32)，电转染绵羊成纤维细胞后，Lig4蛋白表达量明显低于其他实验处理的细胞样 品。说明Lig4-siRNA-2629和Lig4-siRNA-1132能够有效抑制绵羊Lig4基因表达。电转质粒 pDSRed2-Nl、阴性对照siRNA、空白电转细胞Lig4蛋白表达都略高于正常细胞，与Real-time PCR结果一致。过表达Lig4基因 mRNA表达量很高而蛋白表达量只是略高于正常细胞，可能原 因为细胞选择性的翻译结果。
[0073] 因此最佳的 Lig4 基因 siRNA 为 Lig4-siRNA-2629 和 Lig4-siRNA-1132。
[0074] 实施例2、提高绵羊胚胎成纤维细胞基因组DM同源重组修复频率
[0075] Lig4基因 SiRNA在提高离体绵羊胚胎成纤维细胞内HR修复效率，具体如下：
[0076] 由于绵羊原代成纤维细胞传代能力有限，建立稳定的克隆基本不可行。为了定量 测定DNA末端连接效率和保真性，采用质粒重连测试法(plasmid rejoining assay)。
[0077] Gorbunova实验室惠赠的皿质粒，使用GFP(Green Fluorescent Protein)作为重 构报告基因。该报告系统含有2个突变的GFP-Peml拷贝。在第一个GFP-Pem 1基因片段中， GFP的第一部分外显子中含有22bp碱基长度的删除，并且插入两个反向对称的I-Scel酶识 别位点。第二个GFP-Peml基因片段缺少启动子、ATG起始密码子和第二部分GFP的外显子。当 I-Scel位点断裂后，产生不互补的粘性末端DSBs。在细胞内，断裂的皿报告系统，在同源重 组修复作用下，利用相连的供体同源GFP模版在断裂位点发生同源重组，恢复GFP表达（图 2)，具体如下：
[007引 1、基因编辑
[0079] HR质粒（记载在：Seluanov A,Mao Z,Gorbunova V. Analysis of DNADouble- strand Break(DSB)Repair in Mammalian Cells.J Vis E邱，2010,8:(43)和Mao Z, Bozzella M,Seluanov A,Gorbunova V.DNArepair by nonhomologous end joining and homologous recombination during cell cycle in human cells.Cell Cycle.2008,7 (18) :2902-2906)用I-Scel酶线性化，切胶回收，得到特定位点DNA双链断裂的线性化HR载 体。
[0080] 2、HR质粒重连修复
[0081 ] 通过如下4组电转方案实现HR质粒重连修复：
[0082] 首先将待转染的DNA和S iRNA调整到适当浓度：线性化HR载体调整到1 yg/化， pDSRed2-Nl质粒调整到O.1μg/μL，siRNA稀释至20uM浓度。
[0083] HR+Red:100化电转液悬浮1.6 X 106个绵羊胚胎成纤维细胞，在运液体中，添加2.0 化线性化皿载体（在反应体系的浓2.化g/10化L)、l化pDSRed2-Nl质粒（在反应体系的浓 0.化g/10化L)和化L水，轻轻混匀。
[0084] Lig4-siRNA-113化皿+Red:100化电转液悬浮1.6 X 106个绵羊胚胎成纤维细胞，在 运液体中，添加2.0化线性化HR载体（2. Oyg/lOO化）、化L pDSRed2-Nl质粒(0. lyg/lOO化)和 化的20uM Lig4-siRNA-1132(终浓度200nM)，轻轻混匀。
[0085] Lig4-siRNA-2629+皿+Red: 100化电转液悬浮1.6 X 106个绵羊胚胎成纤维细胞，在 运液体中，添加2.0化线性化HR载体（2. Oyg/lOO化）、化L pDSRed2-Nl质粒(0. lyg/lOO化)和 化的20uM Lig4-siRNA-2629(终浓度200nM)，轻轻混匀。
[00化]阴性对照SiRNA+HR+Red: 100化电转液悬浮1.6 X 106个绵羊胚胎成纤维细胞，在运 液体中，添加2.0化线性化皿载体（2. Oyg/lOO化）、化L pDSRed2-Nl质粒(0.化旨/100化)和化 的20uM阴性对照SiRNA(终浓度200nM)，轻轻混匀。
[0087]上述pDSRed2-Nl表达红色巧光蛋白RFP(Red Fluorescent Protein)，共转染 pDSRed2-Nl，是为了确定电转载体DNA进入细胞的转染效率；线性化的HR载体电转进入细 胞，通过同源重组途径修复后，将发绿色巧光(GFP);线性化的HR载体和质粒pDSRed2-Nl转 入细胞，在同一个细胞内表达GFP和RFP，在绿色巧光光源下呈现粉色。
[0088] 将上述各组采用CZ-167程序电转染，每个实验处理3个平行样。使用巧光显微镜监 测成纤维细胞GFP和RFP表达。
[0089] 绵羊胚胎成纤维细胞电转线性化的HR质粒和pDSRed2-Nl质粒后36h，即可观察到 红色巧光细胞。电转染细胞后，培养至72h，两种巧光都能观测到表达。
[0090] Lig4-siRNA-113化HR+Red组电转染细胞培养72h，巧光显微镜结果如图7，A自然光 源;B绿色巧光光源，粉色细胞是GFP和RFP共表达细胞呈现的颜色;C红色巧光光源;观察到 发绿色巧光的细胞(见图7B)，说明线性化的HR载体，在绵羊成纤维细胞内可W通过HR修复 途径，实现重连。
[0091] 各组电转液电转染细胞培养72h，收集细胞，重悬在0.5ml的PBS (化C1 137mmol/L， KC12.7mmol/L，Na2册04l0mmol/L，K出P04 2mmol/L，pH7.2~7.4)中，流式细胞仪分析 (抓FACSAria虹，FACSDiva Version 6.1.3)，FITC通道检测绿色巧光的表达情况，PE通道检 测红色巧光。每份样品细胞计数10000个，重复3份平行样。
[0092] HR修复频率（同源重组效率）=(绿色巧光细胞百分比+红绿巧光细胞百分比）/(红 色巧光细胞百分比+红绿巧光细胞百分比）。
[0093] 流式细胞仪检测结果如图8所示，A:空白细胞(离体绵羊胚胎成纤维细胞）；B:GFP 单阳性(转染祀GFP-N1质粒(Clontech)的离体绵羊胚胎成纤维细胞）；C:RFP单阳性(转染 pDSRed2-Nl质粒的离体绵羊胚胎成纤维细胞）；D:GFP+RFP(Lig4-siRNA-1132+HR+Red细 胞）；E:各组电转液电转染细胞HR修复载体重连流式细胞仪检测柱状图，KC:HR+Red;Si-2: Lig4-siRNA-l 132+HR+Red; Si-4: Lig4-siRNA-2629+HR+Red; SC:阴性对照SiRNA+HR+Red;可 W看出，Lig4-siRNA-113 化皿+Red 组和 Lig4-siRNA-2629+皿+Red 组与阴性对照 SiRNA+HR+ Red对照组之间差异显著，与KC对照组相比，Lig4-siRNA-2629和Lig4-siRNA-1132瞬间干扰 绵羊Lig4基因，HR修复频率提高3-4倍。
【主权项】
1. 抑制Lig4基因表达和/或活性的物质在制备促进离体绵羊胚胎成纤维细胞在基因编 辑时进行同源重组修复产品中的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于： 所述基因编辑为将经过特定位点剪切后外源DNA分子导入离体绵羊胚胎成纤维细胞 中，使所述剪切后外源DNA分子在细胞中进行同源重组修复； 或所述基因编辑为将外源DNA分子同源重组到经过特定位点剪切后的离体绵羊胚胎成 纤维细胞基因组上。3. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于： 所述抑制Lig4基因表达和/或活性的物质为用于干扰离体绵羊胚胎成纤维细胞中Lig4 基因表达的siRNA。4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于:所述siRNA的核苷酸序列为序列表中序列3 或序列4。5. -种使离体绵羊胚胎成纤维细胞在基因编辑时进行同源重组修复频率提高的方法， 包括如下步骤:抑制进行基因编辑的离体绵羊胚胎成纤维细胞中Lig4基因表达，实现离体 绵羊胚胎成纤维细胞在基因编辑时进行同源重组修复频率提高。6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于:所述抑制进行基因编辑的离体绵羊胚胎成 纤维细胞中Lig4基因表达为将用于抑制离体绵羊胚胎成纤维细胞中Lig4基因表达的物质 导入所述进行基因编辑的离体绵羊胚胎成纤维细胞中。7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于： 所述基因编辑为将经过特定位点剪切后外源DNA分子导入离体绵羊胚胎成纤维细胞 中，使所述剪切后外源DNA分子在细胞中进行同源重组修复； 或所述基因编辑为将外源DNA分子同源重组到经过特定位点剪切后的离体绵羊胚胎成 纤维细胞基因组上。8. 根据权利要求5-7中任一所述的方法，其特征在于： 所述抑制离体绵羊胚胎成纤维细胞中Lig4基因表达的物质为用于干扰离体绵羊胚胎 成纤维细胞中Lig4基因表达的siRNA。9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于： 所述siRNA的核苷酸序列为序列表中序列3或序列4。10. 根据权利要求5-9中任一所述的方法，其特征在于： 所述使离体绵羊胚胎成纤维细胞在基因编辑时进行同源重组修复频率提高为抑制进 行基因编辑的离体绵羊胚胎成纤维细胞中Lig4基因表达的细胞同源重组修复频率高于进 行基因编辑的离体绵羊胚胎成纤维细胞的同源重组修复频率。
【专利摘要】本发明公开了一种提高基因编辑后绵羊胚胎成纤维细胞同源重组修复频率的方法。本发明提供了抑制含有基因编辑DNA片段的离体绵羊胚胎成纤维细胞中Lig4基因表达的物质在制备促进含有基因编辑DNA片段的离体绵羊胚胎成纤维细胞同源重组修复产品中的应用。本发明的实验证明，本发明筛选到抑制绵羊Lig4基因表达的siRNA，通过siRNA抑制绵羊Lig4基因表达,抑制绵羊胚胎成纤维细胞的NHEJ修复途径从而刺激细胞内HR修复途径，提高了细胞采用HR修复的频率，为提高绵羊胚胎成纤维细胞基因打靶效率和研究绵羊基因组精确编辑提供基础。
【IPC分类】C12N15/87, C12N15/113, C12N15/85
【公开号】CN105671045
【申请号】CN201610104796
【发明人】皮文辉, 周平, 郭延华, 王伟, 黄兰兰, 韩猛立, 简子健, 王新华, 刘守仁
【申请人】新疆农垦科学院
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年2月25日