专利名称：一种人卵丘细胞饲养层培养干细胞的方法
技术领域：
本发明涉及培养干细胞的方法，是一种人卵丘细胞饲养层培养干细胞的方法。
背景技术：
目前，人胚胎干细胞主要是培养在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上，这种培养干细 胞的方法虽然稳定性较好，但是，鼠的饲养层不符合临床应用要求，存在传播异种病源体的 潜在危险。为此，人源性细胞制备的饲养层为本领域技术人员近几年研究的主要课题，报道 称，人源性饲养层细胞来源可以有皮肤、肺、包皮及胚胎来源的成纤维细胞。不同的饲养层 制作效果差距很大。例如包皮标本进行饲养层制作时，效果比胚胎来源的成纤维细胞差 等。而且，皮肤、肺、胚胎不易获得，人胚胎成纤维细胞还存在伦理问题。因此，如何能够采 用一种易获得且不存在伦理问题的人源性饲养层细胞，为临床应用提供可靠的饲养层，是 本领域技术人员目前研究的主要课题。
发明内容
本发明的目的是，提供一种人卵丘细胞饲养层培养干细胞的方法，使其细胞容易 获得，培养方法易于操作，易于推广在临床上的应用。本发明为实现上述目的，通过以下技术方案实现一种人卵丘细胞饲养层培养干 细胞的方法，包括下述步骤①采用体外受精胚胎移植技术治疗不孕症的患者取卵后3-4小时，卵冠丘复合体 置入80imitS/ml透明脂酸酶液内30秒，用毛细管吹打脱去卵子周围的卵丘细胞，将卵丘细 胞收集离心管中，加卵丘细胞培养基4-6ml，采用离心机在1000转速下离心5分钟，其中透 明脂酸酶液中含透明质酸酶2. 45mg,高糖DMEM培养基IOml ；②将离心后的上清液弃掉，得到卵丘细胞悬液，在卵丘细胞悬液内加入0.25%胰 蛋白酶1ml，混勻后放置1-2分钟；③在步骤②中的卵丘细胞悬液中再加卵丘细胞的培养基4ml，混勻后，置入1000 转的离心机内离心5分钟；④将步骤③中离心后的上清液弃掉，在沉淀物中加入卵丘细胞培养基调整至密度 为5X104/ml，得到卵丘细胞悬液；⑤取四孔皿，每孔中加入0. 明胶0. 5ml，在室温中放置5分钟后将明胶液体全 部吸出后备用；⑥在步骤⑤中的四孔皿中每孔加Iml步骤④中的卵丘细胞悬液后，放置在CO2培 养箱内24小时，CO2培养箱内的CO2气体浓度为5%，CO2培养箱内的温度为37°C ；⑦24小时后在CO2培养箱内取出四孔皿，吸去卵丘细胞培养基，更换干细胞培养 基，加干细胞培养液1ml，每孔加干细胞6-8团，每团含干细胞90-110个；⑧对步骤⑦中的干细胞培养基每隔1-2天更换50%，4_7天后将长大的胚胎干细 胞团用玻璃针挑出每团切成4-8块，用毛细玻璃管吸出转移到新的卵丘细胞饲养层内培养，新的卵丘细胞饲养层是按照步骤①_⑥获得的卵丘细胞饲养层；⑨将旧的四孔皿中更换新的干细胞培养基，当残留的干细胞团再长大时，重复步 骤⑦的操作，直到卵丘细胞凋亡，不能维持干细胞生长。本发明所述的一种人卵丘细胞饲养层培养干细胞的方法，干细胞培养基按下述体 积比制作80%胚胎干细胞用培养基、20%人胚胎干细胞用血清替代品、非必须氨基酸、 2mM L-谷氨酰胺、0. ImM β -巯基乙醇、4ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、1000IU/ml白血 病抑制因子。本发明所述卵丘细胞培养基按下述体积比制成高糖DMEM培养基90%和灭活胎 牛血清10%。本发明的优点在于采用体外受精胚胎移植技术治疗不孕症的患者的废弃细胞， 细胞容易获得，培养方法操作简便，方法易于推广，不需经丝裂霉素C或Y射线照射处理， 避免了因细胞死亡，细胞内物质可能会引起胚胎干细胞的突变及影响正常核型的保持，没 有动物源性细胞污染，不存在传播异种病源体的潜在危险。为临床应用提供了可靠的饲养层。
具体实施例方式实施例本发明一种人卵丘细胞饲养层培养干细胞的方法，包括下述步骤①采用体外受精胚胎移植技术治疗不孕症的患者取卵后3-4小时，卵冠丘复合体 置入80imitS/ml透明脂酸酶液内30秒，用毛细管吹打脱去卵子周围的卵丘细胞，将卵丘细 胞收集离心管中，加卵丘细胞培养基4-6ml，采用离心机在1000转速下离心5分钟，其中透 明脂酸酶液中含透明质酸酶2. 45mg,高糖DMEM培养基IOml ；②将离心后的上清液弃掉，得到卵丘细胞悬液，在卵丘细胞悬液内加入0.25%胰 蛋白酶1ml，混勻后放置1-2分钟；③在步骤②中的卵丘细胞悬液中再加卵丘细胞的培养基4ml，混勻后，置入1000 转的离心机内离心5分钟；④将步骤③中离心后的上清液弃掉，在沉淀物中加入卵丘细胞培养基调整至密度 为5X104/ml，得到卵丘细胞悬液；⑤取四孔皿，每孔中加入0. 明胶0. 5ml，在室温中放置5分钟后将明胶液体全 部吸出后备用；⑥在步骤⑤中的四孔皿中每孔加Iml步骤④中的卵丘细胞悬液后，放置在CO2培 养箱内24小时，CO2培养箱内的CO2气体浓度为5%，CO2培养箱内的温度为37°C ；⑦24小时后在CO2培养箱内取出四孔皿，吸去卵丘细胞培养基，更换干细胞培养 基，加干细胞培养液1ml，每孔加干细胞6-8团，每团含干细胞90-110个；⑧对步骤⑦中的干细胞培养基每隔1-2天更换50%，4-7天后将长大的胚胎干细 胞团用玻璃针挑出每团切成4-8块，用毛细玻璃管吸出转移到新的卵丘细胞饲养层内培 养，新的卵丘细胞饲养层是按照步骤①_⑥获得的卵丘细胞饲养层；⑨将旧的四孔皿中更换新的干细胞培养基，当残留的干细胞团再长大时，重复步 骤⑦的操作，直到卵丘细胞凋亡，不能维持干细胞生长，4-7天后对长大的干细胞进行传代培养。本发明所述干细胞培养基按下述体积比制作80%人胚胎干细胞用培养基、20% 人胚胎干细胞用血清替代品、非必须氨基酸、2mM L-谷氨酰胺、0. ImM β-巯基乙醇、 4ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、1000IU/ml白血病抑制因子。本发明所述卵丘细胞培养基按下述体积比制成高糖DMEM培养基90%和灭活胎 牛血清10%。
权利要求
一种人卵丘细胞饲养层培养干细胞的方法，其特征在于包括下述步骤①采用体外受精胚胎移植技术治疗不孕症的患者取卵后3 4小时，卵冠丘复合体置入80units/ml透明脂酸酶液内30秒，用毛细管吹打脱去卵子周围的卵丘细胞，将卵丘细胞收集离心管中，加卵丘细胞培养基4 6ml，采用离心机在1000转速下离心5分钟，其中透明脂酸酶液中含透明质酸酶2.45mg，高糖DMEM培养基10ml；②将离心后的上清液弃掉，得到卵丘细胞悬液，在卵丘细胞悬液内加入0.25％胰蛋白酶1ml，混匀后放置1 2分钟；③在步骤②中的卵丘细胞悬液中再加卵丘细胞的培养基4ml，混匀后，置入1000转的离心机内离心5分钟；④将步骤③中离心后的上清液弃掉，在沉淀物中加入卵丘细胞培养基调整至密度为5×104/ml，得到卵丘细胞悬液；⑤取四孔皿，每孔中加入0.1％明胶0.5ml，在室温中放置5分钟后将明胶液体全部吸出后备用；⑥在步骤⑤中的四孔皿中每孔加1ml步骤④中的卵丘细胞悬液后，放置在CO2培养箱内24小时，CO2培养箱内的CO2气体浓度为5％，CO2培养箱内的温度为37℃；⑦24小时后在CO2培养箱内取出四孔皿，吸去卵丘细胞培养基，更换干细胞培养基，加干细胞培养液1ml，每孔加干细胞6 8团，每团含干细胞90 110个；⑧对步骤⑦中的干细胞培养基每隔1 2天更换50％，4 7天后将长大的胚胎干细胞团用玻璃针挑出每团切成4 8块，用毛细玻璃管吸出转移到新的卵丘细胞饲养层内培养，新的卵丘细胞饲养层是按照步骤① ⑥获得的卵丘细胞饲养层；⑨将旧的四孔皿中更换新的干细胞培养基，当残留的干细胞团再长大时，重复步骤⑦的操作，直到卵丘细胞凋亡，不能维持干细胞生长。
2.根据权利要求1所述的一种人卵丘细胞饲养层培养干细胞的方法，其特征在于干 细胞培养基按下述体积比制作80%胚胎干细胞用培养基、20%人胚胎干细胞用血清替代 品、非必须氨基酸、2mM L-谷氨酰胺、0. ImM β -巯基乙醇、4ng/ml碱性成纤维细胞生长 因子、1000IU/ml白血病抑制因子。
3.根据权利要求1所述的一种人卵丘细胞饲养层培养干细胞的方法，其特征在于所 述卵丘细胞培养基按下述体积比制成高糖DMEM培养基90%和灭活胎牛血清10%。
全文摘要
本发明公开了一种人卵丘细胞饲养层培养干细胞的方法，包括下述步骤①采用体外受精胚胎移植技术治疗不孕症的患者治疗过程中废弃的卵丘细胞，采用离心机离心；②将离心后的上清液弃掉得到卵丘细胞悬液，再加卵丘细胞的培养基混匀置入离心机内离心，离心后的沉淀物加入卵丘细胞培养基得到卵丘细胞悬液；取四孔皿，每孔中加入明胶，在室温中放置后将明胶液体全部吸出后备用；在四孔皿中加一定密度的卵丘细胞悬液后放置在CO2培养箱内；24小时后在CO2培养箱内取出四孔皿更换干细胞培养液；4-7天后对长大的干细胞进行传代培养。本发明其细胞容易获得，培养方法易于操作，易于推广在临床上的应用。
文档编号C12N5/0735GK101892193SQ20101024474
公开日2010年11月24日 申请日期2010年8月4日 优先权日2010年8月4日
发明者李娟 , 李放, 王洪岩, 王磊光, 邱毅, 魏斌 申请人:山东省计划生育科学技术研究所