专利名称：：倍半萜青蒿萜酯ae及其提取纯化方法
技术领域：
：本发明涉及的是一种化工
技术领域：
的方法，更具体地，涉及一种倍半萜青蒿萜酯AE及其提取纯化方法。技术背景肿瘤(癌症)是全球范围内仅次于心血管疾病的第二大"杀手"。肿瘤药物研发的迫切，使得从植物源的天然产物中筛选抗肿瘤药物一直备受关注。青蒿为我国著名的传统中草药，具有清热，解暑，除蒸；治温病，暑热，骨蒸劳热，疟疾，痢疾，黄疸，疥疮，瘙痒。青蒿根能治劳热骨蒸、关节酸痛、大便下血；果实(青蒿子)能清热泪盈眶明目，杀虫。其产生的抗疟倍半萜青蒿素被世界卫生组织认定为21世纪替代奎宁的最有效的抗菌素疟疾药。二次开发青蒿资源，产生新的具有生物活性的物质，是进一步利用中草药，实现中药现代化的有利手段。利用发根快速生产的特征，大规模生产植物次级代谢物一直是植物细胞工程的常用技术；利用发根积累次级代谢产物的特点还可以用来发现植物本身低含量的次级代谢产物，从而完善植物的代谢谱，并且可以发现新的生物活性物质，使这些有用代谢物的大规模生产成为可能，并以此为模型研究植物的次级代谢调控规律。经过对现有技术的检索并未发现有关于从青蒿中提取倍半萜青蒿萜酯AE的报道。
发明内容本发明的主要目的在于克服现有技术的不足，提供一种倍半萜青蒿萜酯AE及其提取纯化方法。该制备方法简单、制备原料易得；同时由于该化合物具有明显的抗肿瘤活性，因此可以应用于化学预防和治疗肿瘤和开发相关抗肿瘤药物。本发明是通过以下技术方案实现的41.本发明所涉及的倍半萜青蒿萜酯AE((Z)-7-Acetoxy-methyl-11-methyl-3-methylene-dodeca-1，6，1O隱triene)具有如下化学结构2.本发明所涉及的倍半萜青蒿萜酯AE的提取纯化方法，具体步骤如下第一步、提取将青蒿发根粉碎，用20倍体积量的甲醇作为溶剂进行超声提取，超声2次，将提取液旋转蒸发，浓縮得到浸膏，通过乙酸乙酯和水双相分散，萃取分层，取上层乙酸乙酯有机相，浓縮至原体积的1/20时，用于下一步的柱层析；所述超声提取，每次持续时间为30分钟。第二步、分离在上述的萃取浓縮液中加入吸附剂，成固体粉末状，然后上硅胶柱进行柱层析，用石油醚和乙醚的混合洗脱液进行洗脱，然后进行薄层层析检测青蒿萜酯AE的存在，在硅胶板上以石油醚和乙醚的混合溶液作为展开剂，碘蒸显黄色条带，比移值(RF值)为0.88;按照薄层层析结果收集含所述倍半萜香豆素醚的组分，减压浓縮得到倍半萜青蒿萜酯AE的粗品；所述吸附剂为100到200目的硅胶。所述硅胶柱为100到200目，且规格为40X800mm的硅胶柱。所述石油醚和乙醚的混合洗脱液是指石油醚和乙醚的体积比为3:2的混合洗脱液。第三步、纯化将第二步中得到的粗品经ODSRP-C18反相柱进行分离和纯化，以甲醇和水的混合溶液作为流动相进行等梯度洗脱，制得倍半萜青蒿萜酯AE。所述分离和纯化的条件为色谱柱的规格为10X250mm;流动相的流速为3.6mL/min;检测波长为220nm。所述甲醇和水的混合溶液是指甲醇体积比例为90%，水的体积比例为10%的混合溶液。本发明制备方法简便、原料易得，为大规模工业自动化生产提供了可能。本发明的化合物倍半萜青蒿萜酯AE经流式细胞仪证实具有明显的抗肿瘤活性，可以应用于肿瘤的预防和治疗，如肺癌、卵巢癌、肝癌、子宫颈癌、高转移肺癌和胰腺癌中的一种或几种，可应用于化学预防和治疗肿瘤并开发相关抗肿瘤药物，对于开发相关抗肿瘤药物以及青蒿资源的二次开发均具有重要意义。图l倍半萜青蒿萜酯AE的制备液相色谱图。图2倍半萜青蒿萜酯AE对四个肿瘤细胞株和两株正常细胞的生长抑制示意图。图3倍半萜青蒿萜酯AE对H08910细胞周期的影响示意图；其中A为对照组的HO8910的细胞周期图；B为倍半萜青蒿萜酯AE处理的H08910的细胞周期图。图4倍半萜青蒿萜酯AE对H08910细胞形态的影响示意图；其中A为对照组细胞；B为倍半萜青蒿萜酯AE处理的细胞；C为喜树碱处理的细胞。具体实施方式以下结合附图对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1化合物倍半萜青蒿萜酯AE的分离提取将生长到稳定期的青蒿发根200g取出晒干后，用粉碎机粉碎，粉碎过的样品均需过60目筛。未能过筛部分再次粉碎或经研钵内研磨之后再过筛，直至全部样品过筛为止。以20倍量的甲醇浸泡样品粉末，过夜，超声两次，每次30min，注意控制6水温不超过5(TC。提取完毕后，过滤，取滤液，旋转蒸发后浓縮得棕色浸膏(55g左右)，再用乙酸乙酯和水双相萃取，取上层乙酸乙酯有机相，将有机相旋转蒸发减压浓縮至萃取体积的1/20时，加入吸附剂(硅胶100~200目)，成固体粉末状。然后上硅胶柱进行柱层析(硅胶100200目，硅胶柱规格40X800mm)，用石油醚乙醚(体积比5:1)洗脱。用TLC薄层检验青蒿萜酯AE的存在，在GF254的硅胶板上，以石油醚乙醚(体积比3:2)为展开剂，碘蒸显黄色条带，RF值0.88左右。按照TLC的结果，收集相应含倍半萜青蒿萜酯AE的组分(约在洗脱体积500580mL左右，前400mL为硅胶柱的死体积)减压浓縮，可得化合物青蒿萜酯AE粗品。再经ODSRP-C18反相柱进行分离和纯化，使用安捷伦1200制备液相色谱，分离条件为色谱柱大连依利特Hypersil0DS2，5pm，10X250mm流速3.6mL/min检测波长220nm流动相甲醇水=90:10(v/v)等梯度洗脱，目的产物青蒿萜酯AE出峰时间约为13.6min。得青蒿萜酯AE10.2mg左右。色谱图见图1。高分辨质谱得到该化合物的精密质量数为262.1935，推算其分子式为C17H2602。同时对所得到的青蒿萜酯AE进行结构表征，表1列出了由HSQC和HMBC得出的碳氢对应关系以及各碳氢信号的归属。结果如表1所示。表1青蒿萜酯AE的13CNMR和&NMR谱解析<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>由此可以推断出青蒿萜酯AE的结构为:实施例2细胞毒性实验实验所用细胞株为L02(人正常胎肝细胞)，HO8910(卵巢癌细胞)，QGY(人肝癌细胞株)，Hela(人子宫颈癌细胞)，95D(人高转移肺癌细胞)，HF(人原代成纤维细胞)均购自中国科学研究院上海细胞所。H08910，QGY，Hela，95D，L02，HF细胞均用RPMI1640培养基加10%胎牛血清常规培养传代。实验方法为国际通用的3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐比色法(MTT比色法)根据细胞生长速率，将处于对数生长期的肿瘤细胞以100|aL/孔接种于96孔培养板，接种密度为10000~20000/L，贴壁生长5~18h再加药lpl/孔。每个浓度设5个复孔。并设置相应浓度的溶媒对照以及无细胞调零孔。肿瘤细胞在37°C，5%0)2条件下培养24小时。加MTT，终浓度为50吗/ml。5%C02孵箱37'C孵育4小时后，酶标仪上测定570nm和630nm的吸光度值。计算抑制率。细胞抑制率=[1-(测试组0D平均值-空白组0D平均值)/(对照组0D平均值-空白组0D平均值)]X100呢结果化合物青蒿萜酯AE能够抑制肿瘤细胞HO8910,QGY，Hela，95D以及正常细胞HF和L02的生长，ICso见表2和附图7。由表1可知化合物青蒿萜酯AE对各个肿瘤细胞都有抑制作用，并且对正常细胞的抑制小于对肿瘤细胞的抑制，可以认为青蒿萜酯AE具有明显的抗肿瘤活性和选择性。表2青蒿萜酯AE对四个肿瘤细胞株和两株正常细胞的IC50(pg/mL)值细胞株HO8910QGYHela95DL02HFic50(pg/mL)14.36±0.6519.22±0.3921.33±1.3313.75±1.0930.27±2.0632.69±3.11实施例3细胞周期实验1.方法常规培养法培养HO8910细胞，给药，以等体积溶媒作为对照，24小时后收集细胞，用PBS洗两次后以70%酒精固定过夜。1000rpm/10min离心去乙醇，用含1%胎牛血清的PBS洗两次，再以含1。/。胎牛血清的PBS重悬，调整细胞浓度约1()S个/mL，加入无DNA酶的RNA酶，终浓度为100U/mL,37。C保温30min，加入PI，终浓度为50吗/mL，在暗中常温下反应30min，冰上放置20min后，进行流式细胞仪检测，每次记录30000个细胞。2.实验结果化合物青蒿萜酯AE在20(ig/mL,作用24小时后，可使HO8910停止在G2/M期，实验结果见表2以及附图2.表3青蒿萜酯AE对HO8910细胞周期的影响细胞株样品剂量(g/mL)时间(hr.)G0/G1%S%G2/腦H08910对照—2469.08±3.2627.08±1.893.84±2.57青蒿萜酯AE202470.14±1.5710.92±2.6918.94±2.93实施例4细胞形态学观察1.方法待细胞长至80%汇合，加入青蒿萜酯AE(20pg/mL)作用24h后，再加入0.25%胰蛋白酶消化细胞，制备单细胞悬液，调细胞浓度为107/mL，取细胞悬液25nL，加2nLAO染液(100ng/ml)及2pLEB染液(100吗/mL)，滴于载玻片，盖片封片后荧光显微镜直接观察，于20min内计数500个细胞。AO吖啶橙/EB双荧光染色法是一种鉴别细胞坏死和凋亡的简便方法。AO能够进入正常细胞膜的细胞中，与DNA结合显绿色/黄绿色荧光。早期凋亡细胞的细胞膜正常，胞浆浓縮，核DNA浓縮致密，低倍镜下呈荧光亢进的圆珠状小体，高倍镜下可见不规则的块状荧光。晚期凋亡细胞胞膜通透性破坏被EB染成红色，核形态与早期凋亡细胞相似，或为浓染的红色碎片(核碎裂)或凋亡小体。而细胞坏死时，细胞膜的完整性早期即被破坏，线粒体明显肿胀，细胞体积明显增大，呈不均匀的橙红色荧光。2.结果观察化合物对HO8910细胞形态学的影响，发现在20^g/mL对HO8910细胞能引起凋亡形态学变化，阳性药喜树碱(Sigma公司，c9911，7689-03-4)也能引起相似的凋亡形态学变化。实验结果见附图8。权利要求1、一种倍半萜青蒿萜酯AE，其特征在于，分子结构式如下2、一种倍半萜青蒿萜酯AE的制备方法，其特征在于，包括如下步骤第一步、提取将青蒿发根粉碎，用20倍体积量的甲醇作为溶剂进行超声提取，超声2次，将提取液旋转蒸发，浓縮得到浸膏，通过乙酸乙酯和水双相分散，萃取分层，取上层乙酸乙酯有机相，浓縮至原体积的1/20时，用于下一步的柱层析；第二步、分离在上述的萃取浓縮液中加入吸附剂，成固体粉末状，然后上硅胶柱进行柱层析，用石油醚和乙醚的混合洗脱液进行洗脱，然后进行薄层层析检测倍半萜青蒿萜酯AE的存在，在硅胶板上以石油醚和乙醚的混合溶液作为展开剂，碘蒸显黄色条带，RF值为0.88;按照薄层层析结果收集含所述倍半萜青蒿萜酯AE的组分，减压浓縮得到倍半萜青蒿萜酯AE的粗品；第三步、纯化将第二步中得到的粗品经ODSRP-C18反相柱进行分离和纯化，以甲醇和水的混合溶液作为流动相进行等梯度洗脱，制得倍半萜青蒿萜酯AE。3、根据权利要求2所述的倍半萜青蒿萜酯AE的制备方法，其特征是，第一步中所述超声提取，每次持续时间为30分钟。4、根据权利要求2所述的倍半萜青蒿萜酯AE的制备方法，其特征是，第二步中所述吸附剂为100到200目的硅胶。5、根据权利要求2所述的倍半萜青蒿萜酯AE的制备方法，其特征是，第二步中所述硅胶柱为100到200目，且规格为40X800腿的硅胶柱。6、根据权利要求2所述的倍半萜青蒿萜酯AE的制备方法，其特征是，第三步中所述石油醚和乙醚的混合洗脱液是指石油醚和乙醚的体积比为3:2的混合洗脱液。7、根据权利要求2所述的倍半萜青蒿萜酯AE的制备方法，其特征是，第三步中所述分离和纯化的条件为色谱柱的规格为IOX250mm;流动相的流速为3.6mL/min;检测波长为220nm。8、根据权利要求2所述的倍半萜青蒿萜酯AE的制备方法，其特征是，第三步中所述甲醇和水的混合溶液是指甲醇体积比例为90%，水的体积比例为10%的混合溶液。全文摘要本发明涉及一种化工
技术领域：
的倍半萜青蒿萜酯AE及其提取纯化方法，化合物的结构式如下式。该化合物采用如下方法制备将青蒿发根粉碎，用甲醇提取，将提取液浓缩得到浸膏，通过乙酸乙酯和水双相萃取分层，取上层乙酸乙酯有机相，浓缩后经硅胶柱层析，薄层层析检测，收集含青蒿萜酯AE的组分。本发明的制备方法简便、原料易得，同时体外实验证明该化合物具有抗肿瘤效果，可应用于化学预防和治疗肿瘤并开发相关抗肿瘤药物。文档编号A61P35/00GK101323569SQ20081004092公开日2008年12月17日申请日期2008年7月24日优先权日2008年7月24日发明者翟丹丹,钟建江申请人:上海交通大学