鉴定狂犬病、犬瘟热、传染性肝炎、细小病毒病、钩端螺旋体病和弓形体病病原的成套产品的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域中鉴定或辅助鉴定狂犬病、犬瘟热、传染性肝炎、细小病 毒病、钩端螺旋体病和弓形体病病原的成套广品。
【背景技术】
[0002] 随着我国对外交流日益增多，出现旅客携带伴侣犬的出入境数量及种类不断增 加；观赏犬、伴侣犬、工作犬以及实验用犬的国际贸易近年来发展迅速，我国举办各种国际 犬业会展和比赛越来越频繁。同时，由于我国拥有世界最大的皮毛成衣出口基地一一香港， 对于我国大陆的皮毛供应提出了更大需求。尤其是乌苏里貉、白貉、银狐、彩狐、蓝狐和水貂 等毛皮动物及其毛皮产品，近年来有大量进口。
[0003] 犬、狐、絡和紹不但可以携带危害犬类健康的病原体，也能携带传播多种人畜共患 病；可携带传播的疾病有狂犬病、犬瘟热、传染性肝炎和细小病毒病、钩端螺旋体病、弓形体 病等。其中狂犬病、钩端螺旋体病和弓形体病是人畜共患疾病，严重威胁人类健康；犬瘟热、 犬传染性肝炎和犬细小病毒病不但危害犬、狐、貉和貂的健康，还是虎、豹和熊猫等野生动 物的主要传染病。特别是犬，为人类的亲密接触动物，加之动物可能来自不同的国家和地 区，疫情复杂，如不对出入境犬进行严格检疫，很有可能造成疫病传入传出国境，威胁人类 健康及动物卫生。
[0004] 狂犬病是由狂犬病病毒（Rabiesvirus，RV)引起的一种专门侵犯中枢神经系统的 人兽共患传染病，人发病后死亡率高达100%。据报道，全世界每年估计因狂犬病导致死亡 的人数为4万-7万，这些病例绝大多数发生在发展中国家，其中98%在亚洲。我国是狂犬 病的高发地区，人的狂犬病病死数位居世界第二，仅次于印度。据国家疾病控制中心发布的 疫情报告，自2002年以来每年因该病死亡的人数均超过2000人，这些数据突显出狂犬病对 公共卫生安全有严重的威胁。
[0005] 弓形虫病（Toxoplasmosis)是由刚地弓形虫（Toxoplasma gondii，Tox)引起的一 种重要的机会感染性寄生虫病，该疾病对人类特别是孕妇和胎儿具有严重的危害。
[0006] 钩端螺旋体病（Leptospirosis，钩体病）是世界范围内广泛存在的热带病，尤其 在湿热的热带和亚热带地区较为流行。致病性钩端螺旋体（Pathogenic Leptospira)通过 粘膜或者伤口感染宿主后，迅速进入血流并扩散到肺、肝、肾及其他组织器官。不同致病性 钩体感染宿主的临床症状复杂，包括眼结膜充血，腹泻，黄疽，肾衰和脑膜炎等。
[0007] 犬瘟热（Canine distemper, CD)是犬瘟热病毒（Canine distemper virus, CDV)弓丨 起的一种急性、热性、高度接触性传染病。犬瘟热呈世界性分布，该病发病急、传播速度快、 宿主广泛、病毒感染力强、死亡率在30-80%，因此常带来毁灭性损失，是养殖业重要传染病 之一。调查显示只要有经济动物养殖的地方均有过本病的发生。
[0008] 犬传染性肝炎（Infectious canine hepatitis，ICH)是由犬传染性肝炎病毒 (Infectious canine hepatitis virus，ICHV)引起的一种常见的急性败血性传染病。本 病多发生于1岁以内的幼犬，死亡率高达40%。
[0009] 犬细小病毒病是犬的一种具有高度接触性传染的烈性传染病。临床上以急性出血 性肠炎和心肌炎为特征。犬细小病毒（Canine parvovirus, CPV)，是引起犬出血性肠炎和幼 犬心肌炎的主要病原，具有高度的接触传染性。犬出血性肠炎和幼犬心肌炎的发病率和病 死率分别为20% -100%和10% -50%，给全球的养犬业造成很大的经济损失。
[0010] 因此，目前迫切需要对狂犬病病毒（Rabiesvirus，RV)、刚地弓形虫（Toxoplasma gondi i，Tox)、钩端螺旋体（Pathogenic Leptospira)、犬瘟热病毒（Canine distemper virus, CDV)、犬传染性肝炎病毒（Infectious canine hepatitis virus，ICHV)和犬细小病 毒（Canine parvovirus, CPV)这些病原的严格快速的检疫。
【发明内容】
[0011] 本发明所要解决的技术问题是提高检测狂犬病、犬瘟热、传染性肝炎、细小病毒 病、钩端螺旋体病和弓形体病病原这六种病原的特异性、灵敏度、准确性，并实现高通量检 测。
[0012] 为解决上述技术问题，本发明提供了鉴定或辅助鉴定病原的PCR引物对组合物。
[0013] 本发明所提供的鉴定或辅助鉴定病原的PCR引物对组合物，由名称为rv的鉴定或 辅助鉴定狂犬病病毒的PCR引物对、名称为tox的鉴定或辅助鉴定弓形虫的PCR引物对、名 称为Iep的鉴定或辅助鉴定钩端螺旋体的PCR引物对、名称为cdv的鉴定或辅助鉴定犬瘟 热病毒的PCR引物对、名称为ichv的鉴定或辅助鉴定犬传染性肝炎病毒的PCR引物对和名 称为cpv的鉴定或辅助鉴定犬细小病毒的PCR引物对组成；
[0014] 所述rv由序列表中SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示的两条单链DNA组成；
[0015] 所述tox由序列表中SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5所示的两条单链DNA组成；
[0016] 所述1印由序列表中SEQ ID No. 7和SEQ ID No. 8所示的两条单链DNA组成；
[0017] 所述cdv由序列表中SEQ ID No. 10和SEQ ID No. 11所示的两条单链DNA组成；
[0018] 所述ichv由序列表中SEQ ID No. 13和SEQ ID No. 14所示的两条单链DNA组成；
[0019] 所述cpv由序列表中SEQ ID No. 16和SEQ ID No. 17所示的两条单链DNA组成；
[0020] 所述病原为狂犬病病毒、弓形虫、钩端螺旋体、犬瘟热病毒、犬传染性肝炎病毒和 犬细小病毒这六种病原中的六种、五种、四种、三种、两种或一种。
[0021] 其中，SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示的两条单链DNA组成的引物对名称为rv， 可从狂犬病病毒（Rabiesvirus，RV)的总RNA中进行RT-PCR扩增得到272bp的DNA片段， SEQ ID No. 1由19个核苷酸组成，SEQ ID No. 2由20个核苷酸组成；
[0022] SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示的两条单链DNA组成的引物对名称为tox，可从 刚地弓形虫（Toxoplasma gondii，Tox)的基因组DNA中进行PCR扩增得到189bp的DNA片 段，SEQ ID No. 4由18个核苷酸组成，SEQ ID No. 5由18个核苷酸组成；
[0023] SEQ ID No. 7和SEQ ID No. 8所示的两条单链DNA组成的引物对名称为1印，可从 钩端螺旋体（Pathogenic Leptospira)的基因组DNA中进行PCR扩增得到146bp的DNA片 段，SEQ ID No. 7由18个核苷酸组成，SEQ ID No. 8由18个核苷酸组成；
[0024] SEQ ID No. 10和SEQ ID No. 11所示的两条单链DNA组成的引物对名称为cdv，可 从犬瘟热病毒（Canine distemper virus, (DV)的总RNA中进行RT-PCR扩增得到218bp的 DNA片段，SEQ ID No. 10由18个核苷酸组成，SEQ ID No. 11由18个核苷酸组成；
[0025] SEQ ID No. 13和SEQ ID No. 14所示的两条单链DNA组成的引物对名称为ichv， 可从犬传染性肝炎病毒（Infectious canine hepatitis virus，ICHV)的基因组DNA中进 行PCR扩增得到258bp的DNA片段，SEQ ID No. 13由18个核苷酸组成，SEQ ID No. 14由 18个核苷酸组成；
[0026] SEQ ID No. 16和SEQ ID No. 17所示的两条单链DNA组成的引物对名称为cpv，可 从犬细小病毒（Canine parvovirus, CPV)的基因组DNA中进行PCR扩增得到175bp的DNA 片段，SEQ ID No. 16由18个核苷酸组成，SEQ ID No. 17由18个核苷酸组成。
[0027] 上述鉴定或辅助鉴定病原的PCR引物对组合物中，所述rv、所述tox、所述lep、所 述cdv、所述ichv和所述cpv均可独立包装。
[0028] 上述鉴定或辅助鉴定病原的PCR引物对组合物中，所述rv、所述tox、所述lep、所 述cdv、所述ichv和所述cpv的两条单链DNA均可独立包装。
[0029] 上述鉴定或辅助鉴定病原的PCR引物对组合物中，所述rv、所述tox、所述lep、所 述cdv、所述ichv和所述cpv的两条单链DNA均可用生物素标记。
[0030] 上述鉴定或辅助鉴定病原的PCR引物对组合物中，所述rv、所述tox、所述lep、所 述cdv、所述ichv和所述cpv的两条单链DNA均可在其5'端用生物素标记。
[0031] 上述鉴定或辅助鉴定病原的PCR引物对组合物中，所述rv和所述cdv可以单独 使用，分别进行单独的RT-PCR，也可以组合使用进行多重RT-PCR ;所述tox、所述1印、所述 ichv和所述cpv这四种引物对可以单独使用分别进行单独的PCR，也可以组合使用进行多 重PCR。这四种引物对组合使用的方式有多种，可以是其中任两种引物对组合在一起使用， 也可以是其中任三种引物对组合在一起使用，也可以是四种引物对组合在一起使用。
[0032] 这六种引物对单独使用时，本申请的鉴定或辅助鉴定病原的PCR引物对组合物中 这六种引物对的配比没有要求，可以根据待鉴定病原的数量确定。
[0033] 所述rv和所述cdv组合使用时，组合在一起使用的各引物对的摩尔数相同。如这 两种引物对组合在一起使用时，其摩尔比为1 :1。所述t〇x、所述lep、所述ichv和所述cpv 这四种引物对组合使用时，组合在一起使用的各引物对的摩尔数相同。如这四种引物对组 合在一起使用时，所述四种引物对的摩尔比为1 :1 :1 :1。
[0034] 本申请中，每种引物对中的两条单链DNA的摩尔比均为1 :1。
[0035] 上述鉴定或辅助鉴定病原的PCR引物对组合物中，所述鉴定或辅助鉴定病原的 PCR引物对组合物，由所述rv、所述tox、所述lep、所述cdv、所述ichv和所述cpv这六种 PCR引物对中的五种、四种、三种、两种或一种组成；
[0036] 所述病原为狂犬病病毒、弓形虫、钩端螺旋体、犬瘟热病毒、犬传染性肝炎病毒和 犬细小病毒这六种病原中的六种、五种、四种、三种、两种或一种。
[0037] 为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定病原的成套试剂。
[0038] 本发明所提供的鉴定或辅助鉴定病原的成套试剂，由名称为CRV的鉴定或辅助鉴 定狂犬病病毒的引物探针组合物、名称为CTox的鉴定或辅助鉴定弓形虫的引物探针组合 物、名称为CLep的鉴定或辅助鉴定钩端螺旋体的引物探针组合物、名称为CCDV的鉴定或辅 助鉴定犬瘟热病毒的引物探针组合物、名称为CICHV的鉴定或辅助鉴定犬传染性肝炎病毒 的引物探针组合物和名称为CCPV的鉴定或辅助鉴定犬细小病毒的引物探针组合物组成；
[0039] 所述CRV