鸭肝炎病毒i型vp1蛋白抑制肽及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种鸭肝炎病毒I型VP1蛋白抑制肽及其应用，属于动物病毒分子生物学【技术领域】。本发明通过基因工程方法获得DHV-1VP1蛋白，并以DHV-1VP1蛋白作为靶标，利用噬菌体随机12肽库筛选得到与DHV-1VP1特异性结合的抑制肽，其氨基酸序列为：LLADTTHHRPWT。试验证明，鸭肝炎病毒I型VP1蛋白抑制肽能抑制DHV-1在鸭胚成纤维细胞的增殖，在不同浓度下均能显著下调DHV-1在鸭胚成纤维细胞中的病毒拷贝数，同时显著降低DHV-1在鸭胚成纤维细胞中的病毒滴度，可用于制备抗鸭肝炎病毒病药物或饲料添加剂，在DHV-1的防治中具有良好的应用前景。
【专利说明】鸭肝炎病毒I型VP1蛋白抑制肽及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种鸭肝炎病毒I型VP1蛋白抑制肽，同时还涉及该抑制肽的应用，属 于动物病毒分子生物学【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 鸭病毒性肝炎，又称"背脖病"，是由鸭肝炎病毒（DHV)引起雏鸭肝脏损伤的一种 急性、高致病性传染病，其特征为发病急、传播快、死亡率高，临床表现为病鸭精神沉郁，出 现神经症状，运动失调，呈角弓反张，主要病理变化为肝炎和出血。鸭病毒性肝炎最先在美 国发现，并用鸡胚分离到病毒，之后在英国、加拿大、德国等许多养鸭国家陆续发现。我国大 部分省市和地区亦有该病的发生。鸭病毒性肝炎主要通过接触传播，经呼吸道亦可感染，据 推测不发生与蛋的传递。该病主要发生在3周龄以下的雏鸭，尤其对1周龄的雏鸭具有极 强的致死性，病死率高达95%，且一年四季均可发生，并呈现不断上升的趋势，已对养鸭业 造成巨大的经济损失，严重制约了养鸭业的发展。
[0003] 鸭肝炎病毒（Duck hepatitis virus，DHV)在分类上属微RNA病毒科，长20? 40nm，病毒对氯仿、乙醚、胰蛋白酶和pH>3.0均有抵抗力，对热敏感，62°C 30min即被灭活， 大多数消毒药如福尔马林、氢氧化钠、漂白粉均可使其灭活。病毒在低温环境中能较长时间 存活，在4°C条件下可存活2年以上，在-20°C则可长达9年。通常将DHV分为3个血清型， 即1型（DHV-1)、2型（DHV-2)和3型（DHV-3)，其中DHV-1呈世界性分布。在我国，自1958 年发生鸭病毒性肝炎至2001年，DHV的血清型均为1型。但近几年来，国内外不少学者已 从发病鸭群中分离得到新型DHV-1毒株，新型DHV-1与以往分离的DHV-1在序列上存在显 著差异，且新型DHV-1均不与DHV-1产生交叉反应。为了更清楚地区分上述DHV-1毒株，国 内学者根据进化分析结果将1型鸭肝炎病毒分为3个基因型（A、B和C型），分别对应于以 往分离的血清1型、台湾新型和韩国新型。
[0004] 近年来，我国已有多例DHV-Ι的报道。DHV-Ι作为小RNA病毒科成员，其衣壳蛋白 VP1是主要的保护性蛋白，编码主要的抗原位点并具有主要的型特异性中和位点，同时具有 与细胞受体结合的功能，是病毒感染细胞的关键，也是研究病毒与宿主细胞相互作用的首 选蛋白。
[0005] 噬菌体展示技术是近年来兴起的一项研究蛋白质分子间相互作用的有效手段，由 于其具有快捷、高效、表型和基因型一致等特点，近年来被广泛应用于肽类药物、抑制肽、抗 原模拟表位的筛选等研究领域。因此，利用噬菌体展示技术筛选DHV-1VP1蛋白特异性结合 的多肽，并研究该多肽对DHV-1在鸭胚成纤维细胞增殖方面的影响。可为DHV-1的防治提 供一个新的途径。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种鸭肝炎病毒I型VP1蛋白抑制肽。
[0007] 同时，本发明还提供一种鸭肝炎病毒I型VP1蛋白抑制肽的应用。
[0008] 为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：
[0009] 鸭肝炎病毒I型VP1蛋白抑制肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0010] 所述鸭肝炎病毒I型为基因 C型鸭肝炎病毒I型。
[0011] 鸭肝炎病毒I型VP1蛋白抑制肽的应用，具体为VP1蛋白抑制肽在制备抗鸭肝炎 病毒病（抑制鸭肝炎病毒增殖，如抑制鸭肝炎病毒I型在鸭胚成纤维细胞增殖）的药物或 饲料添加剂中的应用。
[0012] 本发明的有益效果：
[0013] 本发明通过基因工程方法获得DHV-1VP1蛋白，并以DHV-1VP1蛋白作为靶标， 利用噬菌体随机12肽库筛选得到与DHV-1VP1特异性结合的抑制肽，其氨基酸序列为： LLADTTHHRPWT，可抑制DHV-1在鸭胚成纤维细胞的增殖。荧光定量PCR和TCID50检测VP1 抑制肽对DHV-1在鸭胚成纤维细胞增殖的影响，结果显示，不同浓度的抑制肽（0. 02 μ g/ mL、0. 2 μ g/mL、2 μ g/mL、20 μ g/mL)均能显著下调DHV-1在鸭胚成纤维细胞中的病毒拷贝 数，同时显著降低DHV-1在鸭胚成纤维细胞中的病毒滴度。结果表明，鸭肝炎病毒I型VP1 蛋白抑制肽能抑制DHV-1在鸭胚成纤维细胞的增殖，在DHV-1的防治中具有良好的应用前 旦 -5^ 〇
【专利附图】
【附图说明】
[0014] 图1为本发明实施例1中VP1基因的PCR扩增及重组表达质粒pET32a-VPl的鉴 定图谱；
[0015] 图2为实施例1中重组VP1蛋白SDS-PAGE电泳及Western-blot分析；
[0016] 图3为实施例1中ELISA检测噬菌体展示肽对靶分子的结合活性；
[0017] 图4为实施例1中噬菌体阳性克隆竞争抑制试验结果；
[0018] 图5为试验例中DHV-1VP1蛋白抑制肽对鸭胚成纤维细胞增殖的影响；
[0019] 图6为试验例中抑制肽对DHV-1在鸭胚成纤维细胞增殖的影响（Real time PCR);
[0020] 图7为试验例中抑制肽对DHV-1在鸭胚成纤维细胞增殖的影响（TCID50)。
【具体实施方式】
[0021] 下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
[0022] 实施例1
[0023] 本实施例中鸭肝炎病毒I型VP1蛋白抑制肽的筛选，包括以下步骤：
[0024] (l)DHV-lVPl 蛋白的制备
[0025] 1)表达载体pET32a_VPl的构建
[0026] 根据GenBank发表的DHV-1的VP1基因序列（序列号：EF653378)，利用DNAStar软 件分析，设计一对特异性引物，引物F15'端引入EcoR I限制性酶切位点，F25'端引入Xba I限制性酶切位点。引物由大连宝生物工程公司合成。
[0027] 引物序列如下：
[0028] Fl:5,-CCAGAATTCGGTGATTCTAACCAG-3'（如 SEQ ID N0:2 所示）；
[0029] F2:5, -GTTTCTAGATTCAATTTCCAG-3'（如 SEQ ID NO. 3)。
[0030] 鸭肝炎病毒I型VJ株已知从发病鸭场分离，通过序列测定和进化分析，确定为I 型鸭肝炎病毒，其基因型为C型（序列号：EF653378)。参照病毒RNA提取试剂盒（南京 Tiangen有限公司）操作步骤，常规方法提取VJ-DHV-1株RNA，通过常规反转录PCR获取 VP1蛋白的基因全长序列（Invitrogen-步法RT-PCR试剂盒）。将获取的VP1基因克隆 入PMD18-T载体并进行序列测定，将pMD18-T载体上的目的片段酶切后克隆入pET32a载 体，构建重组表达质粒pET32a-VPl，并用EcoR I与Xba I双酶切和PCR进行鉴定，以酶切 出现714bp左右大小DNA片段的质粒为阳性质粒（见图1，图中泳道1为DL2000Marker ;泳 道2为VP1基因的PCR扩增产物；泳道3为pET32a-VPl/EcoR I、Xba I双酶切；泳道4为 DL15000Marker)，鉴定阳性的质粒即为重组表达质粒pET32a_VPl，送上海Invitrongen公 司测序。采用CaCl 2转化法，将重组质粒pET32a-VPl转化入大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细 胞中，筛选阳性克隆，即为基因工程菌株。
[0031] 2)重组表达质粒pET32a_VPl的诱导表达与纯化
[0032] 将阳性重组表达质粒pET32a-VPl及空白载体pET32a(+)分别转化BL21 (DE3)感 受态细胞。阳性质粒菌于37°C培养，待A_值达到0. 5时（0. 4?0. 6均可），加 IPTG至终 浓度为〇. 8mM，进行诱导表达。表达产物诱导3h即可产生分子量约为43KD的目的条带（见 图2,图中泳道1为低分子蛋白Marker ;泳道2为大肠杆菌BL21 (重组质粒pET32a-VPl)诱 导表达产物；泳道3为大肠杆菌BL21 (空质粒pET32a)诱导表达产物）。收集不同诱导时 间表达的菌体，超声波破碎，离心后分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳，并以鸭抗DHV-1 血清为一抗，HRP标记的兔抗鸭IgG为二抗对表达产物进行Western blot分析，最后用DAB 显色试剂盒显色，在醋酸纤维素膜上可见目的条带（见图2,图中泳道4为重组VP1蛋白 Western-blot结果；泳道5为大肠杆菌BL21 (空质粒pET32a)诱导表达产物Western-blot 结果）。将诱导表达的菌液于12, OOOrmp离心10min收获沉淀，以洗涤液（5mM咪唑，0. 5M NaCl，20mM Tris-HCl，pH7. 9)重悬菌体后，经超声波裂解10min，随后12, OOOrmp离心10min 收获包涵体沉淀和上清，经SDS-PAGE电泳鉴定表达产物主要以可溶性表达。将此上清用 蛋白质Ni柱亲和层析进行纯化，具体操作过程参照Novagen公司His · bind purification kit说明书，VP1表达蛋白经镍柱纯化后，即获得DHV-1VP1蛋白。
[0033] (2)噬菌体随机12肽库的亲和筛选
[0034] 1)包被纯化的DHV-1VP1蛋白
[0035] 将上述基因工程表达的VP1蛋白以TBS稀释为10μ g/mL，取稀释后的VP1蛋白包 被酶标板，100 μ L/孔，放置湿盒中4°C过夜；次日倾弃包被液，加入含0.05 % Tween20的 TBST洗涤3次（每次静置3min)，扣干，然后以含5 %脱脂奶粉的TBS按100 μ L/孔加入各 孔，置湿盒中37°C封闭2h ;倾弃封闭液，以含0. 05% Tween20的TBST溶液洗涤3次，叩干， 将包被好的酶标板封口，于4°C保存待用。
[0036] 2)亲和筛选
[0037] 以TBST稀释原始文库（购于美国New England Biolabs，NEB公司）至 1 X 10npfu/mL，取稀释后的文库液100 μ L加入到预先包被VP1蛋白的酶标板孔内，放 置湿盒中4 °C过夜。次日弃孔内液，并用TBST清洗10次，向微孔中加入100 μ L0. 2Μ Glycine-HCl (ρΗ2. 2)，于室温温和摇动10min，洗脱液吸入另一干净微量离心管中，加入 15 μ L1M Tris-HCl (ρΗ9· 1)中和上述洗脱液。测定少量（?1 μ L)洗脱物的滴度，剩余洗脱 物加入到20mL ER2738培养物中（菌体应当处于对数前期），37°C剧烈摇动培养4. 5h。将 培养物转入离心管中，4°C 12,000rpm离心lOmin。上清液转入另一离心管中，再离心。取 80%上清转入新管中，加入1/6体积的PEG/NaCl，4°C沉淀过夜。次日，4°C 12, OOOrpm离心 PEG沉淀15min。弃上清，再短暂离心，弃去残留上清。沉淀物重悬于lmL TBS中，悬液转入 微量离心管中，4°C离心5min使残余细胞沉淀。上清转入另一新鲜微量离心管，用1/6体积 的TOG/NaCl再沉淀。冰上孵育30min(15?60min均可）。4°C离心lOmin，弃上清，再短暂 离心，用微量移液器吸弃残余上清。沉淀物重悬于200 μ L TBS，0. 02% NaN3中。离心lmin， 沉淀任何残余的不溶物。上清转入新的离心管中，即为第一轮扩增后的噬菌体洗脱物。根 据常规M13方法用LB/IPTG/Xgal平板测定扩增后洗脱物的滴度。将第一轮扩增后的噬菌 体液以TBS稀释为lX10 npfu/mL，取lOOyL加入到预先包被VP1蛋白的酶标板孔中进行 第二轮筛选，371：温育211，弃孔内液，并用含0.05%1'肌^1120的了851'溶液清洗10次，同上 进行筛选后噬菌体的扩增和滴度的测定，重复以上步骤进行第三轮筛选。
[0038] 在筛选过程中，将每轮投入筛选的噬菌体量记为Input、洗脱得到的噬菌体量记为 Output,分析比较每轮产出/投入比（Input/Output)情况，来反映特异性结合噬菌体的富 集程度。经过3轮筛选发现：淘选获得的噬菌体越来越多，特异性越来越强，其中第三轮噬 菌体滴度为2. 5X 106pfu/mL。噬菌体产出投入比逐轮提高（见下表1)，表明具有特异性结 合作用的噬菌体显示较好的富集效果。
[0039] 表1三轮亲和筛选对噬菌体的富集
[0040]
【权利要求】
1. 鸭肝炎病毒I型VP1蛋白抑制肽，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示。
2. -种如权利要求1所述的鸭肝炎病毒I型VP1蛋白抑制肽的应用，其特征在于：所 述鸭肝炎病毒I型VP1蛋白抑制肽在制备抗鸭肝炎病毒病的药物或饲料添加剂中的应用。
3. 根据权利要求2所述的鸭肝炎病毒I型VP1蛋白抑制肽的应用，其特征在于：所述 鸭肝炎病毒I型VP1蛋白抑制肽在制备抑制鸭肝炎病毒在鸭胚成纤维细胞增殖的药物或饲 料添加剂中的应用。
【文档编号】A23K1/16GK104193803SQ201410360330
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年7月25日 优先权日:2014年7月25日
【发明者】王臣, 何雷, 李小康, 牛明媚, 张春杰 申请人:河南科技大学