用于促进人胚肺成纤维细胞增殖分化的多种生长因子复合物纤维蛋白凝胶释放系统的制作方法
【专利摘要】本发明涉及纤维蛋白凝胶释放系统【技术领域】，提供一种用于促进人胚肺成纤维细胞增殖分化的多种生长因子复合物纤维蛋白凝胶释放系统，包括纤维蛋白凝胶释放系统及以之为载体加入其中的四种生长因子，所述四种生长因子为血小板源性生长因子-AB、血管内皮生长因子、转化生长因子-β1及表皮生长因子。
【专利说明】用于促进人胚肺成纤维细胞增殖分化的多种生长因子复合物纤维蛋白凝胶释放系统
【技术领域】
[0001]本发明涉及纤维蛋白凝胶释放系统【技术领域】，尤其涉及一种用于促进人胚肺成纤维细胞增殖分化的多种生长因子复合物纤维蛋白凝胶释放系统。
【背景技术】
[0002]难治性气胸(refractory pneumothorax)又称自发性气胸持续漏气(persistentair leak),是经肋间引流5~7d后仍持续漏气的自发性气胸,主要表现为患者经胸腔穿刺抽气、闭式引流治疗后胸膜破裂处仍难以闭合，组织损伤难以修复，这些患者常需采用胸腔镜或开胸手术治疗，但常因存在各种严重基础性疾病或主观上不愿接受手术而无法进行外科治疗，给临床治疗带来一定的困难。难治性气胸其主要原因为持续性支气管胸膜瘘，故促进肺组织损伤的修复、胸膜破裂口的闭合，对于难治性气胸的治疗具有关键性作用。
[0003]肺组织损伤修复过程包括炎症反应期、肉芽组织形成期以及瘢痕形成期三个阶段，整个过程不仅涉及细胞再生，还受细胞外微环境和各种化学因子的调节，主要包括细胞外基质以及多种生长因子之间的相互作用。肺组织损伤修复早期主要表现为伤口收缩、肉芽组织形成、成纤维细胞大量增生、胶原蛋白分泌及细胞外基质沉积等，后期则表现为瘢痕形成及其异常增生。人肺成纤维细胞在组织修复整个过程中起到极为重要的作用，主要由静止状态的纤维细胞 转变而来，或未分化间叶细胞分化而来，幼稚成纤维细胞体积大，有星芒状突起，逐渐成熟并合成分泌前胶原蛋白，在损伤部位细胞周围形成胶原纤维，并分泌生长因子，最终分化成纤维细胞，促进伤口愈合。同时，与组织修复关系密切的还有多种生长因子，如血小板源性生长因子-AB (platelet derived growth factor-AB, PDGF-AB)>血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、转化生长因子-β I(transforming growth factor, TGF-β I)和表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)等。细胞外基质将增生的成纤维细胞、间质细胞连接在一起，与多种生长因子形成一个复杂的网络，在时间和空间上相互作用，调节并促进成纤维细胞、间质细胞的增殖、分化和迁移以及血管的生成、组织连接等过程，从而促进组织损伤的修复和伤口的愈合。
[0004]近年来大量动物和临床试验研究显示,纤维蛋白凝胶作为生长因子(如NGF、bFGF、VEGF等)的载体，可稳定生长因子在组织中的生物学活性，保证其缓慢均匀地释放，起到局部刺激细胞增生和组织修复的作用。国内外学者利用细胞培养技术，在体外可控条件下，对生长因子纤维蛋白凝胶和成纤维细胞及组织修复进行了一系列的研究，研究结果表明生长因子凝胶对促进成纤维细胞生长、增殖、分化、迁移具有促进作用。
[0005]根据上述已有的研究基础，我们提出假设:将组织修复过程中关键的多种生长因子与纤维蛋白凝胶结合，建立“多种生长因子复合物纤维蛋白凝胶释放系统”，形成多种生长因子的缓释系统，在一定的时间内持续促进人肺成纤维细胞的增殖、分化、迁移，从而促进肺组织的损伤修复，对难治性气胸的临床治疗具有重要的意义。[0006]以上提及的大多数研究建立的多为单种生长因子凝胶释放系统，仅有少数研究建立了两种生长因子联合凝胶释放系统，且相关资料显示，现有研究多集中在皮肤、软组织、骨骼肌腱、神经组织等领域，尚缺乏对肺实质、间质细胞的增生及肺组织修复作用的研究。故与以往的研究不同，本实验采用纤维蛋白凝胶作为多种生长因子复合物的载体，建立“多种生长因子复合物纤维蛋白凝胶释放系统”，同时利用体外细胞培养技术，拟对生长因子纤维蛋白凝胶释放系统对人胚肺成纤维细胞生长增殖、分化的影响进行研究和探讨。
[0007]难治性气胸的治疗是临床上的一个难题。2003年BTS发布的《自发性气胸处理指南》将自发性气胸引流5~7d后仍持续漏气作为外科干预治疗的时间点，认为延长引流时间对患者无益。外科 手术治疗不但创伤大，费用高，且有肺部基础疾病患者常不能耐受，给社会和家庭带来很大的负担。2003年我们首先在国内报道了采用自体血+凝血酶的方法对目标支气管及所属肺叶肺段进行灌注封堵的成功经验，并于2010年发表相关报道显示难治性气胸封堵成功率达82%，并初步观察到有降低其复发率的趋势。促进肺组织损伤的修复，胸膜破裂口的闭合，是治疗难治性气胸的关键突破口。
[0008]近十年来，为寻找使生长因子持续、发挥生物学作用的途径，国内外学者模拟PRP的构成进行了大量的细胞和临床实验研究，将生长因子(如VEGF、TGF、EGF、PDGF等)与纤维蛋白凝胶结合，建立生长因子凝胶释放系统，缓慢、均匀释放生长因子，起到持续刺激组织真皮成纤维细胞、韧带成纤维细胞、成肌纤维细胞、神经元细胞等增生，从而促进皮肤、骨骼、神经、血管组织的修复的作用。但目前仍缺乏对肺实质、间质细胞的增生及肺组织修复作用的研究。另外已有研究所建立的上述生长因子凝胶释放系统模型多为单种生长因子凝胶释放系统的研究，少数研究建立了两种生长因子释放系统，尚无有关多种生长因子凝胶释放系统模型的研究报道。
【发明内容】
[0009]因此，针对以上内容，本发明提供一种用于促进人胚肺成纤维细胞增殖分化的多种生长因子复合物纤维蛋白凝胶释放系统。
[0010]为达到上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的:用于促进人胚肺成纤维细胞增殖分化的多种生长因子复合物纤维蛋白凝胶释放系统，包括纤维蛋白凝胶释放系统及以之为载体加入其中的四种生长因子，所述四种生长因子为血小板源性生长因子-AB、血管内皮生长因子、转化生长因子-β I及表皮生长因子。
[0011]进一步的改进是:所述多种生长因子复合物纤维蛋白凝胶释放系统的构建方法为:先建立纤维蛋白凝胶释放系统，接着再加入四种生长因子复合物。
[0012]进一步的改进是:所述纤维蛋白凝胶释放系统为碎片状纤维蛋白二维凝胶模型。
[0013]进一步的改进是:所述纤维蛋白凝胶释放系统为岛状纤维蛋白二维凝胶模型。
[0014]进一步的改进是:所述碎片状纤维蛋白二维凝胶模型的建立方法为:取纤维蛋白原溶液与凝血酶混合于无菌培养皿正中央，形成直径为8~IOmm的半球形液滴，于37°C孵育30分钟，形成吸纳为蛋白凝胶后，用无菌手术刀将其平均分成6小块后置于培养皿中，SP得到碎片状纤维蛋白二维凝胶模型。
[0015]进一步的改进是:所述岛状纤维蛋白二维凝胶模型的构建方法为，取纤维蛋白原溶液与凝血酶混合与无菌培养皿正中央，形成直径为8~IOmm的半球形液滴，于37°C孵育30分钟，即得到岛状纤维蛋白二维凝胶模型。
[0016]用于促进人胚肺成纤维线报增殖分化的多种生长因子复合物纤维蛋白凝胶释放系统应用于促进人胚肺成纤维细胞增殖分化的方法:首先对人胚肺成纤维细胞进行培养，其培养方法为:将购买的原代人胚肺成纤维细胞接种于直径IOcm的无菌培养皿中，使用含体积分数10%的胎牛血清的RPMI1640培养基，置于37°C 5%C02培养箱中培养，每3天更换一次培养基，当细胞生长增殖至接近汇合状态时，常规使用0.05%胰蛋白酶进行消化传代，实验选用3-6代成纤维细胞；接着将人胚肺成纤维细胞接种于权利要求1所述的多种生长因子复合物纤维蛋白凝胶释放系统中，进行培养。
[0017]通过采用前述技术方案，本发明的有益效果是:本发明的纤维蛋白凝胶释放系统中含有四种生长因子，即血小板源性生长因子-AB、血管内皮生长因子、转化生长因子-β I及表皮生长因子，本发明以纤维蛋白凝胶释放系统作为四种生长因子复合物的载体，在该多种生长因子复合物纤维蛋白凝胶释放系统中接种人胚肺成纤维细胞，能够有效促进人胚肺成纤维细胞的生长、增殖、分化，人胚肺成纤维细胞的增殖分化可促进肺组织损伤的修复、胸膜破裂口的闭合，对治疗难治性气胸具有重大作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1为本发明实施例中纤维蛋白凝胶全覆盖组的结构示意图；
图2为本发明实施例中纤维原全覆盖组的结构示意图；
图3为本发明实施例中岛状凝胶组的结构示意图；
图4为本发明实施例中碎片状凝胶组的结构示意图；
图5为本发明实施例中不同纤维蛋白凝胶释放系统累计释放曲线图；
图6为本发明实施例中分组结构示意图。
【具体实施方式】
[0019]以下将结合具体实施例来详细说明本发明的实施方式，借此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题，并达成技术效果的实现过程能充分理解并据以实施。
[0020]若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明。
[0021]本发明的实施例为:
参考图1至图5，用于促进人胚肺成纤维细胞增殖分化的多种生长因子复合物纤维蛋白凝胶释放系统，包括纤维蛋白凝胶释放系统及以之为载体加入其中的四种生长因子，所述四种生长因子为血小板源性生长因子-ΑΒ、血管内皮生长因子、转化生长因子-β I及表皮生长因子。
[0022]所述多种生长因子复合物纤维蛋白凝胶释放系统的构建方法为:先建立纤维蛋白凝胶释放系统，接着再加入四种生长因子复合物。
[0023]参考图1至图4，所述纤维蛋白凝胶释放系统有四组，其具体构建方法如下:①取2ml纤维蛋白原溶液于培养皿中平铺，加入凝血酶0.2ml混合均匀，于37°C孵育30分钟，形成纤维蛋白凝胶全覆盖组，之后使用促贴壁剂多聚赖氨酸溶液(0.lmg/ml)铺被覆盖于凝胶表面lh，起到促进细胞贴壁作用，Ih后用PBS适当润洗后可进行细胞培养；②取2ml纤维蛋白原于培养皿平铺均匀后，不加入凝血酶，于37°C孵育30分钟，形成纤维原全覆盖组；③取2ml纤维蛋白原与凝血酶0.2ml混合于无菌培养皿正中央,形成直径约8mm的半球形液滴，于37°C孵育30分钟，为岛状凝胶组；④同③制作方法制作半球形液滴，孵育形成纤维蛋白凝胶后，用无菌手术刀将其平均分成6小块后置于培养皿中，为碎片状凝胶组。
[0024]参考图5，实验结果显示:培养基条件下不同凝胶释放系统释放曲线存在差异:岛状凝胶组与碎片状凝胶组释放曲线无明显统计学差异(P>0.05)，纤维蛋白凝胶全覆盖与岛状、碎片组有明显统计学差异(P〈0.001)，全覆盖组释放高峰落后于岛状组和碎片状组。
[0025]人胚肺成纤维细胞应用于多种生长因子复合物纤维蛋白凝胶释放系统的方法为:首先对人胚肺成纤维细胞进行培养，其培养方法为:将购买的原代人胚肺成纤维细胞接种于直径IOcm的无菌培养皿中，使用含体积分数10%的胎牛血清的RPMI1640培养基，置于370C 5%C02培养箱中培养，每3天更换一次培养基，当细胞生长增殖至接近汇合状态时，常规使用0.05%胰蛋白酶进行消化传代，实验选用3-6代成纤维细胞；接着将人胚肺成纤维细胞接种于上述四组多种生长因子复合物纤维蛋白凝胶释放系统中，进行培养。
[0026]其分组如图6所示。
实验结果:
(I)显微镜下细胞形态观察:接种时人胚肺成纤维细胞表现为圆形形态，悬浮于培养基中，呈不同层次分布。在不同纤维蛋白凝胶释放系统的影响下，细胞伸展贴壁时间及增殖速度存在一定的差别:纤维蛋白凝胶全覆盖组、纤维蛋白原全覆盖组细胞均无贴壁生长，而岛状组、碎片组细胞均贴壁生长 ，形态良好，伸展呈梭形或纺锤状，增殖活跃。(2)细胞分布情况:将培养皿中心点至直径3cm区域定义为凝胶内带，将直径3-6cm区域定义为凝胶中带，直径>6cm区域定义为凝胶外带。凝胶内带细胞生长速度最慢，凝胶外带增殖速度最快，凝胶中带细胞生长情况介于两者之间。随着凝胶的溶解，细胞逐渐向凝胶内带迁移生长，增殖速度逐渐增快。(3)生长因子促进人胚肺成细胞增殖:将生长因子组(A组)和无生长因子组(B组)的岛状凝胶组、碎片状凝胶组及无凝胶对照组(C组)细胞增殖情况进行比较:A组细胞增殖速度明显快于B组，两组细胞生长趋势存在显著统计学差异(P〈0.001)。无凝胶对照组生长因子组(Cl组)细胞生长增殖情况显著优于无生长因子组(C2组)(P〈0.001)。(4)不同凝胶释放系统对细胞影响和促进作用各不相同:不论是生长因子组或无生长因子组，Al、A2、B1、B2组细胞均无贴壁和增殖生长；取3、6、9、12d的细胞计数值及调零后OD值进行对t匕，生长因子组(A组)中各组细胞生长增殖情况比较结果为碎片组明显优于岛状组及无凝胶对照组，岛状组优于正常细胞对照组(P〈0.001);无生长因子组(B组)中，细胞生长增殖情况比较结果为碎片组明显优于岛状组及无凝胶对照组，但无凝胶对照细胞组生长增殖情况优于岛状组(P〈0.001)。(5)细胞增殖情况评估细胞计数板计数法和MTT法测得OD值存在一定线性关系，并呈正相关关系(生长因子组:岛状组r=0.929，P〈0.001 ;碎片组r=0.863，P〈0.001 ;无凝胶对照组r=0.716，P〈0.005。无生长因子组:岛状组r=0.706，P〈0.005 ;碎片组 r=0.423，Ρ〈0.05 ;无凝胶对照组 r=0.512，Ρ〈0.05)。
[0027]本发明多种生长因子复合物(PDGF、TGF、VEGF、EGF)纤维蛋白凝胶释放系统具有促进人胚肺成纤维细胞生长、增殖、分化的作用。岛状和碎片状纤维蛋白二维凝胶模型均可作为生长因子的载体，并稳定其生物学活性，保证缓慢、有效地释放，持续促进人胚肺成纤维细胞增殖。碎片纤维蛋白凝胶二维模型对人胚肺成纤维细胞增殖促进作用明显优于岛状纤维蛋白凝胶二维模型，更有利于细胞的生长、增殖、分化。
[0028]本发明的纤维蛋白凝胶释放系统中含有四种生长因子，即血小板源性生长因子-AB、血管内皮生长因子、转化生长因子-β I及表皮生长因子，本发明以纤维蛋白凝胶释放系统作为四种生长因子复合物的载体，在该多种生长因子复合物纤维蛋白凝胶释放系统中接种人胚肺成纤维细胞，能够有效促进人胚肺成纤维细胞的生长、增殖、分化，人胚肺成纤维细胞的增殖分化可促进肺组织损伤的修复、胸膜破裂口的闭合，对治疗难治性气胸具有重大作用。
[0029]本发明中，实验细胞:人胚肺成纤维细胞(human embryonic lung fibroblast,HELF) 2株，由上海复祥科技有限公司提供的美国菌种保藏中心(American Type CultureCollection，ATCC)细胞株。人重组生长因子PDGF-AB、TGF-β 1、VEGF165、EGF购买于美国R&D Systems公司，人纤维蛋白原(纯度>90%)购买于上海莱士有限公司，人凝血酶购买于美国Sigma公司，L-多聚赖氨酸购买于美国Sigma公司，RPMI1640培养基购买于美国Hyclone公司，胎牛血清购买于美国Hyclone公司，磷酸缓冲溶液购买于美国Hyclone公司。
[0030]以上所记载，仅为利用本创作技术内容的实施例，任何熟悉本项技艺者运用本创作所做的修饰、变化 ，皆属本创作主张的专利范围，而不限于实施例所揭示者。
【权利要求】
1.一种用于促进人胚肺成纤维细胞增殖分化的多种生长因子复合物纤维蛋白凝胶释放系统，其特征在于:包括纤维蛋白凝胶释放系统及以之为载体加入其中的四种生长因子，所述四种生长因子为血小板源性生长因子-AB、血管内皮生长因子、转化生长因子-β I及表皮生长因子。
2.根据权利要求1所述的用于促进人胚肺成纤维细胞增殖分化的多种生长因子复合物纤维蛋白凝胶释放系统，其特征在于:所述多种生长因子复合物纤维蛋白凝胶释放系统的构建方法为:先建立纤维蛋白凝胶释放系统，接着再加入四种生长因子复合物。
3.根据权利要求2所述的用于促进人胚肺成纤维细胞增殖分化的多种生长因子复合物纤维蛋白凝胶释放系统，其特征在于:所述纤维蛋白凝胶释放系统为碎片状纤维蛋白二维凝胶模型。
4.根据权利要求2所述的用于促进人胚肺成纤维细胞增殖分化的多种生长因子复合物纤维蛋白凝胶释放系统，其特征在于:所述纤维蛋白凝胶释放系统为岛状纤维蛋白二维凝胶模型。
5.根据权利要求3所述的用于促进人胚肺成纤维细胞增殖分化的多种生长因子复合物纤维蛋白凝胶释放系统，其特征在于:所述碎片状纤维蛋白二维凝胶模型的建立方法为:取纤维蛋白原溶液与凝血酶混合于无菌培养皿正中央，形成直径为8~IOmm的半球形液滴，于37°C孵育30分钟，形成吸纳为蛋白凝胶后，用无菌手术刀将其平均分成6小块后置于培养皿中，即得到碎片状纤维蛋白二维凝胶模型。
6.根据权利要求4所述的用于促进人胚肺成纤维细胞增殖分化的多种生长因子复合物纤维蛋白凝胶释放系统，其特征在于:所述岛状纤维蛋白二维凝胶模型的构建方法为，取纤维蛋白原溶液与凝血酶混合与无菌培养皿正中央，形成直径为8~IOmm的半球形液滴，于37°C孵育30分钟，即得到岛状纤维蛋白二维凝胶模型。
7.用于促进人胚肺成纤维细胞增殖分化的多种生长因子复合物纤维蛋白凝胶释放系统应用于促进人胚肺成纤维细胞增殖分化的方法，其特征在于:首先对人胚肺成纤维细胞进行培养，其培养方法为:将购买的原代人胚肺成纤维细胞接种于直径IOcm的无菌培养皿中，使用含体积分数10%的胎牛血清的RPMI1640培养基，置于37°C 5%C02培养箱中培养，每3天更换一次培养基，当细胞生长增殖至占培养皿面积80~90%时，常规使用0.05%胰蛋白酶进行消化传代，实验选用3-6代成纤维细胞；接着将人胚肺成纤维细胞接种于权利要求1所述的多种生长因子复合物纤维蛋白凝胶释放系统中，进行培养。
【文档编号】C12N5/073GK104004709SQ201410185814
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年5月5日 优先权日:2014年5月5日
【发明者】曾奕明, 施丽泳, 黄琳琳 申请人:曾奕明