专利名称：：伪狂犬病病毒sa215和伪狂犬病毒多基因缺失疫苗及其制备方法
技术领域：
：-本发明属于动物病毒学及基因工程学
技术领域：
，涉及缺失伪狂犬病病毒闽A株.的部分毒力基因的伪狂犬病病毒，并用所述病毒制备成疫苗的方法。背翬技术伪狂犬病(/^6"￡/0/^^'6&PR)是由疱疹病毒科，a-疱疹病毒亚科的伪狂犬病病毒(/^ei;oferaWesWtyas，PRV)引起的多种家畜和野生动物的以发热、奇痒及脑脊髓炎为主要症状的一种急性传染病。猪是本病的原发感染宿主，又是病毒的长期储存和排毒者。该病的发生和流行有两大主要特点即以神经症状为主的两周龄内仔猪大批量发病、死亡和以母源性繁殖障碍为特点的生产母猪流产、死胎和木乃伊胎或者产出弱胎和死胎。目前，该病在世界上分布广泛，并有不断蔓延扩大的趋势。据专家估计，其己成为仅次于口蹄疫和猪瘟的危害养猪业的重要疫病。本病在美国、日本、前苏联及欧洲的一些国家被列为重点防制的猪病之一。疫苗接种是防制伪狂犬病的重要手段之一。应用的常规疫苗有两类，即弱毒疫苗和灭活苗，两者在临床应用时均有缺陷。灭活苗虽然安全，但它具有免疫效力不佳、接种剂量较大，而且在接种24小时后偶尔出现过敏反应等缺陷。一次接种产生的免疫持续时间明显短于二次接种，因此需要进行二次免疫接种。这给防疫工作带来诸多不便。在弱毒苗方面，各国培育的弱毒苗品系很多，最常用的为Bartha株、Bucharest株。弱毒苗免疫原性好，但在接种后虽然能预防临床症状的出现，但不能防止强毒在被感染动物体内复制、排出和形成潜伏感染。因此，被接种猪仍可能是潜在传染源，并可能发生复发性感染。这是尽管使用了伪狂犬病常规疫苗，该病仍对养猪业生产产生深远的影响的原因。许多国家对伪狂犬病采取了严格的控制政策。为保证伪狂犬病消除措施的施行，需要接种比常规疫苗更有效的疫苗，此外，使用这些疫苗后，应保证采取血清学方法能鉴别开来接种猪和野毒感染猪。随着现代分子生物学的发展，通过在分子水平上对伪狂犬病病毒基因组的研究，导致兽医疫苗领域发生了一场革命。当前接种常用的伪狂犬病疫苗是通过基因操作，对病毒生长所非必需的且与毒力有关的基因如TK,gE(gl),gl(gp63),gG(gX),gc(gin)进行缺失而获得的基因缺失疫苗(标志疫苗)。伪狂犬病基因缺失疫苗有以下优点而被广泛接受(1)由于伪狂犬病基因缺失疫苗都缺失了目的基因的几百甚至几千个碱基，缺失区域明确，缺失片段大，所以它们返祖的可能性极小。(2)伪狂犬病基因缺失株都缺失一个或几个影响毒力的基因，所以对鼠、猪无毒力或仅有相当低的毒力。且大多数的伪狂犬病基因缺失株都有较强的免疫原性，免疫动物都获得了较强的保护力。攻毒后，免疫猪不出现伪狂犬病临床症状，猪排毒时间大大缩短，排毒量大为降低。(3)大多数伪狂犬病基因缺失株在体内复制和扩散能力大大减弱，不能侵入中枢神经系统，很难形成潜伏感染。且其在三叉神经节的预先定殖能阻止强毒侵入中枢神经组织，也使强毒很难在中枢神经组织形成潜伏。(4)可以把缺失基因表达蛋白作为标志蛋白，然后通过对抗标志蛋白抗体的检测将疫苗免疫动物和野毒感染动物区分开，以便对野毒感染动物采取针对性的防制措施。可用作缺失标志的基因有gE,gG和gC。但在美国的应用实践表明，因为抗gG抗体的产生易受母源抗体影响，所以检测抗gG抗体的鉴别性诊断方法的特异性存在缺陷。gC是重要的免疫原，抗gC抗体水平与对野毒株的抵抗力、攻毒后生长增重和阻止强毒释放呈正相关。而gE基因在所有伪狂犬病病毒野毒株中均稳定表达，野毒感染猪中均存在抗gE糖蛋白的抗体，抗体持续时间可达2年，且不是刺激机体产生保护性免疫所必需，所以被作为最佳标志基因，gE基因缺失株疫苗是无毒的，并且他们缺失编码gE糖蛋白的DNA序列，不能表达gE糖蛋白来刺激机体产生抗gE抗体，因此可通过使用商业化gE-ELISA检测抗gE抗体来区分开接种血清阳性猪和野毒感染血清阳性猪。这种接种gE基因缺失疫苗结合鉴别性诊断能力现在己成为在美国和各欧共体成员国及中国台湾地区推广的规章化的伪狂犬病消除计划的理论基础。gE基因缺失疫苗是在欧共体成员国中唯一被允许使用的修饰活疫苗。丹麦规定于1993年9月起，法国规定于1995年10月起，强制使用伪狂犬病gE基因缺失疫苗。1992年4月美国家畜保护研究所伪狂犬病委员会决定至1993年7月1日，将终止未包含gE缺失的伪狂犬病疫苗的分发和销售工作；至1994.1.1，未包含gE缺失的伪狂犬病疫苗的使用也将被终止。gE虽然是伪狂犬病病毒在体内和体外复制生长所非必需的，但它决定毒力和病毒复制。gE在决定病毒从细胞上释放和由细胞到细胞传播起着重要作用。它的另一重要功能是通过促进伪狂犬病病毒通过突触相连的神经元而促进其进入中枢神经系统和在其中转运扩散。因而，gE对于伪狂犬病病毒的毒力是很重要的。对PRV进行缺失后，缺失株的噬神经性减弱，在体内复制能力和顺神经传播(从神经细胞体由轴突向外传播)能力减弱，所以病毒株的毒力显著降低，对3-10周龄的猪接种后未能引起典型的AD症状(如死亡、神经、呼吸症状、体重减轻、发热)。然而，伪狂犬病病毒的毒力是受多基因控制的，其毒力不只是gE+表现型的功能。事实上，伪狂犬病病毒仅只缺失gE基因是仍能在体内和体外复制并保持一定程度的毒力，商业用gE基因缺失疫苗的毒力减弱是通过对gE基因和其他与毒力相关联的基因的共同缺失造成的。现报道的包含gE基因缺失的疫苗株有以高毒力的和高免疫原性的NIA-3株为起始材料获得的2.4-N3A(gE-)，对2.4-N3A株TK基因缺失获得的PRV783(gE-/TK-),gE-/TK-,M301(gE-)(在124位氨基酸处引入10个核苷酸导致移码即读框移位)，M303(gE-)(对125位结氨酸和126位半胱氨酸缺失，导致不连续的抗原区域C、E丢失)，gE-/gI-株,gE-/gG-/TK-株，1owaS62株(Ge-/gG-/TK-)和PRV-Ba-UL10-(gE-/gl-/gM-)等。gE基因缺失株的免疫原性要高于常规弱毒苗和其它类基因缺失苗，gE基因缺失株疫苗接种猪后引起的中和抗体滴度不一致，但均可抵御强毒感染。攻毒后不引起发热或引起低热，生长没受阻碍或受短时间的影响，不向外散毒或散毒滴度低。正是由于gE基因缺失株的高免疫原性，同时结合gE-ELISA检测淘汰野毒感染阳性猪，可使根除伪狂犬病成为可能。四川农业大学郭万柱自20世纪80年代等以来自发病牛的PRV闽A株为材料，通过外切酶消化缺失了部分TK基因，构建了pTD转移载体，同时通过限制性内切酶缺失构建了pP63LacZ转移载体质粒，在此基础上通过同源重组技术构建了PRVFa基因缺失株SA215。本发明中所构建的PRVFa基因缺失株，删除了PRVTK、gE和gl等重要毒力基因，这些基因为病毒复制非必需基因，其缺失不影响病毒的复制而同时保留了病毒的免疫原性。PRV多基因缺失疫苗株缺失了全部的gE、IIK的基因和部分TK、gl和28K蛋白基因。该基因的缺失使得PRV基因缺失疫苗突变株中不包含有任何gE基因的序列，不存在表达任何gE基因或者部分gE基因肽段的可能性，为伪狂犬病的根除计划提供坚实可靠的理论和实际操作可行性。华中农业大学陈焕春等于20世纪90年代末开始了伪狂犬病TK-/gG-双基因缺失疫苗的研究，但由于gG基因并不是毒力基因，因此获得的突变疫苗株并不是理想的疫苗株，毒力不能得到有效地减低，为了进一步减低该毒株的毒力，提高安全性，陈焕春在TK基因缺失的基础上，用BstEII和StuI双酶切质粒pSKFB，弃去1247bp的片段，回收大小为5.7kb的片段，用Klenow酶补平，T4DNA连接酶连接，通过同源重组技术缺失了gE和gl基因，从而获得了PRVTK-/gE-/gl-基因缺失突变疫苗。该疫苗株缺失的基因为部分gl、gE、28K和全部的llk基因。对于在伪狂犬病的根除计划中具有非常重要意义的gE基因只缺失了部分基因，存在表达部分gE糖蛋白从而影响鉴别诊断疫苗免疫猪和强毒感染猪的可能性，因此该毒株存在干扰诊断的潜在隐患
发明内容-本发明人为了克服现有的疫苗免疫原性不好、安全性不高、难于区分野毒感染猪和疫苗免疫猪等技术难题，以伪狂犬病病毒闽A株为原始材料，通过同源重组的方法人工缺失了伪狂犬病病毒中影响毒力的几个基因TK、gE、gl、IIK、28K，获得了一株毒力减低且不影响伪狂犬病病毒免疫原性的SA215病毒。所述病毒制备成疫苗后能有效地预防和控制伪狂犬病的发生和流行。本发明的第一个目的是提供SA215病毒；本发明的第二个目的是提供SA215病毒制备的疫苗及该疫苗的制备方法。本发明是这样实现本发明伪狂犬病病毒(尸se"AraZu'esia'i7As)SA215(CCT(,'C，保藏日期2000年3月28日，保藏编号V200002)。本发明伪狂犬病病毒SA2151)其缺失部分TK、gl、28K基因序列和全部的gE、IIK基因序列；2)其重组病毒含有的特征序列为<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>CGCGGCTGGACACGGAGTGGTCCTCCGTCATCAACGGGATCC本发明按5X108pFU/y^的病毒SA215:蔗糖脱脂牛乳-50/d2.5g:50W的比例制成.本发明疫苗的制备方法，其步骤包括1)SA215病毒的制备以伪狂犬病病毒闽A株为原始材料，通过A3MH酶切伪狂犬病病毒基因组DNA与pBR322，连接获得pPB7和pPB11。raBll经Xhol酶切后，再用连续BAL-31外切酶缺失法经不同时间消化后连接，获得缺失2()0bp的伪狂犬病病毒胸苷激酶(TK)基因缺失转移载体pDTK5-6，转移载体与伪狂犬病病毒基因组DNA同源重组后获得缺失TK基因的伪狂犬病病毒；pPB7经NcoI酶切缺失部分片段后获得pPB7-1，pPB7-l再经SalI酶切缺失部分片段后获得pP63，然后将pP63用StuI酶切后与经AcoRI和ife^n酶切并用Knelow酶补平的pCMV-e载体连接，得到伪狂犬病病毒gE/gl双基因缺失转移载体pP63LacZ,转移载体pP63LacZ再与缺失TK基因的伪狂犬病病毒基因组DNA通过磷酸钙法共转染猪肾传代细胞PK15，在X-gal存在下进行蓝斑筛选，挑取蓝斑进行空斑纯化，空斑纯化三次后获得了所说的伪狂犬病病毒SA2L5(PRVTK-/gE-/g1-/LacZ+);2)疫苗的制备制备原代鸡胚成纤维，待其长成单层后，接种SA215病毒，37。C吸附l小时后，加入含1001)//^的青链霉素的维持液，37t:培养至出现细胞病变，细胞病变后收毒，测定其PFU,将其稀释至5X108pFU/历7后，按SA215病毒蔗糖脱脂牛乳=50>^:2.5g:5(k7的比例配制，充分混匀，无菌分装于小瓶中，置冷冻干燥机中冷冻干燥，压盖，置-2(TC保存备用即为所说的疫苗。该项发明丰富了我国动物病毒基因工程研究的理论基础，开创了我国动物病毒基因工程疫苗实用化的先例，促进了我国动物基因工程疫苗的研究和应用，对于我国伪狂犬病的预防控制措施的实施，最终消灭伪狂犬病，将起到决定性的作用。它极有利于减少伪狂术病所致的经济损失，促进畜牧业发展，产生巨大的社会、经济效益。研究成果居国内领先、国际先进水平。与常规疫苗相比在安全性、免疫原性、检测区分疫苗接种和野毒感染动物、控制狂犬病病毒潜伏感染方面该基因缺失疫苗具有无可替代的优势，具有使用范围更广生产工艺简单和生产成本低廉等优点。与同类疫苗相比在安全性上优于目前市面上的主要进口同类疫苗，免疫效果相近但在抗潜伏感染方面效果更独特，经强毒攻击后排毒时间短、滴度低；成本低于进口疫苗，更具有市场竞争力。图l显示了构建的PRV闽A株基因文库ia/zHI酶切电泳图谱图2显示了PRV闽A株AaMil第7片段的限制性酶切位点，A:PRV闽A株基因组，B:PRV闽A株AaMn第7片段的限制性酶切位点图。图3显示了伪狂犬病病毒转移载体的构建示意图。图4显示了PRVSA215株与Fa株穿入动力曲线。图5显示了PRVSA215株一步生长曲线。图6显示了PRVSA215株与Fa株对热敏感性。图7显示了PRVSA215株与Fa株对酸碱的敏感性图8显示了冻融对PRVSA215株与Fa株病毒滴度的影响。图9显示了免疫PRVSA215株及Bartha株后再攻毒，接种猪体重的变化曲线。图10显示了免疫PRVSA215株及Bartha株后再攻毒，接种猪体温的变化曲线。图11显示了免疫PRVSA215株及Bartha株后再攻毒，接种猪散毒曲线。图12显示了PRVSA215株最底免疫剂量的测定结果具体实施例方式实施例l伪狂犬病病毒基因缺失疫苗株SA215的构建1伪狂犬病病毒gE/gl双基因缺失突变株的构建〗.1pPB7-l质粒的构建1.1.1PRV闽A株DNA的酶切病毒PRV闽A株来自中国兽药监察所。PK15细胞购于武汉大学典型微生物保存中心。细胞培养及病毒增殖已长满单层的PK15细胞用无钙镁水洗三次后，0.25%的胰酶消化2-IO分钟，加入含1(^小牛血清的MEM营养液于37。C5。/。C02培养箱中培养24-72小时，细胞长成致密的单层后，倾去营养液，加入0.2顶7的PRV闽A株病毒液，37。C吸附l小时，加入含2鬼的小牛血清的MEM维持液，37'C5呢C02培养箱中培养24-36小时，当细胞出现756的CPE时，弃上清，留细胞抽提DNA。PRV闽A株DNA的抽提及纯化每瓶细胞加入500>"7细胞细胞裂解液(0.01MTris.HC1pH7.9，0.OIMEDTA，0.2MNaCl，0.125%TritonX-100,0.25%Sarcosyl)同时加入25AK10mg/迈"蛋白酶K,摇匀以覆盖全部细胞，37'C作用5分钟后倒入1.5瓜/离心管中，用饱和酚抽提l次,酚/氯仿(l:l)抽提l次,氯仿1次、加入2倍冻乙醇,摇匀,静置l分钟，勾取腿,溶于20A/TE(10MmTris.HC1，lraMEDTApH8.0)。PRV闽A株DNA的酶切取下述酶切体系混匀反应物后，于37'C的水浴中酶切1小时，再99'C灭活5分钟。酶切体系为PRV闽A株DNA2W，5a/*I1;"7(5U)，10X5a别IBuffer2A/H2015W。1.1.2PRV闽A株基因组5azHI酶切片段的克隆将4.4kb的pBR322质粒用fe历HI于水浴中酶切l小时，再99'C灭活5分钟。酶切体系为pBR322DNA2W，fe/^I1;"7(5U)，5syrfilBuffer2W,H2015W。然后用AlkalinePhosphatase(CIAP)去5'末端磷酸在微量离心管中按下列反应体系(pBR322-万a历HI片段20pmol，lOXAlkalinePhosphataseBuffer,5A/CIAP(1030U/W2W,补H2O至50A/)配制反应液，全量定容至50A/，振荡混合，37。C孵育30min后，再加入1WCIAP继续孵育30min后，苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)抽提2次，氯仿/异戊醇(24:l)抽提l次，添加5W的3MNaOA(:,添加125W的(2.5倍量)冷乙醇，在-2(TC下保冷3060分钟。离心分离回收沉淀，用200W的70%冷乙醇洗净后，减压干燥，用20/A/以下的TEBuffer溶解沉淀。再将经^3/^I完全酶切PRV闽A株片段与pBR322-Sa历HI去5'末端磷酸化片段.按如下所述体系1214'C连接1216小时。反应体系为PRV闽A株&3MH酶切片段4W,pBR322-細HI去5'末端磷酸化片段2^7，10X连接Buff'er2/仏ATPH:'02A/，T4DNA连接酶2W，H208/^。连接好的产物直接转化感受态细胞Aco"'DH5a。感受态细胞ADHfe的制备取单个DHfe菌落接种于10历JLB肉汤(1%蛋白胨，l%NaCl,0.5酵母抽提物)中，37。C培养过夜；再将l/77的菌液转入500孤7型锥形瓶中的10(k77LB肉汤中，37'C振荡培养24小时(旋转摇床，250转/分)，测定0055。值达0.6时，将细菌培养物转至冰上冰浴10分钟，4°C3000rpm离心15分钟，倒出培养液，以10历7冰冷的0.1mo1/1CaCl2重悬细胞，放置于冰上15min，再4。C4()00转/分离心10min,倒出上清液，每50//^初始培养物用2/^预冷的0.lix///CaCl2重悬细胞沉淀，制备好的细胞置4'C1216小时，使其感受态细胞成熟。将上述连接物转化此感受态细胞￡co力'DH5s:于FALC0N2()59管中先加入感受态细胞，再缓慢加入连接物，并且边加边搅拌，冰浴30min后，迅速将转化管放到预热到42'C的水中，作用120秒;再将管转移到冰浴中，使细胞冷却120秒后每管加900WLB肉汤，然后再37'C振荡培养60分钟。取转化菌200A/涂布取氨苄青霉素抗性(AmpT)平板，37"培养16小时。选取氨苄青霉素抗性(Amp1)的转化子，以[a32P]dATP标记的PRV闽A株DNA为探针进行菌落原位杂交，杂交方法如下-1.将转化阳性转化子转移到硝酸纤维素滤膜上(1)在含有Amp的琼脂平板上放一张硝酸纤维素滤膜。(2)用无菌牙签将各个菌落先转移至滤膜上,再转移至含有选择性抗生素但未放滤膜的琼脂主平板上。应按一定的格子进行划线接种。每菌落应分别划线于两个平板的相同位置上。最后，在滤膜和主平板上同时划一个含有非重组质粒pBR322的菌落。(3)倒置平板，于37'C培养至划线的细菌菌落生长到0.5-l.O历ffl的宽度。(4)用已装防水黑色绘图墨水的注射器针头穿透滤膜直至琼脂，在3个以上的不对称位置作标记。在主平板大致相同的位置上也作上标记。(5)用Parafilm膜封好主平板，倒置贮放于4'C，直至获得杂交反应的结果。2.转化子的裂解及DNA结合于硝酸纤维素滤膜(1)在一张保鲜膜上制作一个装有0.5mol/LNaOH的小洼(0.75历7)，使菌落面朝上，将滤膜放到小洼上，展平保鲜膜，使滤膜均匀湿润，让滤膜留于原处2-3分钟。(2)用干纸巾从滤膜的下方吸干滤膜，用一张新的保鲜膜和新配制的0.5mol/LNaOH重复步骤(l)。(3)吸干滤膜，将滤膜转移到新的带有lmol/LTris'Cl(pH7.4)的保鲜膜沣上。5分钟后吸干滤膜，再重复一次该步骤。(4)吸干滤膜，把它转移到有1.5mol/LNaCi、0.5mol/LTrisCl(pH7.4)的保鲜膜小洼上5分钟后吸干滤膜，转移到一张干的滤纸上，置于室温20-30分钟，使滤膜干燥。(5)将滤膜夹在两张干的滤纸之间，在真空烤箱中于8(TC干烤2小时，固定DNA。(6)将固定在膜上的DNA与32P标记的探针杂交。3.杂交(1)盛有2XSSC的塑料盘同，将干烤的滤膜飘浮在液面上，彻底浸湿5分钟。(2)将滤膜转到200历7预洗液的玻璃皿中。滤膜何叠在一起，放于溶液中。用保鲜膜盖住玻璃皿，放到位于培养箱内的旋转平台上，于5(TC处理30分钟。在这一步及以后的所有步骤中，应缓缓摇动滤膜，防止它们粘在一起。(3)用泡过预洗液的吸水棉纸轻轻地从膜表面拭去细菌碎片，以降低杂交背景而不影响阳性杂交信号的强度和清晰度。(4)将滤膜转到盛有150/^预杂交液的玻璃中，在适宜温度(即在水溶液中杂交时用68'C，而在5096甲酰胺中杂交时用42'C)下，预杂交1-2小时。(5)将32P标记的双链DNA探针于100'C加热5分钟,迅速置于冰浴中。单链探针不必变性。将探针加到杂交袋中杂交过夜。杂交期间，盛滤膜的容器应盖严，以防液体蒸发。(6)杂交结束后，去除杂交液，立即于室温把滤膜放入大体积(300-500/^7)的2XSSC和0.WSDS溶液中，轻轻振摇5分钟，并将滤膜至少翻转一次。重复洗--次，同时应避免膜干涸。(7)68。C用300-500历71XSSC和0.1%SDS溶液洗膜两次，每次1-1.5小时。此时已可进行放射自显影。如背景很高或实验要求严格的洗膜条件，可用300-500/a/0.2XSSC和0.1%SDS的溶液于68'C将滤膜浸泡60分钟。(8)把滤膜放在纸巾上于室温晾干后，把滤膜(编号面朝上)放在一张保鲜膜上，并在保鲜膜上作几个不对称的标记，以使滤膜与放射性自显影片位置对应。(9)用第二张保鲜膜盖住滤膜。加X光片并加上增感屏于-7(TC曝光12-16小时。(10)底片显影后，在底片上贴一张透明硬纸片。在纸上标记阳性杂交信号的位置，同时在不对称分布点的位置上作出标记。可从底片上取下透明纸，通过对比纸上的点与琼脂上的点来鉴定阳性菌落。对杂交阳性的克隆菌株进行质粒快速抽提鉴定其插入片段大小。对有插入片段的重组质粒用)fe历HI酶切，与PRV闽A株DNA用fe历HI酶切后一同电泳比较，结果见图l。重组质粒经酶切鉴定、菌落原位杂交证明，已克隆了PRV基因组除A肌'HI-1(AB)、2片段以外的12个5aysHI酶切片段，从而构建了PRV闽A株基因文库。其中PPB7-1克隆有PRV^历HI第7片段。1.1.3PRV闽A株5a/^1-7片段重组质粒(pPB7-l)的鉴定及其酶谱分析包含5a/zHI-7片段的pPB7-l重组质粒用^a/ziHI酶切、电泳后，可看到6.8kb大小的插入片段。经5a历HI、5"WI双酶切后，电泳出现大小不同的2条带，大片段约4.8kh，小片段约2.0kb。酶切电泳后的DNA经Southern转印后，以光生物标记的PRVKa株的S細HI7片段作探针，通过杂交显色反应发现，重组质粒pPB7-l经feMH酶解后的杂交图谱呈现l条带，约6.8kb;而经万s历HI和&7I双酶解后的杂交图谱呈现2条带，分别约4.8kb和2.0kb，与重组片段酶切电泳图谱一致。再用^s^En,As,"XI，A>7I，/V"I，ZV"II，I等其他限制性内切酶酶切fe;m-7片段后，分析其结果得到的酶切图谱如图2。以上酶切的条件和体系如l.1.2所述。1.2含PRV非必需基因区gp63(gl)的转移载体质粒的构建将质粒pPB7-l用限制性核酸内切酶SalI消化，回收大小约6.0kb的片段，经T4DNA连接酶连接、转化LacZ-的受体菌DH5a,提取重组质粒DNA并电泳，结果表明所得质粒DNA比pPB7-1DNA小，获得的重组质粒命名为pP63。为进一步鉴定该重组质粒，发明者用StuI、NcoI、Sall、SalI/NcoI、5』I对pP63DNA进行酶切分析，结果表明所得的重组质粒pP63含有gp50中SalI到gp63中NcoJ位点之间的片段，大小约1.8kb，其中gp63(gl)包含自上游调控区至NcoI位点的883bp的片段。该片段为PRV增殖的非必需片段，且其上有StuI、Ncol两个单一酶切位点，有利于外源基因的插入与表达。以上酶切的条件和体系同l.l.l所述，连接、转化反应的条件和方法如l.1.2所述。1.3含标记基因LacZ的转移载体质粒的构建pP63LacZ转移载体的构建示意图见图3。本发明中所述的载体质粒pCMV-e购自于Clontech公司。采用^coRI和恥'/dlll双酶切pCMV-P，琼脂糖胶电泳分离回收4.2kb的片段。酶切的体系条件为pCMV-e2〃厶AcoRI1;"7(5U),〃j'/7dl111〃/(5U),10XfboRI、历/7dl11公用Buffer2A/H2015W。按上述酶切体系混匀反应物后，于37。C的水浴中酶切l小时，再99。C灭活5分钟。然后将嗨切产物经0.8y。的琼脂糖凝胶75VH丄泳1小时，待酶切的条带完全分离开后，紫外灯下切下包含有目的片段的凝胶，用凝胶回收试剂盒回收目的片段DNA。回收目的片段DNA的方法如下所述以下使用的是QIAquick公司的GelExtractionKit回收pCMV-PfcoRI和历/7dlll双酶切片段DNA的步骤。1.紫外灯下仔细切下含待回收DNA的凝胶，置1.5W离心管中，称重。2.加入BufferQG(每100mg凝胶加BufferQG300/^)，置50。C水浴10rnin。3.若回收片段小于500bp或大于4kb，则需加入异丙醇(每100mg凝胶加异丙醇100y"7)，混匀。4.将小柱放在2/^收集管上，将上述溶液加于柱上。5.4'C离心13000gXlmin，弃去收集管中液体。6.加入50(WBufferQG于柱上,4'C离心13000gXlmin，弃去收集管中液体。7.加入750WBufferPE于柱上，4。C离心13000gXlmin，弃去收集管中液体。8.4。C离心13000gXlmin。弃去收集管。9.将柱放于一新1.5迈7离心管上，加50WEB于柱上。放置lmin，4'C离心13000gXlmin回收获得的片段用Klenow酶(购于大连宝生物工程公司)进行补平。补平的方法步骤如下20/^上述回收的DNA加入5;"7dNTP，KlenowBuffer,Klenow片段(lu/W)，去离子水IOW，室温30min,酚/氯仿抽提一次，加入l/10体积的3mol/L的NaAc(pH5.2)和2倍体积的冻乙醇沉淀DNA，离心后沉淀溶于TE中-2(TC保存备用。pP63只含有唯一的一个5Y"I酶切位点，因此发明者用6Y"I对pP63进行酶切，并回收，酶切的方法和体系如酶切的条件和体系同l.l.l所述，回收的方法如上1.3戶尸述。将补平后的pCMV-efcoRI和历/7dni双酶切片段DNA与经&"I酶解的pP63DNA连接、转化，经含X-gal/IPTG/Amp的LB固体培养基，筛选到一系列蓝色菌落，抽提质粒DNA，直接电泳，用pPP63DNA作对照，根据质粒DNA大小初步筛选出重组子，命名为pP63DNALacZ。连接、转化及筛选的方法步骤如l.1.2所述。为进一步鉴定该重组质粒，发明者继续进行了下述实验鉴定-(1)Dot^Blot核酸杂交法鉴定将pP63DNALacZ变性8(TC加热变性后点样于NC膜上，然后与光生物素标记的PCMV-&0贴/&0^1+历/701111大片段探针进行杂交，待检样品打点杂交均为阳性。杂交方法如1.1.2所述。(2)酶切鉴定用ifeMil、5"acI、iW"cII、II、iVco1、，《"I、5'a7I对pPP63LacZDNA进行酶切，所得片段大小与理论计算片段大小相似，从而成功的构建了含报告基因的转移载体pPP63LacZ。以上酶切的条件和体系同l.1.l所述。(3)pPP63LacZ中LacZ基因插入的方向鉴定用平末端连接技术产生的重组体，其外源基因插入的方向是随机的。为了确定质粒pPP63LacZ中LacZ基因的存在方向，对其DNA样品进行/V"II酶切图谱分析，结果表明，pPP63LacZ用/Vi/II酶解后，得到2.5kb/3.3kb/4.4kb的片段，LacZ是正向插入pPP63DNA中，其启动子方向与gp63转录起始方向一致。酶切的条件和体系同l.l.l所述。(4)pPP63LacZ重组质粒的Southern-Blot杂交鉴定用限制性核酸内切酶及^HI对pPP63LacZDNA、pCMV-0DNA、pPP63DNA进行酶切、电泳后的DNA经southern转印后，与LacZ基因探针杂交，结果显示，PP63LacZDNA、pCMV-PDNA经酶解后的杂交图谱均出现一条带，大小约为3.6kb,PP63DNA杂交图谱则无条带出现。1.4伪狂犬病病毒gE/gl双基因缺失突变株的构建用磷酸钙转染法将PRVDNA与pPP63LacZDNA共同转染PK15单层细胞，进行同源重组。方法如下(1)转染前24h按常规方法进行PK15细胞传代，置37。C、5%二氧化碳条件下培养至转染前3h更换为新鲜营养液。(2)取2支Eppendorf离心管分别标记为lff、2#。在lft管中加入170W1X批PBS.和3.3/^磷酸盐溶液的混合液，2tt管中依次加入133A/转染水、iOWpPP63LacZDNA(10/^/5/^)与5WPRVDNA(5/^A"7)混合物、20.3;"7氯化钙并轻轻混匀。(3)将2#管内的悬液缓缓加入1#管内，边加边温和地吹入气泡，使之缓慢混合，避免形成较粗的沉淀物。置室温作用20-30rain，形成磷酸钙-DNA细小沉淀样颗粒。(4)轻轻吹打1S管内混合物使沉淀重新悬浮，将悬液按常规方法接种(1)中准备的PK15细胞单层，并加入1历7维持液置37'C、5y。二氧化碳培养箱内培养6h，之后换入适量维持液置37'C、5%二氧化碳培养箱内培养1-3天，观察细胞病变。同时设未转染的正常细胞对照。待出现50%以上细胞病变(CPE)时冻融细胞三次，离心弃细胞碎片，收冻病毒。PK15单层细胞上反复增殖病毒并以加有X-gal/IPTG的培养基以蚀斑法纯化重组病毒，即将反复增殖过的病毒感染长满PK15单层细胞的六孔盘内，37T〕吸附lh,吸弃接入的病毒液，加入45'C左右的、含有X-gal/IPTG的15W琼脂维持液(含2%犊牛血清MEM)铺于单层细胞上，待凝固后置37。C(含有5免C02)的培养箱中培养观察。出现蚀斑后，显微镜下挑取单个蚀斑，通过增殖单个蚀斑后抽提病毒DNA，I酶切鉴定，获得重组病毒得PRVFagE-/g1-/LacZ+基因缺失株。采用酶切、核酸分子杂交技术鉴定，获得了3-2等数株PRVgE-/g1-/LacZ+基因缺失株。抽提D陽的方法如l.l.l所述，酶切的条件和体系同l.l.l所述，杂交方法如L1.2所述。2伪狂犬病病毒TK基因缺失转移载体的构建2.1pPBll质粒的构建将PRV基因组和pBR322分别用fe/zm进行酶切，并回收pBR322酶切片段，在D混连接酶的作用下，连接并转化大肠杆菌DH5a,构建PRV基因文库，对杂交阳性菌落，抽提重组质粒，酶切后与经^a^I酶切的PRV闽A株DNA—同电泳，比较重组片段与PRV闽A株DNA的带谱，鉴定出含PRVAs/rfH第ll片段的重组质粒并命名为pPBll。抽提DNA的方法如l.1.l所述，酶切的条件和体系同l.1.l所述，杂交方法如l.1.2所述，DNA的回收方法如1.所述，连接、转化反应的条件和方法如1.1.2所述。2.2伪狂犬病病毒TK基因缺失转移载体pDTK的构建取pPPBll-DNA5W《，用限制性核酸内切酶屈ol将其完全消化后，用酚/氯仿、氯仿各抽提一次，再加入0.1倍体积2zro7/ZNaCl，2倍体积的无水乙醇，混匀置-2(TC2小时，4'C12000/py/离心30分钟，沉淀经75%乙醇洗漆后自然千燥，然后溶于去离子水中，置于冰上，然后依次加入12.5A/2xExonucleaseII工缓冲液，0.2xExo薩leaseIII(200uMO,混匀后于25'C水浴2分钟。再加入20W2XBAL31Buffer，155AZH20，经68'C水浴15分钟后，置于冰上，加入15U用BAL31Buffer稀释的BAL31Nuclease，混匀30。C水浴不同时间(2-30分钟)，依次加入20%SDS，l卿7/ZTris-HC1(pH9.5),8tt7oMLiCl,经酚/氯仿、氯仿各抽提一次后，加入3卿7/ZNaAc(pH5.2),650AZ无水乙醇，-20°C2小时，4。C1200(Xr/)忍离心30分钟，沉淀经75%乙醇洗涤后自然干燥，然后溶于去离子水中。将用连续feJ31外切酶缺失法经不同时间消化的产物经连接、转化入大肠杆菌DH5o株，得到一系列转化菌株pDTK，经酶切筛选后，进行Southern转印杂交。对筛选后的包含^/zHI-11片段的4株TK缺失重组质粒pDTK3-1、pDTK3-6、pDTK3-8和pDTK5-6的DNA经^MH酶切电泳后，以标准分子量YDNA/历/din和pPBll(插人片段5aMH-11分子量为3.4)作比较，根据标准分子量曲线，由各片段的迁移率求出其相应分子量大小的值，结果4株pDTK插入片段的分子分别是2.15kb、2.3kb、2.15kb和3.2kb、缺失的碱基数分别约为1250、11001250和200bp。酶切电泳后的DNA经Southern转印后，与PRVFaDNA探针杂交结果显示，4株pDTK-DNA经"朋m酶解后的杂交图谱出现紫色条带。分别约为2.15kb、1.3kb、2.15kb和3.2kb、与重组片段的酶切电泳图谱一致。以上酶切的条件和体系同l.l.l所述，杂交方法如1.1.2所述，连接、转化反应的条件和方法如l.1.2所述。3伪狂犬病病毒11(-^￡-/g1-LacZ+基因缺失病毒(SA215)的构建,在FagE-/g1-/LacZ+基因缺失株构建成功的基础上，以已经构建的TK缺失重组质粒pDTK3-6，pDTK5—6DNA与FagE-/gl-/LacZ+株(3-2)DNA通过TK-143细胞用磷酸钙转染法进行同源重组，在5'BUDR压力下筛选，挑取蚀斑，再经5，BUDR筛选3次，获得的毒株分别命名为PRV-SA214、215、3132、3153、3155等数株PRVTK-/gE-/g1-/LacZ+多基因缺失株。其中SA215突变株TK基因缺失约2:00bp。分别以生物素标记的pUC18DNA和pDTK3-6DNA为探针按甲酰胺系统进行斑点杂交。结果表明该缺失株的构建是确实的。同源重组方法如2所述。实施例2伪狂犬病病毒TK-/gE-/gl-/LacZ+基因缺失病毒(SA2]5)疫苗的制备冻干苗制备工艺流程疫苗株的增殖、配苗、冻干、疫苗毒毒价测定，疫苗的生物特性检测。1疫苗株的增殖1.1伪狂犬病基因缺失疫苗SA215制苗毒液的制备及半成品检验]..1.1生产用种毒的制备毒种繁殖按感染复数(M.O.I)为5的种毒量将毒种加入长有致密单层的鸡胚成纤维细胞37。C吸附1小时，弃毒液，加不含小牛血清的维持液，37'C旋转培养1-3天后收毒。1.1.2毒种标准生产用SA215疫苗毒符合下列标准(1)病毒含量:用维持液将毒种作10倍系列稀释，取1(T,10、]0—5，I(T',IO75个稀释度，每个稀释度分别接种6孔盘内培养形成的致密PK15细胞单层1孔，每孔0.1W,37。C吸附l小时。每孔加入EMEM液(含甲基纤维素0.5免)2-3W，置二氧化碳培养箱37。C培养3-4日，吸去上清液，用1%结晶紫、福尔马林染液染色20分钟，弃染色液，计算蚀斑数。试制8批疫苗SA215半成品，其病毒滴度均在l(y'PFU/W以上。结果符合《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》(2001年版)要求的疫苗制造和质量检定标准，满足下一步制苗要求。(2)安全性用20-22日龄健康易感(PRV中和抗体效价〈l:4)仔猪2头，各肌肉注射毒种1W(含5X106PFL))，观察14日。结果无任何伪狂犬病症状出现。结果符合《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》(2001年版)要求的疫苗制造和质量检定标准，满足下一步制苗要求。(3)免疫原性用20-22日龄健康易感(PRV中和抗体效价〈1:4)仔猪4头，各肌肉注射毒种1/^(含5X104PFU),28日后，连同条件相同的对照猪4头，各滴鼻攻毒PRVFa株病毒液l/^(含106PFU)，观察14日。对照猪全部发病并死亡，免疫猪应全部获得保护存活。结果符合《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》(2001年版)要求的疫苗制造和质量检定标准，满足下一步制苗要求。(4)纯净按《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》(20()l年版)规定方法进行，毒种无细菌、霉菌("标准"附录301页)、支原体("标准"附录305页)及外源病毒("标准"附录306页)污染。结果符合《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》(2001年版)要求的疫苗制造和质量检定标准，满足下一步制苗要求。(5)特异性将毒种稀释成10VFU/历厶与PRV特异性血清(中和指数为700-1000)等量混合，37'C中和1小时，同时设病毒对照，分别接种PK15细胞单层。置二氧化碳培养箱37'C培养3-5日，观察细胞病变(CPE)。病毒对照组出现细胞圆縮、融合形成空斑等细胞病变，中和组未见CPE。结果符合《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》(2001年版)要求的疫苗制造和质量检定标准，满足下一步制苗要求。(6)基因鉴定①TK基因鉴定取致密的TK-143细胞单层6瓶，分别接种PRVSA215株、PRVFa株和维持液各2瓶，每瓶0.2历7，37'C吸附1小时，期间摇动3次，使之均匀吸附。分为2组.使每组含接种PRVSA215株、PRVFa株和维持液的细胞各l瓶，分别加入含5-BUDR(50Ug/W)和不含5-BUDR的维持液10历7,置37。C培养，在倒置显微镜下连续3-5日观察细胞病变。接种PRVSA215株的细胞均应出现细胞圆縮、融合形成空斑等典型细胞病变；接种PRVFa株的细胞中，加入5-BUDR的细胞均未出现细胞病变，不加5-BUDR的细胞均出现细胞圆縮、融合形成空斑等典型细胞病变；加维持液的2个对照细胞瓶中未出现细胞病变，结果证明SA215病毒缺失了TK基因。②gl基因鉴定按常规方法分别提取SA215病毒和PRVFa株DNA，用&州I酶进行酶切，电泳，与PRVFa株相比，PRVSA215株的第7片段迁移率加快，表现为条带远离点样孔。证明SA215病毒gl基因已被缺失。酶切的条件和体系同l.1.l所述。③gE基因鉴定用3月龄、体重50-60kg的健康易感(PRV中和抗体效价〈l:4>猪4头，随机分为2组，每组2头，分别滴鼻接种PRVSA215株和PRVFa株病毒液各1历7(均含105PFU)。14日后，前腔静脉采血，分离血清制备抗血清。用gE-ELlSA试剂盒对上述两种血清进行gE抗体检测。结果PRVFa株抗血清为阳性，PRVSA215抗血清为阴性。证明SA215病毒gE基因已被缺失。所有使用的作为基础毒种的病毒的穿代次数均未超过l()代。⑤毒种保存湿毒-7(TC保存不超过6个月，-20。C保存不超过l个月。1.1.3制苗材料的选择为鸡胚成纤维细胞单层。具体制备方法为在无菌条件下采取9-10日龄鸡胚，置灭菌平皿中，去头、爪和内脏并剪成块，用Haiiks液充分冲洗后移入青霉素瓶中，将其剪成l/M/大小的碎块，加入Hanks液充分冲洗，静置几分钟，待组织块下沉后弃上清液，再加洗液，如此反复冲洗2-3次后弃上清。加入约4倍量的0.25%胰酶，并调整pH至7.6-7.8，振荡混匀后置37'C水浴中感作30分钟，每10分钟轻轻摇动一次。取出后小心吸取弃上清胰酶溶液，用洗液洗2次后，用吸管反复吹打至细胞完全分散，经双层纱布过滤于离心管中，以6〔)00转/分离心沉淀10分钟，吸弃上清，按每个鸡胚5ml的量加入营养液，用吸管吹打制成细胞悬液，经细胞计数后用营养液稀释至终浓度为5X105，装入细胞培养转瓶，置37'C温箱内培养至细胞单层。1.1.4制苗毒液的制备(1)接种-70'C保存的5代内的SA215病毒按E0.I为5的量将毒种加入到长有致密单层的健康鸡胚成纤维细胞转瓶内，37i:吸附l小时，弃接种毒液，加不含小牛血清的维持液，37'C旋转培养。(2)培养观察37t:旋转培养，每天在倒置显微镜下观察细胞病变情况。(3)收获接毒后约1-3天75%以上细胞出现病变，即可反复冻融3次后10000rpm离心10min，弃细胞沉淀，收获病毒上清液。(4)分组:根据生产需要对毒液分组保存于一2(TC。1.1.5半成品检验从分装的开始、中间、最后3个阶段随机抽取样品。每批、每瓶半成品取样2-5毫升，进行下列检验(1)无菌检验按"中华人民共和国兽用生物制品质量标准"附录301页规定方法进行。(2)毒价测定每批半成品苗1毫升作10倍递增稀释至10"-10—7稀释度，每稀释度分别接种O.l历7至在5孔盘内培养形成的致密Vero细胞单层lL，37。C吸附l小时。用W甲基纤维素与2XEMEM等量混合后，每孔加入2-3历厶于C02培养箱，37"培养3-4天，吸去上清液，以1%结晶紫福尔马林染液染色20分钟，弃染色液，计数蚀斑。病毒液的毒价》105PFU/0.l历7时可用于配苗。2配苗及分装将检验合格的半成品苗于37'C水浴中快速融化，过滤除去细胞碎片，稀释成5X105pFU/z^后，加入等量5%蔗糖脱脂牛乳保护剂，充分混匀，无菌分装于小瓶中。3冻干分装后立即在冷冻干燥机中进行冷冻真空干燥。4成品检验在冻干完成后，从每柜的上、中、下各层的四角和中央5个位置分别随机取样，按下述方法进行检验。4.l物理性状本品为海绵状疏松团块，色微黄，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解，实验结果符合要求。4.2无菌检验按"中华人民共和国兽用生物制品质量标准"附录:301页规定方法进行检验和判定，实验结果符合要求。4.3支原体检验按"中华人民共和国兽用生物制品质量标准"附录305页规定方法进行检验和判定，实验结果符合要求。4.4鉴别检验按1.1.1.2(5)项进行检验和判定，实验结果符合要求。4.5病毒含量测定按1.1.1.2(1)项的方法进行。每头份疫苗的病毒含量》105PFU为合格，实验结果符合要求。4.6外源病毒检验按"中华人民共和国兽用生物制品质量标准"附录306页，第2法进行，实验结果符合要求。4.7安全检验疫苗用pH7.2PBS稀释后，肌肉注射21日龄PRV抗体阴性健康仔猪2头，2头份/头，观察7天，无任何伪狂犬病症状出现，实验结果符合要求。4.8效力检验用21日龄的PRV抗体阴性健康仔猪4头，每头颈部肌肉注射疫苗l头份。然后下列方法任择其一。(1)免疫后28天釆血，分离血清，测定血清中和抗体滴度。中和抗体效价M:30时，判疫苗合格。(2)免疫后28天，与同条件的对照猪4头一起，每头用100PFU的PRVFa株强毒滴鼻攻击，观察7天。免疫猪4头全部受保护，对照猪4头全部发病，且至少2头死亡时，判疫苗合格。实验结果符合要求。4.9真空度测定按"中华人民共和国兽用生物制品质量标准"附录321页进行，结果符合要求。4.10剩余水分测定按"中华人民共和国兽用生物制品质量标准"附录321页规定方法进行和结果判定，结果符合要求。4.11冻干苗保存期试验将20011,20012,20021,20022和20023五批苗分别抽样放置-2CTC,4-8'C和室温不同时间测定PFU.结果在保存7天后，测定的成品毒价均在10SpFU/历7以上，符合质量标准的要求。5伪狂犬病病毒TK-/gE-/gl-三基因缺失突变株(SA215)生物特性研究5.1穿入动力测定在生长PK15细胞单层的6孔盘上分别接种200PFU的PRVFa和PRVSA215株，4°C吸附lh后，除去接种物，用37。C预温的营养液覆盖细胞，以便穿入。分别于0,5,10,20,40min时，用低pH值溶液40/a^檬酸-10威KQ-135/n/)/NaCl(pH3.0)处理细胞单层2min,以灭活细胞外的病毒。细胞用PBS缓冲液冲洗两次，覆盖甲基纤维素培养基，37'C培养2-3天后，细胞固定和染色，并噬斑计数。病毒充分吸附后，在病毒穿入适宜温度条件下(37'C)培养不同时间后，应用低pH溶液灭活细胞外吸附而没有穿入到细胞的胞外病毒粒子后，测定的噬斑数与应用PBS液处理后测定的噬斑数相比计算出穿入百分比，PRVSA215具有与PRVFa株相似的穿入动力，没有表现出穿入受阻碍。(见图4)5.2—步生长曲线测定在生长有PK15细胞单层的细胞瓶以M.0.I为5的量分别接种PRVFa和PRVSA215株，4'C吸附lh。然后，除去接种物，37'C预温的营养液覆盖细胞90min,以便穿入。然后，剩余的细胞外病毒以低pH处理灭活。加入维持液培养。分别在0和4，8，12,16，20，24，28，32，36,40,44和48小时收集细胞和上清液及混合物，细胞在-70°C冷冻，37'C融解来裂解，在第8小时可以检测出病毒粒子增殖，随后，病毒粒子滴度上升很快，在20-44小时内维持较高的病毒滴度，相对应的细胞病变是从细胞聚集、融合，开始形成噬斑到约出现80%的细胞病变。不同时间的病毒粒子滴度没有显著差异(一个数量级以内)。与Fa株相比，SA215病毒表现为复制速度减缓，掩蔽期延长，达到最高增殖滴度的时间推迟，但能达到相似的增殖滴度，且能维持更长的时间。这与SA215相比于Fa株减弱的致细胞病变效应有一定的平行关系，Fa株能在相对短的时间内(约28小时)引起细胞脱落、崩解。(见图5)5.3耐热性试验PRVSA215株和Fa株病毒各4份装于小瓶中，置56"C恒温水浴中处理，分别在15、30、45和60min时取出，PRVSA215株和野毒Fa株在56'C处理不同时间后，均导致病毒滴度的显著降低，每15分钟约降低两个滴度。两者相比，没有显著的差异(见图6)。5.4酸碱敏感实验含O.5ml病毒的细胞培养上清用0.1NHCl或NaOH溶液调节pH值至3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0，lO.O和ll.O,计算加入的HCl或NaOH溶液体积，37。C孵育l小时，然后用相应的HCl或NaOH溶液调节ra值至7.O作蚀斑试验确定病毒滴度，结果PRVSA215株和野毒Fa株表现出相似的对酸碱的稳定性。pH在5-9的范围内，病毒滴度下降不显著。pH值超过该范围时，病毒滴度快速降低，在rai.0和PH9.()时，37。C作用l小时可导致病毒死亡。(见图7)5.5冻融稳定性将SA215株和Fa株病毒-20°C20min和37。C5min反复冻融5次后，对SA215株和Fa株病毒的滴度均有一定的影响，但不显著。冻融一次后，病毒的滴度降低范围在一个数量级内，SA215株和Fa株表现出相似的敏感性。(见图8)5.6电镜扫描将PRVFa株和PRVSA215株以M.0.I为1感染PK15单层，于感染后12，16,20和24小时，收集细胞，用含有2.5X的戊二醛固定60min，低速离心成小球。包埋于低熔点琼脂糖。小片用0s04后固定60min和用醋酸铀染色。在乙醇中逐级脱水后，细胞在氧化丙烯中清晰。包埋，59'C,聚合4天。超薄切片，染色后H600透射电镜观察。与PRVFa相比较，PRVSA215株感染PK15细胞后可以看见二级囊膜形成过程和胞外病毒粒子，病毒的形态正常发生。但在胞质内发现有电子密度材料聚集，且伴有衣壳存在，表明在由核膜出芽和囊膜形成过程受到一定程度的阻碍和延缓。5.7安全性试验分别选取健康、伪狂犬病血清学阴性的l日龄新生仔猪、妊娠母猪、水牛、黄牛、山羊、绵羊、家兔和家犬同时肌注和滴鼻接种各0.5头份剂量伪狂犬病病毒基因缺失(SA215)疫苗，接种后一周内对所有试验动物进行临床观察，除l日龄仔猪和犬在接种后连续3天出现体温轻微升高外，其余动物均精神状态良好、食欲正常、接种部位无红肿热痛等不良反应。妊娠母猪接种后，所产仔猪发育正常。另选选健康21日龄仔猪7头，设4倍剂量、IO倍剂量、50倍剂量3个试验组，每组接种两头，在观察期内均未引起不良反应。5.8试验猪在攻毒后反应对免疫猪在免疫后的第4周以100TCID5。的PRVFa毒株进行攻毒，攻毒后在l个月的观测期内SA215疫苗和Bartha疫苗接种猪在攻毒后第二天起，均出现发热、精神沉郁、食欲降低等症状。第5天时，均恢复正常。第4-5天有3/4头猪在昏迷中死亡；攻毒后，各组试验猪体重情在前几天内受到一定的影响，SA215株接种组、Bartha株接种组和未接种对照组各试验猪的增重受阻时间(体重恢复到攻毒时的天数)分别为4天、6天和多于7天。(见图9);攻毒后，SA215株接种组、Bartha株接种组和未接种对照组各试验猪的平均发热期分别为4天、5天和6天(见图10);应用SA215疫苗株和Bartha株接种后，均未能从接种猪及同居共感染猪的鼻拭子样品中分离出病毒。从强毒攻毒后的第二天起，除同居共感染猪外，均能从各攻毒试验猪鼻拭子样品中分离出病毒。SA215接种猪散播的病毒滴度略低于Bartha株接种猪(约低-一个数量级)，SA215和Bartha接种猪散毒的天数分别为5天和6天。然而，SAMS和Bartha接种猪散播的病毒滴度都远远低于对照组(约低3-5个数量级)，散毒的天数也低于对照组(见图ll),且未从同居感染猪中分离出病毒。对照组中同居共感染猪在攻毒后第4天也向外散毒；疫苗接种猪在第l周即产生抗体，随后抗体水平急剧上升在第4-8周时维持较高水平。第12周时开始缓慢下降。第16周时，其抗体水平仍可达到保护水平。5.9SA215最低免疫剂量的测定对5组试验猪分别接种剂量为1X1045X104,rX105、5X105和lXl(f个PFU的伪狂犬病基因缺失疫苗SA215。接种后第4周对各猪以100PPU(约IOO个U)P)的PMPa野毒株滴鼻攻毒。攻毒后，接种1X104PFU到1X106PFU的伪狂犬病基因缺失疫苗对猪均有不同程度的保护作用，其中接种lX105PFU以上的剂量能对接种猪提供10(^的保护作用。因此，SA215最低免疫剂量为1X105PFU。(见图12)5.10病毒体内分布选取健康猪接种PRVSA215疫苗、783疫苗及PRVFa或者攻毒后7天，屠宰取鼻粘膜、咽粘膜、嗅上皮、扁桃体、软鄂、腮腺下淋巴结、三叉神经和神经节、嗅神经和嗅球、脑千、延髓、小脑、脑桥、中脑、间脑、大脑等组织，测定病毒的滴度表明PRVSA215和783疫苗均能在组织和外周神经中能进行有限的复制，但没能侵入到中枢神经系统。两者之间没有明显的差别。而野毒PRVFa株具有更高的复制扩散能力，在外周组织和神经中，其滴毒比PRVSA215疫苗和783疫苗的增殖滴度约高IO-IOOO倍，并能通过转突触扩散到中枢神经系统。5.11PRVSA215疫苗对潜伏感染的影响为了研究PRVSA215的免疫对PRV潜伏的影响，先后运用了两种方案方案一采取先接种后攻毒，攻毒后3周，分别采样和大剂量应用糖皮质激素，检测强毒潜伏感染部位及潜伏感染的病毒活化情况。方案二采取先攻毒后接种，检测疫苗接种对试验猪体内已形成的潜伏感染的影响及应用安全性。方案一中伪狂犬病基因缺失疫苗SA2]5在接种后虽然不能完全阻止随后感染的强毒在猪体内形成潜伏，但是对于潜伏感染建立的部位和比率有重要影响，表现出一定的抗潜伏感染能力。疫苗接种对潜伏感染的野毒的活化也有重要抑制作用。与对照相比，疫苗接种猪攻毒后形成潜伏感染的强毒在地塞米松处理后活化的病毒散播的天数和滴度比对照组少。伪狂犬病基因缺失疫苗SA215株和783株抗潜伏感染形成和重新活化的能力差异不显著。在方案二中，对已形成潜伏感染的猪接种伪狂犬病基因缺失疫苗SA215时，没有表现可检出的接种反应，表明该疫苗接种具有安全性。对已形成的潜伏感染病毒分布部位和检出比率有一定影响，但差异不显著。本发明保藏的生物材料样品为伪狂犬病病毒毒株SA215Vero细胞培养物保藏R期2000年3月28日保藏编号V200002包藏单位地址中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心分类地位疱疹病毒科(〃e/pes"/7'(/ae)-疱疹病毒甲亚科"7/7力3力er;e^^r'o^e)-水痘病毒属(Ka/"j.ce77oKj'/7AS)-伪狂犬病病毒(pseudorabiesvirus)权利要求1、伪狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus)SA215(CCTCC，保藏日期2000年3月28日，保藏编号V200002)。2、根据权利1要求所述的伪狂犬病病毒SA215,其特征在于1)其缺失部分TK、gl、28K基因序列和全部的gE、IIK基因序列；2)其重组病毒含有的特征序列为<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>CGCGGCTGGACACGGAGTGGTCCTCCGTCATCAACGGGATCC。3、伪狂犬病病毒多基因缺失疫苗，其特征在于按5X108PFU/ml的病毒SA215:蔗糖脱脂牛乳=50ml:2.5g:50ml的比例制成。4、根据权利要求3所述疫苗的制备方法.其步骤包括1)SA215病毒的制备以伪狂犬病病毒闽A株为原始材料，通过BamHI酶切伪狂犬病病毒基因组DNA与pBR322,连接获得pPB7和pPB11。PBBll经Xhol酶切后，再用连续BAL-31外切酶缺失法经不同时间消化后连接，获得缺失200bp的伪狂犬病病毒胸苷激酶(TK)基因缺失转移载体pDTK5-6，转移载体与伪狂犬病病毒基因组DNA同源重组后获得缺失TK基因的伪狂犬病病毒；pPB7经NcoI酶切缺失部分片段后获得pPB7-l，pPB7-l再经SalI酶切缺失部分片段后获得pP63，然后将pP63用StuI酶切后与经EcoRI和BamHI酶切并用Knelow酶补平的pCMV-β载体连接，得到伪狂犬病病毒gE/gl双基因缺失转移载体pP63UcZ，转移载体pP63LacZ再与缺失TK基因的伪狂犬病病毒基因组DNA通过磷酸钙法共转染猪肾传代细胞PK15,在X-gal存在下进行蓝斑筛选，挑取蓝斑进行空斑纯化，空斑纯化三次后获得了所说的伪狂犬病病毒SA215(PRVTK-/gE-/g1-/LacZ+);2)疫苗的制备制备原代鸡胚成纤维，待其长成单层后，接种SA215病毒，37'C吸附1小时后，加入含100U/ml的青链霉素的维持液，37℃培养至出现细胞病变，细胞病变后收毒，测定其PFU，将其稀释至5X108pFU/ml后，按SA215病毒蔗糖脱脂牛乳-50ml:2.5g:50ml的比例配制，充分混匀，无菌分装于小瓶中，置冷冻千燥机中冷冻干燥，压盖，置-2℃保存备用即为所说的疫苗。全文摘要本发明属于动物病毒学及基因工程学
技术领域：
，涉及缺失伪狂犬病病毒闽A株的部分毒力基因的伪狂犬病病毒，并用所述病毒制备成疫苗的方法。利用DNA重组技术人工去除PRV(PseudorabiesVirus，PRV)中影响毒力的几个病毒复制非必须基因TK、gE、gI、11K、28k的全部或部分蛋白编码区，降低PRV的毒力，获得减毒基因工程缺失弱毒疫苗株SA215，并用SA215病毒制备疫苗，免疫动物能有效地预防和控制伪狂犬病的发生和流行。文档编号C12N7/00GK101186902SQ200610021318公开日2008年5月28日申请日期2006年7月4日优先权日2006年7月4日发明者郭万柱申请人:四川农业大学