细小病毒VP2蛋白基因克隆入带有高效表达Α0Χ启动子的毕赤酵母菌中， 在甲醇的作用下，猪细小病毒VP2蛋白获得高效表达。
[0007] 上述方法中所述的诱导剂为终浓度0.55%的甲醇，所生产的猪细小病毒VP2蛋白， 其分子量约为64kD。
[0008] 本发明构建了带有猪细小病毒VP2蛋白基因的高效表达载体，获得了在毕赤酵母 菌中的高效表达猪细小病毒VP2蛋白的重组菌株，该表达产物为可溶性蛋白。这为工业化生 产猪细小病毒亚单位疫苗奠定了坚实的基础。
【附图说明】
[0009] 图1是本发明实施例猪细小病毒VP2蛋白基因 PCR的扩增鉴定图，
[0010]图2是本发明的VP2蛋白的blast比较图；
[0011]图3是本发明实施例重组菌发酵诱导表达产物SDS-PAGE电泳检定图。
【具体实施方式】
[0012]下面结合附图对本发明的实施例进行具体说明。
[0013] 实施例1:猪细小病毒(PPV)VP2基因的筛选
[0014] 2010年在山东省多个养殖场出现了猪细小病毒病的症状，而发病个体猪之前已经 注射了已有的细小病毒疫苗，推测感染的病毒发生了变异；因此从发病个体中进行猪细小 病毒的筛选;最终筛选出了猪细小病毒PPV1。
[0015] 为验证筛选的病毒的抗原性，使用了包含筛选的PPV1毒株在内的5个不同来源的 病毒株作为抗原制备疫苗，免疫SPF猪后用筛选的病毒液进行攻毒实验，结果表明相比于其 它猪细小病毒疫苗，其本身制备的疫苗具有更好的免疫效果(P<〇.05)，因此确定其发生了 遗传上的变异。
[0016] 根据猪细小病毒VP2蛋白的抗原特性和氨基酸序列，设计合成一对引物，primer 1:5 ' -GCGGTACCATGTCTGAAAATGTTGAAGAAC-3 '，含ΚρηΙ位点；
[0017] primer 2:5'-GCGGCCGCCTAATATAATTTTCTTGGAAT-3'，含Notl位点。取PPV株病毒基 因作为模板，PCR扩增目的片段，产物回收连接PMD18-T载体，转化和筛选阳性克隆pMD18-T-VP2,经序列测定（图1为猪细小病毒VP2基因 PCR的扩增鉴定图）；其核苷酸序列为SEQ ID N0:2,编码的蛋白的序列为SEQ ID N0:1。与NCBI中公开的猪细小病毒VP2基因相比，最高的 同源性为96%;在存在579氨基酸的情况下，表明本发明的猪细小病毒VP2蛋白与已公开的 蛋白存在不少于23个氨基酸的差异(图2)。
[0018] 实施例2:重组猪细小病毒VP2蛋白的制备
[0019]包括以下步骤:a.构建表达载体;b.构建表达菌株;c .重组VP2蛋白的诱导和提取 纯化。具体如下:将阳性克隆质粒PMD18-T-VP2和表达载体pPICZa载体分别用ΚρηΙ和Notl双 酶切产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳后，用DNA凝胶回收试剂盒回收，分别获得约1.7kb和 3.3kb片段，在16°C定向连接构建pPICZa-VP2表达载体，经酶切鉴定正确后;将质粒线性化 后，电转化入毕赤酵母感受态细胞，构建毕赤酵母表达菌株X33-VP2，并提取表达菌株X33-VP2基因组，使用引物primer 1和primer 2进行PCR鉴定正确，于2016年3月9日保藏于中国 典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2016098;进行诱导表达，挑取含X33-VP2的单克 隆菌落接种于BMGY液体培养基，30 °C振荡培养过夜，离心收集菌体，用适量的BMMY悬浮后， 加入0.55 %甲醇，30°C诱导96小时。4°C，9000rpm离心5min，保留上清液，加入40%的硫酸铵 沉淀后，12000rpm离心5min收集蛋白沉淀，用PBS重溶蛋白。加入蛋白电泳上样缓冲液，沸水 煮8分钟后，用12%的分离胶进行SDS-PAGE鉴定（图3是重组菌发酵诱导表达产物的SDS-PAGE电泳检定图，图中1、2、为VP2蛋白表达产物沉淀，Μ为分子量标准蛋白质）。
[0020] 实施例3:疫苗的制备
[0021] 将生产猪细小病毒VP2蛋白的毕赤酵母表达菌株X33-VP2株保藏于中国典型培养 物保藏中心，保藏编号为CCTCC Μ 2016098。
[0022] 1.制苗用菌液的制备将X33-VP2菌种接种于含博莱霉素的ΥΗ)液体培养基中，30°C 振荡培养16~18小时。然后划线接种于加有博莱霉素的Yro固体培养基，选取典型菌落2~3 个混合于少量Yro液体培养基中，置30°C摇床中振荡培养18小时，定量分装，经纯粹检验后， 作为一级种子。取一级种子接种于BMGY液体培养基中，30°C振荡培养16~18小时，经镜检 后，置2~8°C保存，作为二级种子。
[0023] 2.制苗用蛋白的制备按发酵罐容积60% (V/V)加入BMGY不完全液体培养基，同时 按培养基〇. 1 % (V/ν)加入消泡剂，通入高温蒸汽灭菌30分钟，待培养基温度降至32°C，加入 YNB和生物素，接种猪细小病毒VP2蛋白生产用毕赤酵母X33-VP2二级种子液，发酵罐参数设 置分别为搅拌速度800r/min，温度30 °C，维持D0值(溶氧量)在20%。培养24小时后的菌液补 加甲醇，甲醇的补加速度为2ml/h/L诱导表达培养，按照以上发酵控制参数及工艺诱导表达 120小时；发酵培养菌液经管式离心机10000r/min离心30分钟，收获的上清，加入硫酸铵沉 淀蛋白后，按12000r/min离心30分钟收获沉淀，加入适量的生理盐水溶解蛋白沉淀。
[0024] 3.灭活将蛋白液置于灭活瓶内，计量加入10%甲醛溶液，随加随摇，使其充分混 合，甲醛溶液的最终浓度为0.1 %。加甲醛溶液后倒入另一灭活瓶中，以避免瓶口附近粘附 的病毒未能接触灭活剂。37°C灭活16小时后取出，置2~8°C保存。
[0025] 4.半成品检验
[0026] (1)无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验。
[0027] (2)蛋白含量测定按Bradf ord法检测蛋白含量。
[0028] (3)灭活检验将灭活后的蛋白液取少量接种YPD固体培养基，置于置30°C继续培养 72小时。观察无菌落生长，判灭活检验合格。
[0029]实施例2:亚单位灭活疫苗的制备
[0030] 经过检验合格后的半成品VP2蛋白抗原进行疫苗制备（以下配制中各液体成分按 体积比计）。
[0031] (1)油相制备取兽用白油95份，硬脂酸铝1份，置于油相制备罐中加热至80°C后，再 加司本一80 5份，至温度达到115°C时，维持30min，冷却后备用。
[0032] (2)水相制备将猪细小病毒VP2蛋白使用生理盐水稀释成150yg/0.1ml。取灭菌后 的5份吐温-80，加入配液罐中，同时加入制苗用蛋白液95份，搅拌20~30min，使吐温-80完 全溶解。
[0033] (3)乳化取油相2份放于高速剪切机内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水 相1份，以l〇〇〇〇r/min，乳化5分钟。乳化后，取10ml，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水 相应不超过0.5ml。
[0034] 实施例3、疫苗成品检验
[0035] (1)性状
[0036] 外观疫苗应为乳白色乳剂，无杂质并且外包装应合格。
[0037] 剂型为油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第1滴外，均应不扩 散。
[0038] 稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应 不超过0.5ml。
[0039]黏度按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。
[0040] (2)装量检查按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。
[0041 ] (3)无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。
[0042] (4)安全检验用50日龄仔猪5只，每只颈部皮下注射疫苗1.0ml，同时设对照5只，在 相同的条件下饲养，连续观察14日，记录试验猪采食、饮水及临床情况。应不出现由疫苗引 起的任何局部和全身不良反应。
[0043] (5)效力检验初产母猪5只，每只颈部皮下注射疫苗，0.5ml/只，另取5只同日龄初 产母猪作为不免疫作对照。母猪配种后，怀孕至38-40天时攻毒，结果从接种亚单位疫苗的 母猪的血浆中没有分离到病毒，而对照母猪的血浆中则分离到病毒。攻毒40天后宰杀，接种 母猪共怀65头胎猪，从它们的脏器中均没有分离到病毒，而对照母猪共怀60头胎猪，其中有 31头的脏器分离到病毒。结果表明，用猪细小病毒VP2蛋白亚单位疫苗免疫母猪能够抵抗病 毒的攻击，不出现临床症状，胎猪病毒分离均为阴性。对照组，出现轻微的临床症状，胎猪病 毒分离阳性率超过50%，表明猪细小病毒亚单位灭活疫苗能够提供有效的保护。
[0044] 对比实验表明，用目前市场上出售的猪细小病疫苗进行免疫，再用本发明筛选的 PPV1株进行攻毒实验;结果表明目前市场上出售的疫苗的免疫效果远低于本发明的VP2蛋 白疫苗的效果;推测是由于PPV1株的VP2蛋白疫苗发生变异导致目前疫苗的免疫效果不好。
【主权项】
1. 一种巴斯德毕赤酵母菌，其特征在于，所述的巴斯德毕赤酵母菌的保藏编号为CCTCC NO:M 2016098。2. 权利要求1所述的巴斯德毕赤酵母菌，其特征在于，所述的巴斯德毕赤酵母菌是将猪 细小病毒VP2蛋白基因克隆入带有高效表达AOX启动子的毕赤酵母菌中制备的。3. 如权利要求2所述的巴斯德毕赤酵母菌其特征在于，所述的猪细小病毒VP2蛋白基因 的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。4. 权利要求1所述的巴斯德毕赤酵母菌在重组表达猪细小病毒VP2蛋白中的应用。5. -种重组表达猪细小病毒VP2蛋白中的方法，其特征在于，所述的方法是将权利要求 1所述的巴斯德毕赤酵母菌在在甲醇的诱导作用下来重组表达猪细小病毒VP2蛋白。6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的甲醇添加的终浓度为0.55 %。
【文档编号】C12R1/84GK105950492SQ201610369589
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月28日
【发明人】刘新文, 范根成, 胡潇, 宫晓, 李陆梅, 刘蕾
【申请人】青岛易邦生物工程有限公司