降解苯酚的中度嗜盐菌及其高通量筛选方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种降解苯酚的中度嗜盐菌及其筛选方法和应用。
【背景技术】
[0002] 石油炼焦、医药、化工、印染、农药、煤炭加工等行业排放的废水中均含有大量的苯 酚。苯酚具有高毒性，因此含酚废水排放入受纳水体前必须去除。同时此类废水中又含有 大量的无机盐，增加了废水处理的难度，成为目前含酚废水处理的一个难题。
[0003] 生物法处理含酚废水具有一定效果，但高盐条件会使活性污泥代谢酶活性受阻， 致使有机物去除率降低。对于高盐含酚废水的生物处理来说，筛选一种苯酚降解菌，是提高 苯酚生物降解的关键，利用嗜盐菌可以有效处理高盐有机废水。
[0004] 中度嗜盐菌是一类广泛分布于高盐环境，能在3% - 15%NaCl下生长的极端微生 物，具有一定的降解能力，目前从高盐环境中分离出了许多中度嗜盐菌，然而，传统筛菌方 法单调繁琐，无法获得高降解能力的菌株，难以满足要求。
[0005] 传统的筛菌通常是平板涂布加上反复多次的划线分离，或者采用摇瓶或试管进行 筛选，筛菌工作单调重复，仅限于筛选几个环境样品。传统筛菌方法通常采用摇瓶或试管依 次培养有限个菌群，然后通过平板涂布和平板划线法分离纯化出单菌。虽然已有一些文献 报道采用传统筛菌方法从盐环境中分离出嗜盐or耐盐菌，例如IeilSoetal. (2007)从葡萄 牙的盐矿中分离出一株耐盐菌Penicilliumchrysogenum可以降解至少300mg/L的苯酸。 Arulazhaganetal. (2010)从来自印度的混合盐水样中筛选到了一个耐盐菌群。Haddadi andShavandi(2013)从伊朗被石油污染的土壤中分离出一株Halomonassp.strain PH2-2,在7%NaCl下，对400mg/L苯酚去除率达95%。但是传统筛菌方法单调繁琐，试剂 需耗量大，筛菌效率低从而导致只能处理有限个样品量。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种高效降解苯酚的中度嗜盐菌及其高通量筛选方法和应 用，以克服现有技术存在的缺陷，满足相关领域应用的需要。
[0007] 本发明所述的中度嗜盐菌Halomonassp.PH4-5是一种属于盐单胞菌属 (Halomonas)的菌种，其具有降解苯酸的能力，该菌种是从上海老港垃圾填埋场的矿化垃 圾中分离的，于2015年3月26日在中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心保藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为 CGMCC10666。分类命名为盐单胞菌；
[0008] 本发明的菌种，具有如下特性：
[0009] 在培养基上的生长状态：
[0010] 改进的LB培养基：蛋白胨5g/L，酵母膏2. 5g/L;氯化钠100g/L;琼脂粉I. 8g/ L(30°C，72h);
[0011] 菌落形状：圆形；
[0012] 菌落表面隆起：平滑、有光泽；
[0013] 大小：0? 5_lmm;
[0014] 色调：黄色。
[0015] 本发明的菌种的筛选方法，包括如下步骤：
[0016] (1)从被高盐及有机物污染的环境中，采集环境样品，所述的环境样品为土样或水 样；
[0017] 在血清瓶中，加入环境样品和培养基：
[0018] 所述的培养基中含有：
[0019] NaCl(100g/L),MgCl2 (0. 5g/L),KH2PO4 (0. 45g/L),K2HPO4 (0. 9g/L),NH4Cl(0. 3g/ L)，KCl(0? 3g/L)，苯酚（lOOmg/L)，酵母膏 0? 2g/L和微量元素（lg/L)，pH为 7. 0 ;
[0020] 表I微量元素成份
[0023] 血清瓶置于30°C，150rpm的条件下暗处培养，瓶子顶部空气作为氧气来源，转接 3-4次后，获得无沉淀物的菌群；
[0024] 转接：取5mL富集后的菌液转入新的血清瓶中，加入45mL新鲜的培养基，接种量为 10%〇
[0025] (2)将NaCl浓度分别为 3% (w/v)、5% (w/v)、8% (w/v)、10% (w/v)、12% (w/v) 和15% (w/v)置于48孔深孔板的深孔中，每孔中，含有苯酸和MSM，苯酸浓度为500mg/L， MSM浓度为ImL;
[0026] 准备6个48孔深孔板；
[0027] 将步骤（1)的培养物转接至48孔深孔板中，于30°C，200rpm培养72h;
[0028] (3)在上述相同培养条件下，转接三次后，采用基于4-氨基安替比林比色的96孔 酶标仪板分光光度法测定剩余苯酚浓度；
[0029] 比较在不同盐度下的苯酚降解特性，筛选出本发明所述的菌种；
[0030] 本发明分离获得菌种，可以采用如下的方法进行鉴定：
[0031] 用试剂盒提取（ABigen,Beijing,China)，16SrDNA基因；
[0032] 用弓I物 27F(5 '-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG- 3 ')和 1492R(5' -GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）扩增。
[0033] 50 1^反应体系含：2\卩〇?丁&9!1^25 1^，上游引物（10 11111〇1/1)11^，下游引 物（10ym〇l/l)lyL，DNA模板lyL，去核酸水22yL。PCR采用以下反应条件：94°C变性 5111；[11;94°(^变性1111；[11，54°(^退火308,72°(^延伸1111；[11，30个循环；然后72°(^10111；[11;降温至 4°C0PCR反应在MastercyleGradientthermalcycler(Eppendorf,Shanghai,China)进 行。PCR产物进行纯化（DNApurificationkit,ABigen,Beijing,China)后，根据制造商的 说明（TaKaRa,Dalian,China)片段连接至pMD19-Tvector体系。连接产物转化后，E.coli DH5a生长在Luria-Bertani(LB)培养基（含15g/L琼脂和100yg/L氨苄）上，于37°C 培养 12h。白色斑点通过引物M13-47(5'-CGCCAGGGTITTCCCAGTCACGAC-3')和 RV-M^-GAGCGGATAACAAITTCACACAGG-3^ )PCR验证。正确大小的插入片段进行测 序（BioSune，Shanghai,China)。16SrRNA基因序列用BLAST(http://blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast.cgi)软件分析，序列比对和系统发育分析用分子进化遗传学分析软件 MEGA5. 05 分析。
[0034] (1)细菌总DNA提取
[0035] 取纯菌培养液5mL，12000rpm离心2min，弃去上清液后用基因组DNA提取试剂盒 (ABigen,Beijing，China)，提取细菌基因组总DNA。试剂盒提取基因组DNA步骤：
[0036] 1 ?加入 480yL50mMEDTA混匀；
[0037] 2.加入120yL溶菌酶混勾，在37°C水浴锅中温育60min(每5min拿出来振荡一 下）；
[0038] 3. 12000rpm离心2min，弃上清后，加入600yL细胞核裂解液，颠倒混勾，在80°C 水浴锅中温育15min，冷却至室温；
[0039] 4.加入200yL蛋白沉淀后，在涡旋振荡器上高速连续振荡混匀25s，冰浴5min，再 12000rpm离心10min，此时管底可见一些白色沉淀；
[0040] 5.小心吸取上清至新的灭菌后的2mL离心管中（尽量多吸点）；再次离心2min后 取上清600yL至I. 5mL尖底离心管中；
[0041] 6.加入600yL室温异丙醇，轻柔颠倒30次以混匀直至出现丝状的白色DNA沉淀， 直接离心12000rpm2min，弃上清；
[0042] 7.加入0. 5mL70%乙醇，颠倒几次洗涤DNA，12000rpm离心Imin后马上迅速但 轻柔倒上清，横置在吸水纸上吸干残留乙醇；在洁净台上风扇吹干，一般Ih(闻不到酒精 味）；
[0043] 8.加入40yLddH20,轻弹管壁混匀，放置一会儿即可电泳。
[0044] ⑵1防rRNA基因扩增
[0045] 以上述提取的细菌总DNA为模板，以27F和1492R全长引物进行PCR扩增。
[0046] 27F:5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3';
[0047] 1492R：5, -GGTTACCTTGTTACGACTT-3r ；
[0048] PCR扩增的反应体系及条件见表2、表3。
[0049] 表2PCR扩增反应体系
[0050]
[0054] PCR扩增产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检查，110V28min后，用Goldview染色液 染色后凝胶成像系统照相。
[0055] (3)PCR扩增产物的纯化回收
[0056]PCR扩增产物用琼脂糖凝胶回收试剂盒（ABigen,Beijing,China)，按照说明书步 骤纯化。
[0057] 1.在长波紫外灯下，用干净在酒精灯火焰上灼烧的手术刀将所需回收的DNA琼脂 块切下，放入I. 5mL离心管中，称重；
[0058] 2?加入600yL的DD;
[0059] 3. 56°C水浴放置lOmin，每2min漩涡震荡一次加速琼脂块溶解；
[0060] 4.溶液加入吸附柱EC中，室温放置lmin，12000rpm离心45s，然后倒掉收集管中 的废液；
[0061] 5?加入700yL漂洗液WB，12000rpm离心30s，弃掉废液；再加入500yL漂洗液 WB，12000rpm离心30s，弃掉废液；
[0062] 6.将吸附柱EC放回空收集管中，12000rpm离心2min;
[0063] 7.取出吸附柱EC，放入干净的离心管中，在吸附膜中间部位加入50yL的洗脱缓 冲液EB，室温放置2min，12000rpm离心lmin。
[0064] 回收产物可用I%的琼脂糖凝胶电泳检查
[0065] (4)分子克隆
[0066] 1)细菌16SrRNAPCR产物的T/A克隆
[0067] 本实验使用的连接试剂盒购自TAKARA生物工程有限公司，载体为pMD-19T。
[0068] 细菌16SrRNAPCR产物的10yL连接反应体系为：PCR回收产物2yL，pMD-19T vectorIyL，ddH20 2yL，连接酶SolutionI5yL0
[0069] 预先将连接酶和载体置于冰上融化。按照连接体系依次加入上述组分于PCR管， 轻弹管壁使其混合均匀，短暂离心后置于4°C冰箱连接16h。
[0070] 2)连接产物转化
[0071] 本实验使用的E.coliDH5a感受态细胞来自上海宜腾有限公司，转化步骤如下：
[0072] 1.把100yL感受态细胞置于冰上5min后加入10yL连接液，冰上放置30min;
[0073] 2. 42°C水浴热激90s后迅速转到冰浴中，放置2min，注意过程中不要晃动；
[0074] 3.立即在超净工作台中，向每管中加入900yLLB培养基，37°