专利名称：一种仿生真皮及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及医疗外科修补材料，尤其涉及一种仿生真皮及其制备方法和用途。
背景技术：
皮肤被覆于全身表面，与外界环境直接接触，是解剖学和生理学上的重要边界器官。皮肤由表皮和真皮组成，借皮下组织与深部的深筋膜、腱膜或骨膜相连。皮肤起源于外胚层和中胚层，结构复杂并高度特化，有重要的屏障作用和保护作用，可防止外界的刺激损伤体内的组织，能阻挡异物和微生物侵入，并可阻止体液外渗和对外界物质的吸收。
皮肤作为人体最大的器官，是与外界接触的屏障，当由于外界损伤或疾病等因素造成皮肤缺损时，其危害可以极轻微，也可以是致命的。
目前，常用的皮肤缺损修复途径有自体植皮、同种异体植皮、异种植皮，但有供区不足、免疫排斥及传播疾病等缺陷。
目前还有一些皮肤的替代物是用中草药制成的，但缺乏正常皮肤真皮力学特性。
因此，本领域迫切需要提供一种理想的皮肤替代物，以满足临床需求。
发明内容
本发明旨在提供一种仿生真皮。
本发明的第二个目的是提供所述仿生真皮的制备方法。本发明的第三个目的是提供所述仿生真皮的用途。
在本发明的第一方面，提供了一种仿生真皮，所述的仿生真皮是生物相容性纤维的三维编织物，并且所述的纤维吸附有、吸收有或包裹有利于皮肤或真皮修复的正常皮肤和/或真皮组织细胞外基质成分的蛋白类物质和/或非蛋白类物质。
在另一优选例中，所述的三维编织物在x、 y和z三维方向的编织结构不相同。通过特殊的三维编织方法对真皮组织结构进行高度仿生，具有皮肤软组织的特性，如各向异性，粘弹性等。
在另一优选例中，所述的三维编织物是由3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10根生物相容性纤维编织而成。
在另一优选例中，含有正常皮肤和/或真皮组织细胞外基质成分的蛋白类物质和非蛋白类物质在由所述的生物相容性纤维加捻成的纤维纱上交替出现。
在另一优选例中，所述生物相容性纤维的直径为8—100微米。
在另一优选例中，所述编织物的孔径为30 — 2000um;较佳地，为50—1500um，更佳地为70 —1000y m。
在另一优选例中，所述编织物的厚度为0. 1 — 3. 2mm;较佳地，为0. 2 — 2. Omm,更佳地为0. 4—1. 6mm。
在另一优选例中，所述的利于皮肤或真皮修复的正常皮肤和/或真皮组织细胞外基质成分的蛋白类物质包括生长因子、蛋白多糖、糖蛋白、促进细胞和所述纤维发生粘附的蛋白分子，以及目前可能尚未发现的促生长因子和减少疤痕产生因子。
在另一优选例中，所述的可促进细胞和所述纤维发生粘附的蛋白分子包括正常皮肤和/或真皮组织细胞外基质成分，它们是粘连蛋白(FN)、胶原、非胶原糖蛋白、弹性蛋白、蛋白聚糖及目前可能尚未发现的一些促粘分子。
在另一优选例中，所述的非蛋白类物质选自聚乙二醇、氨基聚糖、多聚左旋赖氨酸-g-聚乙二醇。
在另一优选例中，所述的纤维是可吸收的生物相容性材料构成的纤维。
在本发明的第二方面，提供了一种如上述的仿生真皮的制备方法，它包括步
骤
(a)将吸附有、吸收有或包裹有利于皮肤或真皮修复的正常皮肤和/或真皮组织细胞外基质成分的蛋白类物质和/或非蛋白类物质的生物相容性纤维或纤维纱进行三维多向(3 — 10向)法编织得到如上述的仿生真皮；或
(l)将生物相容性纤维进行三维多向(3 — 10向)法编织后浸泡在含有正常皮
肤和/或真皮组织细胞外基质成分的蛋白类物质和/或非蛋白类物质中得到如上述的仿生真皮。
在另一优选例中，所述的三维生物相容性纤维有3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10在另一优选例中，所述的步骤(a)前包括步骤(a'):将吸附有、吸收有或包裹有利于皮肤或真皮修复的正常皮肤和/或真皮组织细胞外基质成分的蛋白类物质和/或非蛋白类物质的生物相容性纤维加捻成纤维纱(即进行辫子样编织)。
经过辫子样编织，则含不同蛋白成分的纤维和PEG纤维产生交织，然后拉紧，使得间隙小于30微米，大于细胞直径，则细胞不可能进入，而只可能与编织后的表面蛋白成分和PEG成分接触，这样形成桥墩的指导作用。
在另一优选例中，所述的步骤(a)是将吸附有、吸收有或包裹有利于皮肤或真皮修复的正常皮肤和/或真皮组织的细胞外基质成分的蛋白类物质和/或非蛋白类物质的生物相容性纤维或纤维纱进行三维多向(3 — 10向)法编织，再加角度联锁多层(至少三层)组织编织法进行编织得到如上述的仿生真皮。
在另一优选例中，步骤(l)中所述的生物相容性纤维上带有不同的化学基团，所述的化学基团包括疏水性的、亲水性的、带正电荷的、或带负电荷的。
在另一优选例中，所述的疏水性化学基团选自硫醇基、芳香醚；所述的亲水性化学基团选自氨基、羟基、羧基、磺酸基、醚基；所述的带正电荷的化学基团选自壳聚糖、氨基、胍基、咪唑基；所述的带负电荷的化学基团选自羧基。
在另一优选例中，所述的步骤(i)前包括步骤(r ):将生物相容性纤维加捻
成纤维纱(即进行辫子样编织)。
在另一优选例中，所述的步骤(l)是将生物相容性纤维进行三维多向(3 —10向)法编织，再加角度联锁多层(至少三层)组织编织法进行编织后浸泡在正常皮肤和/或真皮组织细胞外基质成分的蛋白类物质和/或非蛋白类物质中得到如上述的仿生真皮。
在本发明的第三方面，提供了一种如上述的仿生真皮在制备修复受损皮肤或真皮的移植物中的应用。
在另一优选例中，所述的移植物可减少瘢痕形成。
据此，本发明提供了一种理想的皮肤替代物，可以满足临床需求。
图l是桥墩样细胞黏附示意图；其中，A显示了单根纤维立体观，B显示了一束纤维平面观；A、 B两图中 深色为桥墩，包裹有FN，浅色为包裹有PEG。 图2是桥墩样细胞黏附设计其中，A显示了低倍(20倍)放大镜下观；B显示了高倍(60倍)放大镜 下观；C显示了相应结构的设计尺寸，C中各单元为设计的不同桥墩的长、宽、 间距。
图3是编织流程其中右下为编好的纤维，深色显示细胞附着点。
图4显示了编织效果图。
图5是电镜显示的编织效果图。
具体实施例方式
发明人经过广泛而深入的研究，研制了一种仿生真皮，它由微米级的生物 相容性纤维经过特殊的三维编织而成。本发明提供的仿生真皮的生物相容性纤 维上吸附有、吸收有或包裹有利于皮肤或真皮修复的蛋白类物质，进行移植后， 可形成桥墩样的细胞黏附状态，具有减少瘢痕形成的作用。
具体地，本发明首先将不同的单丝纤维(微米级生物相容性纤维)先浸润 在不同成分的蛋白分子溶液中，取出晾干，进行辫子样编织；然后采用三维多 向5向，或6向，或7向，或大于7向法进行编织，再加角度联锁多层(至少 三层)组织编织法进行编织；最后进行力学拉伸检测，符合皮肤本身特性后可 使用。
或者，本发明先将纤维(微米级生物相容性纤维)进行不同的化学、物理 处理，使它们成为具有不同疏水性、亲水性，或增加不同的化学基团、或使带 不同的正负电荷的不同纤维；然后进行三维多向5步(6、 7、以上)法，加角 度联锁多层(至少三层)组织编织法进行编织，经力学检测符合皮肤特性后备 用；最后根据不同的亲水、疏水性，或不同的化学基团，或正负电荷性质，浸 润在含有正常皮肤和/或真皮组织细胞外基质成分的的蛋白分子溶液中，进行 分子自组装，该不同成分的蛋白分子为真皮组织中所具有的不同蛋白成分，包 括各种生长因子等，取出晾干后使用。
定义如本文所用，"纤维"或"生物相容性纤维"都表示一种物质，它所用的 材料是生物可吸收的生物相容性材料，横截面的外径为60 — 300um，较佳地为 20—100um，更佳地为4一 13um;所述的生物可吸收的生物相容性材料选自
(i) 可降解性合成高分子材料，例如聚a-羟基酸(如聚乳酸PLA、聚羟基乙 酸PGA、聚羟基丁酸PHB等)、聚酸酐(polyanhydrides)、聚偶磷氮 (polyphosphazenes)、 聚氨基酸 (polyamino acid)、 假聚氨基酸 (pesudo—polyamino acid)、 聚原酸酉旨(polyorthoesters)、 聚酉旨尿院 (polyesterurethane)、聚碳酸酉旨(polycarbonate)、聚乙二醇、聚对二氧六环 酮(polydioxanone)等；
(ii) 天然可降解材料，例如胶原(collagen)、明胶(gelatin)、糖氨聚糖 (glycosaminoglycan， GAGs)、壳聚糖(chitosan)、甲壳素(chitin)、海藻酸 盐、藻酸钙凝胶等；各种脱细胞基质；
(iii) 可注射性材料，如Pluronic(—种市售的聚环氧乙丙烯商品)、藻酸 钙凝胶等；
(iv) 上述材料的混合物或复合材料，尤其是高分子材料与天然材料的复合 材料，以及固体材料与可注射性材料的复合材料。
如本文所用，"三维编织物"在x、 y和z三维方向的编织结构不相同。 它不是平面编织品的简单叠加，而是通过立体编织的方法使三维方向产生不同 结构的编结方式。可称为是"各向异性"的具有软组织生物力学特性的编织物。
如本文所用，"分子自组装"是指取正常皮肤组织进行匀浆，对其中成分 进行质谱分析，对蛋白分子进行鉴定，根据分析的结果指导我材料的支架的分 子接枝，接枝上相应的蛋白分子。
仿生真皮
如本文所用，"仿生真皮"是一种可用于皮肤或真皮修复的移植物。它由 微米级生物相容性纤维编结而成的编织物，所用的纤维至少为3根，较佳地为3 一7根，更佳地为5根；所用纤维上必须吸附有、吸收有或包裹有利于皮肤或真 皮修复的正常皮肤和/或真皮组织细胞外基质成分的蛋白类物质，和非蛋白类物 质，并且两种物质交替出现，呈桥墩样(见附图l)，桥墩长度为l一40um， 较佳地是2 — 20um;宽度为0.5—10um，，较佳地为1.5 — 5^m;桥墩间的间 距为l一20um，较佳地为2—10pm。更佳地，所说的桥墩大小和间距可是以下组合(1) 2x1.5，间距2pm; (2) 8x2，间距4nm; (3) 16x3，间距6)nm; (4) 2x2，间距4pm; (5) 8x3，间距6pm; (6) 16x2，间距4pm; (7) 20x3， 间距2)im;(8) 16x5，间距8pm;或其组合。
关于力的影响，该力指的是编织好的织物本身所具有的张力，该张力高度 模拟正常皮肤所具有的弹性模量，可用Ymmg，s弹性模量表示，该力学参数可在 3kPa-1000kPa之间选择。
吸附、吸收或包裹在纤维上的利于皮肤或真皮修复的正常皮肤和/或真皮组 织细胞外基质成分的蛋白类物质包括生长因子、蛋白多糖、糖蛋白、促进细 胞和所述纤维发生粘附的蛋白分子以及可能目前尚未发现的促生长因子和减 少疤痕形成因子。
吸附、吸收或包裹在纤维上的与细胞无黏附作用，作为与粘连细胞蛋白质 相间隔的的物质选自聚乙二醇、多聚左旋赖氨酸-聚乙二醇(PLL-g-PEG)。
制备方法
技术领域：
本发明提供的仿生真皮可由多种方法制得， 一种方法包括步骤先将不同 的单根纤维浸泡在含有不同蛋白分子成分的溶液中，所述的蛋白分子成分选自 正常皮肤和/或真皮组织细胞外基质成分如粘连蛋白、胶原、体外粘连蛋白、 透明质酸、非胶原糖蛋白、弹性蛋白、多配体蛋白聚糖、氨基聚糖、糖蛋白、 以及目前可能尚未发现的促生长因子和减少疤痕形成因子、聚乙二醇，取出晾 干后进行辫子样编织；然后进行三维多向5向、或6向、或7向、或大于7向 法进行编织，再进行加角度联锁多层(至少三层)组织编织法进行编织得到仿 生真皮。
本发明的另一种方法包括步骤先将不同的单根纤维分别进行不同的化 学、和/或物理处理，使不同的纤维具有不同的疏水性、亲水性，或使不同的 纤维增加不同的化学基团，或使不同的纤维带有不同的正负电荷；然后进行三 维多向5向、或6向、或7向、或大于7向法进行编织，再进行加角度联锁多 层(至少三层)组织编织法；最后根据纤维上不同的疏水性、亲水性，或不同 的化学基团，或不同的正负电荷性质，浸泡在含有正常皮肤和/或真皮组织细 胞外基质成分的蛋白分子溶液中，进行分子自组装，得到本发明提供的仿生真 皮。用途
本发明提供的仿生真皮可以用于制备修复受损皮肤的移植物；所述的移植 物可减少瘢痕形成。
根据创面大小，选择不同大小的真皮模板，将该真皮模板消毒后，创面局 部经适当处理后，进行移植，然后选取刃厚皮在其上进行移植，然后加压包扎。
本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书 所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可 以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明， 所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
本发明的主要优点在于
1、 本发明提供的仿生真皮具有正常皮肤真皮的力学特性，它具有各向异性 及易变形及具有粘弹性，蠕变，应力松弛的特点，这是目前无纺编织进行的组 织工程材料支架中所不具备的；
2、 本发明提供的仿生真皮具有稳定性特点，这也是目前组织工程皮肤支 架中采用无纺技术所不具备的；
3、 本发明提供的仿生真皮制备方法简便易行；
4、 本发明提供的仿生真皮有利于大规模工业化生产；
5、 本发明提供的仿生真皮成本低廉。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所 有的百分比和份数按重量计。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟 悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于 本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1 制备仿生真皮I
将正常组织皮肤进行脱细胞处理，然后制成匀浆。该正常组织中包含了各种我上述的各种细胞生长因子，蛋白多糖，糖蛋白、促进细胞和纤维黏附的蛋白分子 以及目前可能尚未发现的促生长因子和减少疤痕形成因子。
将不同纤维先进行三维多向(4、 5、 6、 7向)编织，再浸入上述的制备的匀 浆中，室温，30分钟后，取出，晾干。得到所述的真皮模板。面积可根据伤面面 积定。
然后将真皮模板植入创面，表面刃厚皮移植，加压包扎。
实施例2
制备仿生真皮II
将不同纤维3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11根分别浸入不同浓度的正常皮 肤和/或真皮组织细胞外基质成分匀浆液中，以及浸入PEG或PLL-g-PEG (lmg/ml)中，然后取出，晾干，进行不同组合，三根，或五根或七根，每组 组合中包含PEG或PLL-g-PEG，然后进行编辫子成纤维束，再将制成的纤维束 进行三维多向五向，七向编织，制成真皮模板(就是仿生真皮II)。面积可根 据伤面面积定。
然后将真皮模板植入创面，表面移植自体刃厚皮，加压包扎。
力学检测结果，根据瘢痕组织不同时期，增生性瘢痕早期，中期，晚期及 正常皮肤的弹性模量制备相应的真皮模板，然后进行力学检测，是否达到以上 标准。达到为合格，然后根据不同的弹性模量进行实验。
结构参数，厚度为真皮的厚度，1-1.5mm，孔径为30-100nm，层数是根据 厚度及纤维的直径来决定的。
实施例3
仿生真皮的动物实验
在该实施例中，利用动物实验进行测试，测试方法如下选择一定数量的 清洁杜烙克猪(购自上海斯莱克实验动物有限公司)，背部脱毛后24小时， 用手术刀在猪背部切取一定大小的全层皮肤，在鼓式取皮刀上反取刃厚皮，作 为自体皮。创面随机分为四组
组l创面为实验创面，止血后，先移植实施例1中制备的仿生真皮，然后 在其上移植自体皮，加压包扎；
组2创面为实验创面，止血后，先移植实施例2中制备的仿生真皮，然后在其上移植自体皮，加压包扎；
组3创面为对照创面，止血后，移植刃厚自体皮，加压包扎； 组4创面为对照创面，止血后，将该全层皮再移植到创面上，加压包扎。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术 内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任 何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相 同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。
权利要求
1.一种仿生真皮，其特征在于，所述的仿生真皮是生物相容性纤维的三维编织物，并且所述的纤维吸附有、吸收有或包裹有利于皮肤或真皮修复的正常皮肤和/或真皮组织细胞外基质成分的蛋白类物质和/或非蛋白类物质。
2. 如权利要求1所述的仿生真皮，其特征在于，所述的三维编织物是由3、 4、5、 6、 7、 8、 9或10根生物相容性纤维编织而成。
3. 如权利要求1所述的仿生真皮，其特征在于，正常皮肤和/或真皮组织细胞外基质成分的蛋白类物质和/或非蛋白类物质在由所述的生物相容性纤维加捻成的纤维纱上交替出现。
4. 一种如权利要求1所述的仿生真皮的制备方法，其特征在于，它包括步骤(a)将吸附有、吸收有或包裹有利于皮肤或真皮修复的正常皮肤和/或真皮组织细胞外基质成分的蛋白类物质和/或非蛋白类物质的生物相容性纤维或纤维纱进行三维多向(3 — 10向)法编织得到如权利要求1所述的仿生真皮；或(l)将生物相容性纤维进行三维多向(3 — 10向)法编织后浸泡在含有正常皮肤和/或真皮组织细胞外基质成分的蛋白类物质和/或非蛋白类物质中得到如权利要求l所述的仿生真皮。
5. 如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，在步骤(a)前包括步骤(a'):将吸附有、吸收有或包裹有利于皮肤或真皮修复的正常皮肤和/或真皮组织细胞外基质成分的蛋白类物质和/或非蛋白类物质的生物相容性纤维加捻成纤维纱。
6. 如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤(a)是将吸附有、吸收有或包裹有利于皮肤或真皮修复的正常皮肤和/或真皮组织细胞外基质成分的蛋白类物质和/或非蛋白类物质的生物相容性纤维或纤维纱进行三维多向(3 — 10向)法编织，再加角度联锁多层(至少三层)组织编织法进行编织得到如权利要求1所述的仿生真皮。
7. 如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(l)中所述的生物相容性纤维上带有不同的化学基团，所述的化学基团包括疏水性的、亲水性的、带正电荷的、或带负电荷的。
8. 如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，在步骤(l)前包括步骤(l'):将生物相容性纤维加捻成纤维纱。
9. 如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤(l)是将生物相容性纤维进行三维多向(3—10向)法编织，再加角度联锁多层(至少三层)组织编织法进行编织后浸泡在含有正常皮肤和/或真皮组织细胞外基质成分的蛋白类物质和/或非蛋白类物质中得到如权利要求1所述的仿生真皮。
10. —种如权利要求1所述的仿生真皮在制备修复受损皮肤或真皮的移植物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种仿生真皮，所述的移植物是生物相容性纤维的三维编织物，并且所述的纤维吸附有、吸收有或包裹有利于皮肤或真皮修复的正常皮肤和/或真皮组织细胞外基质成分物质。本发明还公开了上述仿生真皮的制备方法及其用途。
文档编号A61L27/00GK101628132SQ200810040668
公开日2010年1月20日 申请日期2008年7月17日 优先权日2008年7月17日
发明者姜育智, 陆树良 申请人:上海交通大学医学院附属瑞金医院