与具有c端元件的肽和蛋白相关的方法和组合物的制作方法

专利名称：与具有c端元件的肽和蛋白相关的方法和组合物的制作方法
技术领域：
本发明在广义上涉及分子医学领域，更具体而言，涉及细胞和组织穿透肽。
背景技术：
可内化至细胞中的肽主要是指细胞穿透肽。主要有两类这种肽疏水型和阳离 子型(Zorko and Langel，2005)。阳离子型肽通常用于将核酸、蛋白导入细胞中，其包括 原型的细胞穿透肽 Tat和 penetratin (Meade and Dowdy，2007 ； Derossietal., 1998)。疱疹 病毒蛋白VP22能够进入细胞及离开细胞，并且能够随其携带负载(Elliott and O’ Hare, 1997； Brewis etal., 2003)。这些肽作为递送载体的主要局限是它们是非选择性的；它们 可进入所有细胞。可以使用对一种细胞类型或组织特异性更高的可活化递送体系。细胞穿透递送载体在许多方面都很重要。首先，内化可以改善靶向作用，这是 因为肽及其负载内化至细胞可使得归巢更有效(Christian et al.，2003 ； Laakkonen et al.， 2004 ； Weissleder at al.，1995)。第二，细胞穿透靶向元件可将负载带进细胞质中，这在 例如基于核酸递送的疗法中是至关重要的。第三，细胞穿透性质与离开能力可以增加外 渗和组织扩散。对于将组合物递送至细胞而言，组织穿透是严重限制因素。荧光素标记肽的 分布与以相同肽涂覆的氧化铁颗粒的分布的比较结果显示，所述颗粒保持在肿瘤血管近 处，而荧光肽则到达肿瘤的所有区域。经常引述的肿瘤血管“渗漏”似乎不能在本质上 缓解该问题。而且，抗血管生成治疗可造成肿瘤血管的“正常化”(Jain，2005)，由此 需要靶向血管未渗漏的肿瘤。因此，重要的是寻求能改善不同组合物到达血管外空间的 通道的新方法。已知大量蛋白可透过血管内皮，包括血脑屏障。一个主要实例为运铁蛋 白，它被运铁蛋白受体携带通过血脑屏障。该体系已被用于将其他负载带入脑中(Liet al., 2002 ； Fenart and Cecchelli, 2003)。可介导组合物从循环系统转位至组织中的用于 内皮转胞吞的肽信号物是有用的。因此，需要新的治疗策略，用于选择性靶向不同细胞类型，用于将蛋白和肽内 化至这些细胞中以及用于蛋白和肽的组织穿透。本发明通过提供可以被不同细胞类型选 择性靶向及选择性内化并且/或者可穿透组织的肽而满足该要求。本发明还提供了相关 的优点。

发明内容
公开了 CendR元件以及包含CendR元件的蛋白和肽。还公开了如下CendR缀合 物其包含共价偶联于或非共价缔合于包含一个CendR元件的蛋白或肽的运载组合物。 还公开了如下CendR缀合物其包含共价偶联于或非共价缔合于一种包含所选择的氨基 酸序列的蛋白或肽的运载组合物，其中所述氨基酸序列包含一个CendR元件。所述运载 组合物可以偶联或缔合于所述蛋白或肽的所述CendR元件的N端侧。还公开了可活化的CendR元件和包含可活化的CendR元件的蛋白和肽。还公开 了如下可活化的CendR缀合物其包含共价偶联于或非共价缔合于包含可活化的CendR 元件的蛋白或肽的运载组合物。还公开了如下可活化的CendR缀合物其包含共价偶联 于或非共价缔合于一种包含所选择的氨基酸序列的蛋白或肽的运载组合物，其中所述氨 基酸序列包含可活化的CendR元件。所述运载组合物可以偶联或缔合于所述蛋白或肽的 所述可活化CendR元件的N端侧。还公开了通过这样的方法制备的CendR缀合物，即该方法包括使一种运载组合 物共价偶联于或非共价缔合于一种包含CendR元件的蛋白或肽，其中所述运载组合物偶 联或缔合于所述蛋白或肽的所述CendR元件的N端侧。还公开了通过这样的方法制备的 CendR缀合物，即该方法包括使一种运载组合物共价偶联于或非共价缔合于一种包含所 选择的氨基酸序列的蛋白或肽，其中所述氨基酸序列包含C端元件，其中所述运载组合 物偶联或缔合于所述蛋白或肽的所述CendR元件的N端侧。还公开了通过这样的方法制 备的CendR缀合物，即该方法包括(a)选择一种氨基酸序列用于内化至细胞中和/或穿透 组织，其中所述氨基酸序列包含C端元件，以及(b)使一种运载组合物共价偶联于或非共 价缔合于包含所述选择的氨基酸序列的蛋白或肽，其中所述运载组合物偶联或缔合于所 述蛋白或肽的所述CendR元件的N端侧。所述CendR缀合物可以包含所述蛋白或肽以及 所述偶联或缔合的运载组合物。还公开了通过这样的方法制备的可活化的CendR元件，即该方法包括使一个封 闭基团共价偶联于一个CendR元件，其中偶联所述封闭基团和所述CendR元件的键是可 切割的。还公开了通过这样的方法制备的可活化的CendR元件，即该方法包括使一个封 闭基团共价偶联于一条氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含一个CendR元件，其中偶 联所述封闭基团和所述CendR元件的键是可切割的。还公开了通过这样的方法制备的可 活化的CendR元件，即该方法包括(a)选择一种氨基酸序列用于内化至细胞中和/或穿透 组织，其中所述氨基酸序列包含CendR元件，以及(b)使一个封闭基团共价偶联于所述 CendR元件，其中偶联所述封闭基团和所述CendR元件的键是可切割的。共价偶联于所 述CendR元件的所述封闭基团可减少或阻止细胞内化和/或组织穿透。与无封闭基团的 相同CendR元件相比，共价偶联于所述CendR元件的所述封闭基团可减少或阻止细胞内 化和/或组织穿透。所述可活化的CendR元件可以包含所述选择的氨基酸序列和所述封 闭基团。在所述蛋白或肽中存在所述CendR元件时，所述蛋白或肽可以内化至细胞中/ 或穿透组织，但在所述蛋白或肽中不存在所述CendR元件时，所述蛋白或肽不内化至细 胞中及/或穿透组织。在所述蛋白或肽中存在所述选择的氨基酸序列时，所述蛋白或肽可以内化至细胞中及/或穿透组织，但在所述蛋白或肽中不存在所述选择的氨基酸时， 所述蛋白或肽不内化至细胞中及/或穿透组织。所述CendR元件可以不与所述运载组合 物缔合而内化至细胞中并/或可以穿透组织。所述选择的氨基酸序列可以不与所述运载 组合物缔合而内化至细胞中并/或可以穿透组织。所述CendR元件可以是所述蛋白或肽 中仅有的功能性内化元件，所述CendR元件可以是所述蛋白或肽中仅有的功能性组织穿 透元件，或者所述CendR元件可以是所述蛋白或肽中仅有的功能性内化元件和功能性组 织穿透元件。所述选择的氨基酸序列可以是所述蛋白或肽中仅有的功能性内化元件，所 述选择的氨基酸序列可以是所述蛋白或肽中仅有的功能性组织穿透元件，或者所述选择 的氨基酸序列可以是所述蛋白或肽中仅有的功能性内化元件和功能性组织穿透元件。所 述CendR元件可以是所述CendR缀合物中仅有的功能性内化元件，所述CendR元件可 以是所述CendR缀合物中仅有的功能性组织穿透元件，或者所述CendR元件可以是所 述CendR缀合物中仅有的功能性内化元件和功能性组织穿透元件。所述选择的氨基酸序 列可以是所述CendR缀合物中仅有的功能性内化元件，所述选择的氨基酸序列可以是所 述CendR缀合物中仅有的功能性组织穿透元件，或者所述选择的氨基酸序列可以是所述 CendR缀合物中仅有的功能性内化元件和功能性组织穿透元件。所述CendR元件可以是可活化的CendR元件。所述CendR元件可以是蛋白酶 可活化的CendR元件。所述蛋白或肽可以为环形(圆形)或者可以含有环。所述CendR 元件可位于所述蛋白或肽的C末端。所述CendR元件可以包含末端羧基。可以将一个 封闭基团偶联于所述末端羧基。选择偶联所述封闭基团和所述末端羧基的键以便可被存 在于目的细胞附近的蛋白酶切割。所述封闭基团可以偶联于所述CendR元件的C端氨基 酸。所述封闭基团可以偶联于所述CendR元件C端氨基酸之外的所述CendR元件的氨基 酸。运载组合物可以共价偶联于或非共价缔合于一种包含所选择的氨基酸序列的蛋 白或肽，其中所述氨基酸序列可以包含CendR元件。所述运载组合物可以偶联或缔合于 所述蛋白或肽，例如位于所述CendR元件的N端侧。所述运载组合物可以为例如应用 于治疗或诊断的纳米颗粒、分子或分子复合物。可以通过CendR元件靶向的治疗性运载 组合物包括但不限于纳米颗粒、分子、分子复合物、抗血管生成剂、促血管生成剂、癌 症化学治疗剂、细胞毒剂、促细胞存活剂、细胞分化剂、神经保护剂、免疫调节剂、抗 炎剂、抗关节炎剂、抗病毒剂或它们的结合。可以通过CendR元件靶向的诊断性运载组 合物包括但不限于纳米颗粒、分子、分子复合物、MRI显象剂、放射显象剂、光学显象 剂、分子标签(例如生物素)、荧光团、表位标签(例如，它可以用特异性分子测定来检 测)或它们的结合。所述运载组合物可以包含归巢序列。所述运载组合物可以选择性地 归巢于肿瘤或其他靶组织。所述运载组合物可以选择性地归巢于肿瘤或其他靶组织的血 管。还公开了形成CendR缀合物的方法，所述方法包括使一种运载组合物共价偶联 于或非共价缔合于包含CendR元件的蛋白或肽，其中所述运载组合物偶联或缔合于所述 蛋白或肽的所述CendR元件的N端侧。还公开了形成CendR缀合物的方法，所述方法 包括使一种运载组合物共价偶联于或非共价缔合于一种包含所选择的氨基酸序列的蛋白 或肽，其中所述氨基酸序列包含CendR元件，其中所述运载组合物偶联或缔合于所述蛋白或肽的所述CendR元件的N端侧。还公开了形成CendR缀合物的方法，所述方法包 括(a)选择一种氨基酸序列用于内化至细胞中和/或穿透组织，其中所述氨基酸序列包含 CendR元件，以及(b)使一种运载组合物共价偶联于或非共价缔合于一种包含所述选择的 氨基酸序列的蛋白或肽，其中所述运载组合物偶联或缔合于所述蛋白或肽的所述CendR 元件的N端侧。所述CendR缀合物可以包含所述蛋白或肽以及所述偶联或缔合的运载组 合物。还公开了将运载组合物递送至细胞的方法，所述方法包括将所述细胞暴露于一 种CendR缀合物，其中所述CendR元件包含共价偶联于或非共价缔合于一个CendR元件 的运载组合物，其中所述CendR缀合物然后可以进入所述细胞，从而将所述运载组合物 递送至所述细胞。还公开了将运载组合物递送至细胞的方法，所述方法包括将所述细胞 暴露于一种CendR缀合物，其中所述CendR元件包含一种共价偶联于或非共价缔合于一 种包含CendR元件的蛋白或肽的运载组合物，其中所述CendR缀合物然后可以进入所述 细胞，从而将所述运载组合物递送至所述细胞。还公开了将运载组合物递送至细胞的方 法，所述方法包括(a)将一个CendR元件偶联于所述运载组合物，从而形成一种CendR 缀合物；以及(b)将所述细胞暴露于所述CendR缀合物，其中所述CendR缀合物然后可 以进入所述细胞，从而将所述运载组合物递送至所述细胞。还公开了鉴定能内化CendR元件的细胞的方法，所述方法包括(a)将一种细胞暴 露于一个CendR元件，以及(b)确定所述CendR元件是否被内化。还公开了鉴定一种癌 细胞作为基于CendR的疗法的候选物的方法，所述方法包括(a)将所述癌细胞暴露于一个 CendR元件，以及(b)确定所述CendR元件是否被所述癌细胞内化，其中内化的CendR 元件将所述癌细胞鉴定为基于CendR的疗法的候选物。所述细胞可以在一个测定中。所 述CendR元件可以偶联于一种蛋白或肽。所述CendR元件可以是可活化的CendR元件。 所述可活化的CendR元件可以在暴露于所述细胞之前活化。所述可活化的CendR元件可 以是蛋白酶可活化的CendR元件。所述蛋白或肽可以是环形的。所述CendR元件可以 位于所述蛋白或肽的C末端。还公开了鉴定可以被CendR元件穿透的组织的方法，所述方法包括(a)将一种组 织暴露于一个CendR元件，以及(b)确定所述CendR元件是否穿透所述组织。还公开了 鉴定一种肿瘤作为基于CendR的疗法的候选物的方法，所述方法包括(a)将来自所述肿 瘤的细胞暴露于一个CendR元件，以及(b)确定所述CendR元件是否被所述细胞内化， 其中内化的CendR元件将所述肿瘤鉴定为基于CendR的疗法的候选物。还公开了鉴定一 种肿瘤作为基于CendR的疗法的候选物的方法，所述方法包括(a)将所述肿瘤暴露于一 个CendR元件，以及(b)确定所述CendR元件是否穿透所述肿瘤，其中穿透的CendR元 件将所述肿瘤鉴定为基于CendR的疗法的候选物。所述肿瘤可以在一个测定中。所述 CendR元件可以偶联于蛋白或肽。所述CendR元件可以是可活化CendR元件。所述可 活化的CendR元件可以在暴露于所述肿瘤之前活化。所述可活化的CendR元件可以是蛋 白酶可活化的CendR元件。所述蛋白或肽可以是环形的。所述CendR元件可以位于所 述蛋白或肽的C末端。还公开了产生可以在目的细胞附近被活化的可活化CendR元件的方法，所述 方法包括形成一个可活化的CendR元件，其中将一个封闭基团经可切割键偶联于一个CendR元件，其中所述可切割键可被存在于目的细胞附近的酶切割。所述细胞可以在受 试者中。可以鉴定存在于目的细胞附近的酶。可以在形成所述可活化的CendR元件之 前，鉴定存在于目的细胞附近的酶。可以基于存在于目的细胞附近的酶选择所述可切割 键。可以在形成所述可活化放入CendR元件之前选择所述可切割键。所述CendR元件 可以包含末端羧基，其中所述封闭基团偶联于所述末端羧基。还公开了形成可活化的CendR元件的方法，所述方法包括使一个封闭基团共价 偶联于一个CendR元件，其中偶联所述封闭基团和所述CendR元件的键是可切割的。还 公开了形成可活化的CendR元件的方法，所述方法包括使一个封闭基团共价偶联于一条 氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含一个CendR元件，其中偶联所述封闭基团和所述 CendR元件的键是可切割的。还公开了形成可活化的CendR元件的方法，所述方法包括 (a)选择一种氨基酸序列用于内化至细胞中和/或穿透组织，其中所述氨基酸序列包含一 个CendR元件，以及(b)使一个封闭基团共价偶联于所述CendR元件，其中偶联所述封 闭基团和所述CendR元件的键是可切割的。共价偶联于所述CendR元件的所述封闭基团 可减少或阻止细胞内化和/或组织穿透。与无封闭基团的相同CendR元件相比，共价偶 联于所述CendR元件的所述封闭基团可以减少或阻止细胞内化和/或组织穿透。所述可 活化的CendR元件可以包含所述选择的氨基酸序列和所述封闭基团。所述细胞可以在受 试者中。可以鉴定存在于目的细胞附近的酶。可以在形成所述可活化CendR元件之前鉴 定存在于目的细胞附近的酶。可以基于存在于目的细胞附近的酶选择所述可切割键。可 以在形成所述可活化CendR元件之前选择所述可切割键。所述CendR元件可以包含末端 羧基，其中所述封闭基团偶联于所述末端羧基。运载组合物可以共价偶联于或非共价缔 合于一种包含所述选择的氨基酸序列的蛋白或肽。所述运载组合物可以偶联或缔合于所 述蛋白或肽的所述CendR元件的N端侧。本文公开了一种形成CendR缀合物的方法，所述方法包括选择一种氨基酸序列 用于内化至细胞中，其中所述氨基酸序列包含C端元件；以及使一种运载组合物共价偶 联于或非共价缔合于一种包含所述选择的氨基酸序列的蛋白或肽，其中所述选择的氨基 酸序列位于所述蛋白或肽的C末端，其中所述CendR缀合物包含所述蛋白或肽以及所述 偶联或缔合的运载组合物。公开了一种制备CendR缀合物的方法，包括(a)选择一种氨基酸序列用于内化 至细胞中，其中所述氨基酸序列包含一个C端元件，(b)使一种运载组合物共价偶联于或 非共价缔合于一种包含所述选择的氨基酸序列的蛋白或肽，其中所述选择的氨基酸序列 位于所述蛋白或肽的C末端，其中所述CendR缀合物包含所述蛋白或肽以及所述偶联或 缔合的运载组合物。还公开了一种将运载组合物递送至细胞的方法，所述方法包括(a)将一个 CendR元件偶联于所述运载组合物，从而形成一种CendR缀合物；以及(b)将所述细胞 暴露于所述CendR缀合物，其中所述CendR缀合物然后可以进入所述细胞，从而将所述 运载组合物递送至所述细胞。还公开了一种使运载组合物穿透组织的方法，所述方法包括(a)将一个CendR 元件偶联于所述运载组合物，从而形成一种CendR缀合物；以及(b)将所述组织暴露于 所述CendR缀合物，其中所述CendR缀合物然后可以进入并离开所述组织中的细胞，从而使所述运载组合物穿透所述组织。又公开了一种将运载组合物递送至细胞的方法，所述方法包括(a)将一个可活 化的CendR元件偶联于所述运载组合物，从而形成一种CendR缀合物；以及(b)将所述 细胞暴露于所述CendR缀合物，于是切割剂可活化所述CendR缀合物的可活化CendR元 件，其中所述CendR缀合物然后可以进入所述细胞，从而将所述运载组合物递送至所述 细胞。再公开了一种使运载组合物穿透组织的方法，所述方法包括(a)将一个可活化 的CendR元件偶联于所述运载组合物，从而形成一种CendR缀合物；以及(b)将所述组 织暴露于所述CendR缀合物，于是切割剂可活化所述CendR缀合物的可活化CendR元 件，其中所述CendR缀合物然后可以进入和离开所述组织中的细胞，从而使所述运载组 合物穿透所述组织。还公开了一种鉴定可以内化CendR元件的细胞的方法，所述方法包括(a)将一 种细胞暴露于一个CendR元件；以及(b)确定所述CendR元件是否被内化。例如，所述 细胞可以在一个测定中。所述CendR元件可以偶联于一种运载组合物，例如蛋白或肽， 从而形成CendR缀合物。还公开了一种鉴定可以内化可活化的CendR元件的细胞的方法，所述方法包 括(a)将一种细胞暴露于一个可活化的CendR元件；(b)确定所述可活化的CendR元件 是否被内化。所述可活化的CendR元件可以在暴露于所述细胞之前脱封闭，但不需要如 此。例如，这可以用于测试所述封闭剂的封闭能力。所述可活化的CendR元件还可以为 蛋白酶活化的CendR元件。还公开了一种鉴定癌细胞作为基于CendR的疗法的候选物的方法，所述方法包 括(a)将所述癌细胞暴露于一个CendR元件；以及(b)确定所述CendR元件是否被所述 癌细胞内化，其中内化的CendR元件将所述癌细胞鉴定为基于CendR的疗法的候选物。 例如，所述细胞可以在一个测定中，或者可以在受试者中。所述CendR元件可以偶联于 一种运载组合物例如蛋白或肽，从而形成CendR缀合物。还公开了一种鉴定肿瘤作为基于CendR的疗法的候选物的方法，所述方法包 括(a)将来自所述肿瘤的组织暴露于一个CendR元件；以及(b)确定所述CendR元 件是否通过所述组织或者被所述组织中的细胞内化，其中通过的CendR元件或被内化的 CendR元件将所述肿瘤鉴定为基于CendR的疗法的候选物。还公开了一种产生可以在目的细胞附近活化的可活化CendR元件的方法，所 述方法包括形成一个可活化CendR元件，其中将一个封闭基团经可切割键偶联于一个 CendR元件，其中所述可切割键可被存在于目的细胞附近的酶切割。该方法还可以包括 在形成所述可活化CendR元件之前鉴定存在于目的细胞附近的酶。该方法还可以包括在 形成所述可活化CendR元件之前基于存在于目的细胞附近的酶选择所述可切割键。还公开了一种形成可活化的CendR元件的方法，所述方法包括(a)选择一种氨 基酸序列用于内化至细胞中，其中所述氨基酸序列包含一个C端元件，其中所述C端元 件包含末端羧基，以及(b)使一个封闭基团共价偶联于所述选择的氨基酸序列的末端羧 基，其中偶联所述封闭基团和所述末端羧基的键是可切割的，其中所述可活化的CendR 元件包含所述选择的氨基酸序列和所述封闭基团。该方法还可包括，在步骤(b)之前选择可被存在于目的细胞附近的蛋白酶切割的、偶联所述封闭基团和所述末端羧基的键。再公开了一种由这样的方法制备的可活化的CendR元件，即该方法包括(a)选 择一种氨基酸序列用于内化至细胞中，其中所述氨基酸序列包含一个C端元件，其中所 述C端元件包含末端羧基，以及(b)使一个封闭基团共价偶联于所述选择的氨基酸序列的 末端羧基，其中偶联所述封闭基团和所述末端羧基的键是可切割的，其中所述可活化的 CendR元件包含所述选择的氨基酸序列和所述封闭基团。该方法还可包括，在步骤(b) 之前选择可被存在于目的细胞附近的蛋白酶切割的、偶联所述封闭基团和所述末端羧基 的键。所公开的方法和组合物的其他优点一部分将在下文的描述中阐明，一部分可以 从说明书中获知，或者可通过实施所公开的方法和组合物而得知。所公开的方法和组合 物的优点将通过所附权利要求书中具体指明的要素和组合实现和获得。应当理解的是， 上文的一般性描述和下文的具体描述都仅仅是示例性和解释性的，并不是对本发明要求 保护范围的限制。


附图包含于本说明书中并构成本说明书的一部分，附图阐述了所公开方法和组 合物的一些实施方案，它与文字描述一起用于解释所公开方法和组合物的原理。图1A、IB和IC示出了对内化肽进行鉴定。图IA 对于T7噬菌体展示，肽 的表达形式为主衣壳蛋白GPlO的C末端融合物。图1B:在PPCl细胞上进行了 4个 不同文库(CX7C、XI、RXXRXXX(SEQ ID NO 19)和 RXXR(A/P) PRXXX(SEQ ID NO 20))的3轮离体筛选，产生归巢比展示7个连续甘氨酸残基(G7)的对照噬菌体高 500-2,500倍的噬菌体库。图IC 对每个文库随机20个噬菌体克隆的测序表明主要存在 以C端精氨酸残基结尾的肽，不管初始的文库构型和噬菌体与细胞相互作用中使用的温 度如何。对于4°C相应部分，这些序列从表的左上至右下对应于SEQ ID NO: 52-61、 132、72-75、133、76、134、77-78、135-144 和 62-71。对于 37°C + 酸洗相应部分，这 些序列从表的左上至右下对应于SEQ ID No 82-91、102-111、145-154和92-101。图2A和2B示出了展示C端精氨酸的T7噬菌体结合于PPCl细胞并被PPCl细 胞内化。图2A: T7噬菌体与前列腺癌细胞的结合依赖于C端精氨酸在所述噬菌体颗粒上 的展示。在4°C下将PPCl细胞与展示G7肽衍生物(上图)或RPARPAR肽衍生物(SEQ ID NO 2)(下图)的T7细菌噬菌体一起孵育，并通过噬菌斑检测法定量测定结合的噬菌 体。结合表示为高于未结合的G7对照噬菌体的倍数。图2B:展示C端精氨酸的噬菌 体被内化至培养的PPCl细胞中(箭号核内化；箭头细胞质内化)。在37°C下将一 组T7噬菌体克隆与培养于胶原涂布的盖玻片上的PPCl细胞一起孵育，以抗T7抗体染色 并通过共聚焦显微术成像。图 3 显示了 RPARPAR (SEQ ID NO 2)-量子点(quantum dot, Q-dot)被 PPCl
细胞内化。将培养于胶原涂布的盖玻片上的PPCl前列腺癌细胞与以生物素标记的肽涂布 的链霉亲和素量子点孵育，然后进行固定，用DAPI对细胞核复染并进行共聚焦成像。以 具有游离C端的RPARPAR肽(SEQ ID NO 2)涂布的Q_dot被强内化(浅颜色点)(a)， 而以酰胺封闭的C端涂布的Q-dot不结合所述细胞或内化(b)。插图Q-dot的示意图用于该研究的量子点具有约20nm的直径，并且可以以每颗粒5-10个肽涂布。图4显示了胰蛋白酶可活化RPARPARA(SEQ ID NO 3)噬菌体与PPCl细胞的
结合。在37°C下将5X IO8个噬菌体颗粒与标明体积的2.5%胰蛋白酶一起孵育20分钟， 随后在4°C下将所述噬菌体与1 X IO6个PPCl细胞一起孵育3小时。结合表示为高于未 结合的G7对照噬菌体(其内化不受胰蛋白酶处理的影响)的倍数。图5显示了 iRGD噬菌体和iRGD肽的肿瘤归巢和内化。a.iRGD肽归巢于胰肿 瘤。将大约200yg荧胺标记的iRGD肽通过尾静脉注入胰腺导管腺癌(PDAC)小鼠，并 使之循环4.5小时。收集器官并在UV光下观察(上图)。下图显示出了相应的亮视野 图像。b.iRGD噬菌体广泛地内化至人肿瘤细胞中。在37°C下将展示iRGD肽(主图) 或CG7C对照肽(右上窗口)的T7噬菌体与培养于I型胶原涂布的盖玻片上的PPCl细胞 一起孵育2小时，以抗T7抗体和质膜标记物染色，并通过共聚焦显微镜成像。观察到 iRGD噬菌体(浅颜色点)广泛地内化至所述肿瘤细胞中，而所述对照噬菌体不是这样。图6显示了具体的细胞内递送中的CendR。将包含潜在CendR基序的归巢肽通 过结合于特定受体(例如整联蛋白)带至靶细胞表面，所述肽随后被特定的细胞表面或细 胞周蛋白酶切割以暴露所述CendR基序(C端精氨酸)，被递送至广泛存在(ubiquitous)的 CendR受体，并被胞吞。具有暴露的CendR基序的肽直接与所述CendR受体相互作用， 并被内化。所述CendR通路可以使得所有类型的诊断剂和治疗剂(包括纳米颗粒)高度 特异地进行细胞内递送。图7显示了针对蛋白酶活化的进入信号和离去信号的CendR筛选的示意图。(A) 为进行蛋白酶解性进入筛选，CendR元件(RPARPAR，SEQID NO 2)被随机六肽和C
端丙氨酸残基掩盖。细胞内存在的噬菌体已被蛋白酶解处理，以暴露CendR元件。(B) 为了鉴定离去信号，构建具有暴露的CendR元件的噬菌体文库，所述暴露的CendR元件 之前连有随机肽。噬菌体的默认通路是内化，且仅其中随机肽编码离去信号的噬菌体在 细胞外。图8A和8B显示了 iRGD具有这样的CendR元件，即它有C端K(赖氨酸)而 非C端R(精氨酸)，并且该CendR元件像其他有C端精氨酸的CendR —样发挥作用。 iRGD包含CendR元件。图8A 制备了截短形式的iRGD噬菌体并对其内化至PPCl人 前列腺癌细胞的作用进行了测试。与天然iRGD噬菌体相比，携带CRGDKG(SEQ ID NO: 21)、CRGDK (SEQ ID NO 22)、CR(SEQ ID NO 163)的噬菌体具有更高的内 化至PPCl细胞的能力。从左至右，序列为SEQ ID NO: 155、SEQID NO 4、SEQID NO: 157、SEQ ID NO 158、SEQ ID NO 159、SEQ IDNO 160、SEQ ID NO 21、 SEQ ID NO 22、SEQ ID NO 161、SEQ ID NO 162、SEQ ID NO 163。图 8B 将PPCl细胞与或不与多种浓度的携带iRGD、CRGDK(SEQ ID NO 22)、CR(SEQ ID NO: 163)或RPAR (SEQ IDNO : 164)的UV失活噬菌体一起预孵育，随后与活CRGDK 噬菌体或对照噬菌体(NC5)—起进一步孵育。观察到CRGDK(SEQ IDNO 22)噬菌体的 内化被RPAR噬菌体以剂量依赖的方式抑制，表明CRGDK(SEQ IDNO : 22)发挥CendR 的作用。图9显示了 iRGD能够扩散至肿瘤组织中。将iRGD噬菌体(a)及其对照KGD 噬菌体(b)注入至携带自发胰腺导管腺癌的转基因小鼠，并使之循环15分钟。然后将小鼠以含BSA的PBS灌注并收集肿瘤。将所述肿瘤的冰冻切片以抗T7噬菌体抗体、 抗CD31抗体和DAPI染色。观察到iRGD噬菌体被形成胰肿瘤导管的肿瘤细胞广泛地吸 收，而KGD噬菌体保持在一些血管内部且在肿瘤导管中几乎未观察到信号，表明iRGD 噬菌体能够外渗并扩散至肿瘤组织中。在图9的2幅图中都以亮色表示着染。图IOA和IOB显示了使用噬菌体展示鉴定CendR肽。将一组肽文库(CX7C、 X7和RXXRXXX (SEQ ID NO 19))用于在源自PPOl同位异种移植肿瘤的细胞悬液上 进行离体筛选。(图10A)在3轮筛选后，噬菌体库对悬液中肿瘤细胞的结合比对照多甘 氨酸七肽(G7)噬菌体高500-1,300倍。(图10B)在3轮噬菌体筛选后回收代表性肽序 列。以C端精氨酸结尾的肽占所有测序的噬菌体插入物的97%。对于4°C相应部分，这 些序列从表的左上至右下对应于SEQ ID NO 52-81。对于37°C +酸洗相应部分，这 些序列从表的左上至右下对应于SEQ ID NO: 82-111。图1IA-IIC 显示了 CendR 内化的结构特征。图 IlA G6R 禾Π RPARPAR(SEQ
ID NO 2)噬菌体与PPC-I细胞的相互作用。在4°C下将细胞与噬菌体一起孵育以评估 表面结合(“被结合”)，或者在37°C下孵育后以低pH洗涤以评估噬菌体摄取(“被内 化”)。RPARPAR(SEQ IDNO 2)-功能化的q-dot同时抑制了 RPARPAR噬菌体的结 合和内化，而G7 q-dot无作用。G6R噬菌体未被内化；它与PPOl细胞的结合被过量 RPARPAR (SEQ ID NO 2) q-dot阻断。结合表示为展示多甘氨酸七肽(G7)的对照噬菌 体的倍数。图IlB 在4°C下RPARPAR (SEQ ID NO 2)衍生噬菌体与PPC-1细胞的结 合。数据是4次独立结合实验的代表。除了第一序列和第九序列分别为SEQ ID NO 2 和SEQ ID NO: 3外，所述序列从左至右对应于SEQ IDNO 112-125。统计分析通过学 生t检验(Student，s t-test)进行(图11A)。η = 3 ；误差棒表示标准差(s.d.) ； 1个星 号，ρ <0.05; 2个星号，ρ <0.01。 比例尺20 μ m。 图IlC (图c_g)在37°C下与展 示肽的噬菌体(亮色点，c_e)或肽涂覆的q-dot(亮色点，f，g) —起孵育2小时的PPC-I 细胞的共聚焦显微术RPARPAR (SEQ IDNO 2)T7(c)、G6RT7(d)、RPARPARA(SEQ ID NO 2) T7 (e)、RPARPAR (SEQ ID NO 2) q-dot (f)和 RPARPAR_NH2 (SEQ ID NO 2)q-dot(g)。在显微照片中，箭头指向表面结合的噬菌体和q-dot;箭号指向内化的颗 粒。图 12A 和 12A 显示了 RPARPAR (SEQ ID NO 2)、RGERPPR (SEQID NO 27) 和RVTRPPR(SEQ ID NO 28)肽的细胞结合和摄取。图12A 共享的通路。在4°C 下，展示所有3个串联RXXR (SEQ ID NO: 25)肽的噬菌体都以类似的程度与所述PPOl 细胞结合。所述结合被细胞与RPARPAR (SEQ ID NO 2)-功能化的q_dot的预孵育抑 制。以七甘氨酸对照肽(G7)涂覆的Q-dot对所述噬菌体结合无作用。统计分析通过 学生t检验进行(c)。η = 3;误差棒表示标准差(s.d.) ； 1个星号，ρ <0.05; 2个星 号，ρ < 0.01。图12B(图b_i)在存在IO9 pfu的以下噬菌体的条件下，培养1小时的 PPOl细胞中噬菌体免疫反应性的共聚焦免疫荧光评估(亮色点)(b)RPARPAR(SEQ ID NO 2)、 (c) RGERPPR (SEQID NO 27)、 (d) RVTRPPR (SEQ ID NO 28)、 (e) 对照 G7、(f)存在 20 μ M 游离 RPARPAR (SEQ ID NO 2)肽情况下的 RPARPAR (SEQ IDNO 2)噬菌体、(g)存在200 μ M游离RPARPAR (SEQ ID NO 2)肽情况下的 RPARPAR (SEQ ID NO 2)噬菌体、(h)存在 2mM 游离 RPARPAR (SEQ ID NO 2)肽情况下的 RPARPAR(SEQ ID NO 2)噬菌体、(i)存在 200 μ M 游离 RPARPAR(SEQ ID
NO 2)肽情况下的RGERRPR(SEQ ID NO 27)噬菌体。卵形椭圆表示以DAPI复染的 核。比例尺20μιη。图13 显示了 PPOl 细胞对 RPARPAR (SEQ ID NO 2) q-dot 的内化(浅色 点)肽修饰的效应。将PPC-I细胞与以如下肽功能化的q-dot —起孵育2小时(a) RPARPAR (SEQ ID NO 2)、(b) RPARPARA (SEQID NO 3)、(c) RPARPAR-NH2 (SEQ ID NO: 2)、(d)D-rparpar、(e) D-rparpara 和(f) G7。将细胞以核染色剂 DAPI 染色并使
用共聚焦显微镜成像。比例尺50 μ m。图14显示了胰蛋白酶切割可增加RPARPARA (SEQ ID NO 3)噬菌体与PPOl
细胞的结合。在37°C下将109pfu的RPARPARA (SEQ IDNO 3)噬菌体以指定量的胰蛋 白酶处理，随后在4°C下进行噬菌体结合测定。数据是4次独立结合实验的代表。图15A-15D显示了 CendR噬菌体可结合于许多类型的细胞。图15A 在 4 °C下RPARPAR (SEQ ID NO 2)噬菌体与培养细胞的体外结合。图15B 在4°C下 RPARPAR (SEQ ID NO 2)噬菌体与小鼠器官原代细胞悬液的离体结合。图15C和15D 静脉注射的RPARPAR (SEQ ID NO 2)噬菌体在20分钟的循环时间后的组织分布。图 15C噬菌体通过滴定定量，组织结合表示为G7噬菌体的倍数。统计分析通过学生t 检验进行(C)。η = 3;误差棒表示标准差(s.d.) ； 2个星号，ρ <0.01; 3个星号，ρ < 0.001ο 图 15D (图 d 和 e)以 RPARPAR (SEQ ID NO 2) (d)或 G7 (e)噬菌体静脉注 射的小鼠的肺切片中T7噬菌体的免疫荧光定位(浅着色)。广泛分布的免疫反应性存在 于以RPARPAR (SEQ ID NO 2)注射的小鼠的肺中(d中的箭头)，但不存在于以G7注 射的小鼠的肺中(血管中偶尔出现标记，e中的箭头)。比例尺50μιη。图16Α和16Β显示了 RPARPAR (SEQ ID NO 2)噬菌体与PPOl细胞结合以及 向PPC-I细胞内化的动力学。图16A :在4°C下，噬菌体与培养的PPC-I细胞悬液的结 合在20分钟时达到平台。对于时程研究，将培养PPC-I细胞的细胞悬液与IO9Pfu噬菌 体一起孵育，随后在硅油垫(1.03g/ml)上通过离心将未结合的噬菌体与细胞一步分离， 并进行滴定。图16B (图b、c)在37°C下肝PPOl细胞对RPARPAR (SEQ IDNO 2) 功能化的q-dot的内化。(b)在加入q-dot 15分钟后，沿质膜出现标记(浅色斑点)。 (C)在1小时时，大多数的q-dot被内化。以活体细胞核染色剂Hoechst 342进行细胞核 染色。η = 3 ；误差棒表示标准差(s.d.)。比例尺20 μ m。图17A、17B 和 17C 显示了 RPARPAR (SEQ ID NO 2)噬菌体被 PPOl 细胞经
非常规的通路内化。图17A 胞吞抑制剂对RPARPAR (SEQID NO 2)噬菌体内化的影 响。在37°C下将噬菌体与PPC-I细胞一起在存在所示抑制剂的情况下孵育90分钟，随 后进行酸洗和滴定以定量测定内化的噬菌体。通过ANOVA进行的统计分析显示所述抑 制剂没有一种显著抑制内化。η = 3 ；误差棒表示标准差(s.d.)。图17B :在存在IO9Pfo 的RPARPAR (SEQ ID NO 2)噬菌体的情况下孵育60分钟并针对T7噬菌体和亚细胞 区室标记物(LAMP-1、小窝蛋白-l(caveolin-l)、钙联接蛋白(calnexin)、EEA-1)双 染的PPC-I细胞的共聚焦成像。以DAPI进行细胞核染色。图17C 在存在109pfo的 RPARPAR (SEQ ID NO 2)噬菌体和10 μ g/ml霍乱毒素B亚基的情况下孵育180分钟的 PPC-I细胞的共聚焦成像。噬菌体通过Alexa-546标记的二抗进行检测，霍乱毒素亚基B以Alexa-488染料标记。共定位通过紧靠细胞核外侧的亮点(箭号)表示。以DAPI进 行细胞核染色。比例尺10 μ m。图18A-18C显示了 NRP_1作为CendR受体的鉴定和确认。图18A 蛋白与 RPARPAR(SEQ ID NO 2)肽相互作用的亲和色谱。以200mM吡喃葡萄糖苷缓冲物提 取PPOl肿瘤组织并将所述提取物与RPARPAR (SEQ ID NO 2)涂覆的小珠孵育，然 后进行大量洗涤，并以2mM游离RPARPAR (SEQ ID NO 2)肽洗脱。注意到被质谱 鉴定为NRP-I的130kDa带出现，其起始于洗脱物的第3级分。上图-银染凝胶，下 图-抗NRP-I抗体的免疫印迹。图18B RPARPAR (SEQ ID NO 2)噬菌体与以野生 型 NRP-I (NRP-I)、三重突变体 NS346A-E348A-T349ANRP_1(突变体 NRP-1)或亲本 PCDNA3.1质粒(载体)瞬时转染的M21黑色素瘤细胞的结合，以及与非转染的M21细 胞的结合。图18C (C、d)，在37°C下与噬菌体一起孵育40分钟(c)和3小时(d)的 PPC-I细胞中NRP-I和RPARPAR (SEQ ID NO 2)T7噬菌体的共聚焦免疫荧光图像。 所述噬菌体和NRP-I大量地共定位，但似乎重叠不断减少(C和d中的箭头)并出现仅对 噬菌体阳性的结构(箭号，d)。 (e)以NRP-I瞬时转染的M21细胞中RPARPAR(SEQ ID NO 2)噬菌体和NRP-I的免疫染色和共聚焦成像。在37°C下将RPARPAR (SEQ ID NO 2)噬菌体与在纤连蛋白涂布的盖玻片上培养的细胞一起孵育3小时。仅表达NRP-I 的细胞结合并内化所述噬菌体(箭号)，而阴性细胞(不可视)不结合和内化所述噬菌 体。(f) RPARPARA(SEQ ID NO 3)噬菌体不内化至NRP-I阳性M21细胞中。统计分 析以ANOVA进行(b) ； η = 3 ；误差棒表示标准差(s.d.)。比例尺10 μ m。图19A和19B显示了展示RPARPAR (SEQ ID NO 2)和已知NRP-I配体肽的噬 菌体与PPC-I细胞的结合。图19A 已知NRP-I配体可使得噬菌体结合于PPOl细胞。 展示已知与NRP-I的bl亚基相互作用的肽配体(a中的表)的噬菌体以与RPARPAR(SEQ ID NO 2)类似的程度结合所述细胞，而具有添加的C端丙氨酸(VEGF-C7-A)的 VEGF-C7是失活的。在该表中，序列从上至下对应于SEQ IDNO 126-130。图19B (图 b-g)对在存在IO9Pfu的所示噬菌体的情况下培养1小时的PPC-I细胞中的噬菌体免疫 反应性进行共聚焦免疫荧光评估。箭号，内化的噬菌体；箭头，质膜关联的噬菌体。以 DAPI进行细胞核染色。插图0.5mM游离RPARPAR (SEQ ID NO 2)肽(在加入噬菌 体前10分钟加到细胞中)对所述噬菌体结合的竞争。比例尺20 μ m。图20A-20C显示了尿激酶依赖的CendR肽。图20A uPA-可活化的CendR 肽(uCendR)的设计。uPA的共有切割位点SGRSA (SEQ IDNO 34的第5_9位氨基酸) (Ke, S.H.etal. (1997))与重叠CendR元件相组合。在完整的肽中，所述CendR元件由于 未在C端处暴露而无活性。uPA的切割导致所述CendR元件的C端暴露CuCendR-X)、 细胞结合和内化。图20B 展示uCendR肽和对应于切割后产物(uCendR-X)的噬菌体与 PPC-I细胞的结合。在将所述噬菌体加入细胞之前，将噬菌体以50iu的uPA、25 μ g结晶 胰蛋白酶、50iu凝血酶或25 μ g的I型胶原酶处理。图20C (图c_e)与uPA-CendR-q-dot 一起孵育的PPC-I细胞的荧光显微术。未处理的uCendR q_dot未内化(C)，而uPA处理 可触发q-dot的内化(d，箭头)。阿米洛利(Amiloride)抑制了摄取(e)。统计分析以 ANOVA进行(b) ； η = 3 ；误差棒表示(s.d.) ； 3个星号，ρ <0.001。比例尺10 μ m。图21显示了 CendR的内化通路。所鉴定的内化基序(CendR基序)在位于蛋白C端时有活性。在C端之外的位置包含CendR基序的肽(隐性CendR肽)未内化；然 而，它们对神经毡蛋白-1的结合和它们的内化可以通过蛋白酶解切割触发。所述CendR 通路可导致生物纳米颗粒和合成纳米颗粒(细菌噬菌体和q-dot)的摄取。CendR通路还 可以涉及到细胞与其他生物剂(例如病毒和其他细胞)的相互作用。
具体实施例方式通过参考对下文中包括的具体实施方案和实施例的具体描述，以及参考附图及 其上下文的描述，可以更容易地理解所公开的方法和组合物。在公开并描述本发明的化合物、组合物、物品、装置和/或方法之前，应当理 解，除非另外指出，否则它们不局限于具体的合成方法或具体的重组生物技术方法，或 者除非另外指出，否则它们不局限于具体的试剂，因为这些理所当然可以有变化。还应 当理解，本文中使用的术语仅是为了描述具体实施方案的目的，不是意欲进行限制。A.定义除非上下文中另外明确指出，在本说明书和所附权利要求书中使用的单数形式 的“一个”、“一种”和“该”包括复数指代对象。因此，例如，提及“一种药物载 体”包括两种或多种该载体的混合物，等等。本文中范围可以表示为从“约” 一个具体的数值，和/或至“约”另一个具体 的数值。当表示为该范围时，另一实施方案可包含从一个具体数值和/或至另一个具体 数值。类似地，当通过在前面使用“约”将数值表示为近似值时，应当理解，该具体 的数值形成另一实施方案。还应当进一步理解，每个范围的端点在与另一个端点相关和 独立于另一个端点时都是有意义的。还应当理解，本文中公开了许多值，并且每个值除 该值本身外在本文中还被公开为“约”该具体值。例如，如果公开了值“10”，那么
“约10”也被公开。还应理解，如本领域技术人员适当理解的，如果一个值被公开，那 么“小于或等于”该值、“大于或等于该值”以及这些值之间可能的范围也被公开。例 如，如果公开了值“10”，那么“小于或等于10”以及“大于或等于10”也被公开。 还应理解，在本申请通篇中，数据以多种不同形式提供，并且该数据表示终点和起点以 及这些数据点的任意组合的范围。例如，如果公开了具体数据点“10”和具体数据点 15，那么应理解，除10和15之间以外，还认为大于、大于或等于、小于、小于或等于以 及等于10和15都被公开。还应理解，两个具体单元之间任一单元也被公开。例如，如 果10和15被公开，那么11、12、13和14也被公开。在本说明书和随附的权利要求书中，将会提到多个术语，这些术语将被定义具 有如下含义“任选的”或“任选地”是指后面描述的事件或情况可能发生，也可能不发 生，且该描述包括所述事件或情况发生以及不发生的情形。本申请全文中，参引了多份出版物。这些出版物的公开内容通过引证的方式全 文纳入本申请，以更全面地描述本发明所属技术领域的状态。基于倚赖参考文献的句子 中所论述的包含在所述参考文献中的素材，所公开的参考文献还单独地并具体地通过引 用的方式纳入本文。应理解，除非另外指出，所公开的方法和组合物不限于具体合成方法、具体分析技术或具体试剂，因此它们可以有变化。还应理解，用于本文中的术语仅是为了描述 具体实施方案，而不是意欲进行限制。B.综述本文公开了一种新的技术平台，该平台使得可以进行组合物的细胞内递送、离 开和组织穿透。所述递送可以是全面递送，也可以靶向目的细胞或组织，例如肿瘤。组 合物(包括纳米颗粒、药物、可检测标记物和其他化合物)及它们的负载在靶细胞中的内 化以及靶组织穿透可以提高靶向的效率，但之前还未实现细胞类型特异性内化和组织类 型特异性穿透。另外，组合物穿透至血管外空间的能力是限制组合物的体内靶向效率的 主要因素。已经鉴定了一个简单的肽基序，其C端元件为一个限定特征，该基序可示意 噬菌体和游离肽的高效细胞内化(图9是一个实例)。该内化现象被命名为“C端规则” 或“CendR”。使C端元件暴露的蛋白酶解可作为触发内化信号的开关。多种组合物可 以通过该机制内化。例如，归巢肽介导的积聚可以通过暴露这样的C端元件的细胞类型 特异性蛋白酶解而出现在靶位点，即该C端元件使得形成具有靶触发内化的高特异性归 巢体系。所述CendR通路还可以用于使目的组合物离开细胞并分散至组织中。该C端元 件可以实现穿透血管壁(并且例如可以从静脉注射分散至肿瘤组织中)的转位，并且还可 以扩展至其他屏障，例如粘膜和血脑屏障。本文使用的“组织穿透”和“组织的穿透” 是指越过或穿过外层或第一层细胞或者穿过组织膜进入或穿过组织。这类的组织进入或 穿透(这还可以称为外渗和组织穿透)可以具有细胞内化和离开双功能。在本申请全文 中，如果使用术语“组织穿透”，应理解为这类穿透还可以扩展至全身存在的其他屏障 和膜，例如血脑屏障。与已知的细胞穿透肽不同，本申请公开的内化元件是位置依赖的一它存在于 肽C端之外的其他位置时是无活性的。该潜伏肽可以通过例如合适的蛋白水解酶切割以 暴露例如C端精氨酸、赖氨酸或赖氨酸-甘氨酸而活化。在本申请全文中，使用术语
“CendR元件”或“C端元件”时，它是用于描述C端精氨酸、C端赖氨酸或C端赖 氨酸-甘氨酸对，在最后一种情况下甘氨酸位于C端最末位置。换句话说，在赖氨酸在 C末端的情况下，所述CendR元件以甘氨酸位于赖氨酸的C端侧可以保持功能。然而， 为使赖氨酸残基作为C端元件起作用，甘氨酸位于末端不是必需的，因此赖氨酸可以在 无甘氨酸下存在并仍有功能。然而，反之则不然，因为甘氨酸在不存在邻接的赖氨酸的 情况下不能发挥C端元件的功能。精氨酸不需要赖氨酸或甘氨酸就可发挥C端元件的功 能，条件是它保持在C端最末位置。这类CendR元件可以被称为1类CendR元件。术语“CendR元件”或“C端元件”还可以用于描述C端组氨酸和具有序列 X1X2X3X4的氨基酸序列，其中X1可以为R、K或H，其中X4可以为R、K、H或KG， 其中X2和X3可以彼此独立地为任意氨基酸。这类CendR元件可以被称为2类CendR元 件。可以基于具体目的选择X2和X3氨基酸。例如，可以选择X2和/或X3以形成蛋白 酶识别序列的全序列或其一部分。例如，这可用于具体表示对含有作为一种潜伏或隐性 CendR元件的CendR元件的肽的切割或使所述切割进行，所述潜伏或隐性CendR元件被 X4氨基酸之后的切割作用所活化。这类氨基酸选择的实例显示于表1和4中。例如， 还可以选择Xp X2和X3氨基酸以将其他分子募集至细胞表面处的NRP-I分子。例如， 这可以应用于调节CendR元件(及包含CendR元件的缀合物、蛋白和肽)的选择性和内化以及/或者组织穿透能力。任选地，还可以将一些氨基酸从X2和/或X3的使用中排 除。例如，根据需要，可以排除G和D同时分别用作X2和&。一些2类CendR元件 还可以描述为 R/K/HXXR/K/H (SEQ IDNO 50)禾口 R/K/HXXKG (SEQ ID NO 51)。CendR 元件的实例包括 XXR/K/H、XXR/K、XXR/H、XXK/H、XXR、 XXK、XXH、XXKG、RXXR/K/H、RXXR/K、RXXR/H、RXXK/H、RXXR、 RXXK、RXXH > RXXKG > KXXR/K/H、KXXR/K、KXXR/H、KXXK/H、KXXR、 KXXK、KXXH > KXXKG > HXXR/K/H、HXXR/K、HXXR/H、HXXK/H、HXXR、 HXXK、HXXH > HXXKG > R/K/HXXR、R/KXXR、R/HXXR、K/HXXR、RXXR、 KXXR、HXXR、R/K/HXXK、R/KXXK、R/HXXK、K/HXXK、RXXK、KXXK、 HXXK、R/K/HXXH、R/KXXH、R/HXXH、K/HXXH、RXXH> KXXH> HXXH> R/ K/HXXKG、R/KXXKG、R/HXXKG、K/HXXKG、RXXKG、KXXKG禾Π HXXKG。该可由蛋白酶控制的内化体系可用于设计这样的组合物，即这些组合物具有诸 如细胞类型特异性和/或组织类型特异性摄取的功能以及将所述组合物扩散至组织中的 能力。另外，该规则可涉及多种生物过程，包括病毒感染和吞噬。由于病毒天然地可以 利用所述CendR通路感染细胞，因而所述CendR肽和/或缀合物可以用于干扰病毒感染 的过程。在一个实例中，所述CendR肽可以用于纳米医学中。纳米医学的主要目标之一 是设计通过在诊断、监测和治疗疾病中发挥多种功能而超越简单药物的装置。可以将新 技术应用于解决多功能纳米颗粒的医学应用中的一些主要问题。医学纳米技术的一个主 要目标是开发能够监测组织(包括细胞内部)中疾病的纳米装置。这类装置可以包括这 样的纳米颗粒，即该纳米颗粒对细胞内部进行取样后返回以对结果进行报告。这需要离 开细胞的能力。但是，许多缺乏分泌信号序列的细胞质蛋白也从细胞中分泌。以该方式 发挥功能的细胞蛋白的一个主要实例为碱性FGF(Backhaus etal.，2004)。VP22蛋白也以 非常规的方式从细胞离开。赋予纳米颗粒针对非靶向细胞的离开信号可减少所述颗粒的 非特异性毒性。组织穿透噬菌体文库可用于鉴定促进纳米颗粒离开细胞的分子信号。1 .CendR元件及其用途本文公开了一种形成CendR缀合物的方法，所述方法包括选择一种氨基酸序列 用于内化至细胞中和/或穿透组织，其中所述氨基酸序列包含一个C端元件；以及使一 种运载组合物共价偶联于或非共价缔合于包含所述选择的氨基酸序列的蛋白或肽，其中 所述选择的氨基酸序列位于所述蛋白或肽的C末端，其中所述CendR缀合物包含所述蛋 白或肽以及所述偶联或缔合的运载组合物本文定义的C端元件为精氨酸、赖氨酸或赖氨酸_甘氨酸(对于1类CendR元 件)，或者组氨酸或具有序列X1X2X3X4的氨基酸序列，其中X1可以为R、K或H，其中 X4可以为R、K、H或KG，其中X2和X3可以彼此独立地为任意氨基酸(对于2类CendR 元件)。本文使用的“选择一种氨基酸序列用于内化至细胞中”是指选择、鉴定、设计 或分类具有如下具体目的的氨基酸序列使包含所述氨基酸序列的蛋白或肽进入细胞。 因此，例如，“选择一种氨基酸序列用于内化至细胞中”不包括如下情况为了除使包 含所述氨基酸序列的蛋白或肽进入细胞之外的某个目的或能力，以及在不存在使包含所述氨基酸序列的蛋白或肽进入细胞的意图的情形下，选择一种氨基酸序列。“选择一种 氨基酸序列用于内化至细胞中”包括如下情况除了为了使包含所述氨基酸序列的蛋白 或肽进入细胞之外还为了获得某个目的或能力而选择一种氨基酸序列。因此，“选择一 种氨基酸序列用于内化至细胞中”包括这样的情况，即其他目标或目的的存在不改变至 少具有如下具体目的的氨基酸序列选择使包含所述氨基酸序列的蛋白或肽进入细胞。本文使用的“选择一种氨基酸序列用于穿透组织”是指选择、鉴定、设计或分 类具有如下具体目的的氨基酸序列使包含所述氨基酸序列的蛋白或肽进入组织(即组 织穿透)。因此，例如，“选择一种氨基酸序列用于穿透组织”不包括如下情况为了 除使包含所述氨基酸序列的蛋白或肽进入组织之外的某个目的或能力，以及在不存在使 包含所述氨基酸序列的蛋白或肽进入组织的意图的情形下，选择一种氨基酸序列。“选 择一种氨基酸序列用于穿透组织”包括如下情况除了为了使包含所述氨基酸序列的蛋 白或肽进入组织之外还为了获得某个目的或能力而选择一种氨基酸序列。因此，“选择 一种氨基酸序列用于穿透组织”包括这样的情况，即其他目标或目的的存在不改变至少 具有如下具体目的的氨基酸序列选择使包含所述氨基酸序列的蛋白或肽进入组织。本文使用的“选择一种氨基酸序列用于内化至细胞中和/或穿透组织”是指选 择、鉴定、设计或分类具有如下具体目的的氨基酸序列使包含所述氨基酸序列的蛋白 或肽进入细胞和/或组织。因此，例如，“选择一种氨基酸序列用于内化至细胞中和/或 穿透组织”不包括如下情况为了除使包含所述氨基酸序列的蛋白或肽进入细胞和/或 组织之外的某个目的或能力，以及在不存在使包含所述氨基酸序列的蛋白或肽进入细胞 和/或组织的意图的情形下，选择一种氨基酸序列。“选择一种氨基酸序列用于内化至 细胞中和/或穿透组织”包括如下情况除了为了时包含所述氨基酸序列的蛋白或肽进 入细胞和/或组织之外还为了获得某个目的或能力而选择一种氨基酸序列。因此，“选 择一种氨基酸序列用于内化至细胞和/或穿透组织”包括这样的情况，即其他目标或目的 的存在不改变至少具有如下具体目的的氨基酸序列选择使包含所述氨基酸序列的蛋白 或肽进入细胞和/或组织。本文使用的“使一种运载组合物共价偶联于或非共价缔合于”其他某物是指任 何这样的作用，即该作用导致不共价偶联于或非共价缔合于所述其他某物的运载组合物 变成或获得共价偶联于或非共价缔合于所述其他某物的状态。例如，“使一种运载组合 物共价偶联于或非共价缔合于”另一运载组合物包括，将运载组合物共价偶联于所述另 一运载组合物。再例如，“使一种运载组合物共价偶联于或非共价缔合于”某物包括这 样的运载组合物，即该运载组合物开始不存在，然后作为一种组合物的一部份被合成， 所述组合物包含所述运载组合物将偶联或缔合的所述某物。例如，使运载组合物(目的 氨基酸序列)共价偶联于或非共价缔合于所述包含C端元件的氨基酸序列包括，合成同时 包含目的氨基酸序列和含C端元件的氨基酸序列的肽。然而，一般而言，“使一种运载 组合物共价偶联于或非共价缔合于”所述包含C端元件的氨基酸序列可以排除这样的过 程，即天然地同时包含目的氨基酸序列和含C端元件的氨基酸序列的蛋白或肽的合成。本文使用的“CendR元件”是指具有C端精氨酸、赖氨酸或赖氨酸-甘氨酸序 列的氨基酸序列(对于1类CendR元件)，或者C端组氨酸或具有序列X1X2X3X4的C端 氨基酸序列，其中X1可以为R、K或H，其中X4可以为R、K、H或KG，其中X2和X3可以彼此独立地为任意氨基酸(对于2类CendR元件)。一些2类CendR元件还可以描 述为 R/K/HXXR/K/H (SEQ ID NO 50)禾口 R/K/HXXKG (SEQ ID NO 51)。还可以选 择Xi、X2和X3氨基酸以将其他蛋白募集至细胞表面处的NRP-I分子。例如，这可以应 用于调节CendR元件(及包含CendR元件的缀合物、蛋白和肽)的选择性和内化以及/或 者组织穿透能力。例如，CendR元件可以包含这样的氨基酸序列的蛋白或肽，所述氨基 酸序列具有C端元件；包含由具有C端元件的氨基酸序列组成的蛋白或肽；或者由具有 C端元件的氨基酸序列组成。任选地，还可以排除一些氨基酸在X1X2X3X4形式的CendR 元件中用作&和/或X3。例如，根据需要，可以排除G和D同时分别用作X2和乂3。CendR 元件的实例包括 XXR/K/H、XXR/K、XXR/H、XXK/H、XXR、 XXK、XXH、XXKG、RXXR/K/H、RXXR/K、RXXR/H、RXXK/H、RXXR、 RXXK、RXXH > RXXKG > KXXR/K/H、KXXR/K、KXXR/H、KXXK/H、KXXR、 KXXK、KXXH > KXXKG > HXXR/K/H、HXXR/K、HXXR/H、HXXK/H、HXXR、 HXXK、HXXH > HXXKG > R/K/HXXR、R/KXXR、R/HXXR、K/HXXR、RXXR、 KXXR、HXXR、R/K/HXXK、R/KXXK、R/HXXK、K/HXXK、RXXK、KXXK、 HXXK、R/K/HXXH、R/KXXH、R/HXXH、K/HXXH、RXXH> KXXH> HXXH> R/ K/HXXKG、R/KXXKG、R/HXXKG、K/HXXKG、RXXKG、KXXKG禾Π HXXKG。可以内化至细胞中的CendR元件可以称为内化CendR元件。可穿透组织的 CendR元件可以称为穿透CendR元件。可内化至细胞中并且可穿透组织的CendR元件可 以称为内化和穿透CendR元件。除非上下文明确另外指出，提及“CendR元件”时是指 这些情况的各单独情况、它们的总合或任意组合。本文使用的“CendR缀合物”是指与包含含有CendR元件的氨基酸序列的蛋白 或肽缔合的运载组合物，其中所述氨基酸序列位于所述蛋白或肽的C末端。本文使用的“可活化的CendR元件”是指分子、部分、纳米颗粒、化合物或其 他组合物共价偶联于一个CendR元件(例如共价偶联于C端元件的末端羧基)的CendR 元件，其中所述分子、部分、纳米颗粒、化合物或其他组合物可阻断所述CendR缀合物 的内化和/或组织穿透，并且其中所述分子、部分、纳米颗粒、化合物或其他组合物可 被除去(例如以暴露所述末端羧基)。例如，所述可活化的CendR元件可以位于所述肽的 C末端，并且可以阻止所述CendR元件内化和/或穿透组织。共价偶联于所述CendR元 件的所述分子、纳米颗粒、部分、化合物或其他组合物可以称为“封闭基团”。例如， 所述封闭基团可以偶联于所述CendR元件的C端精氨酸或赖氨酸或者其他C端氨基酸的 末端羧基；偶联于所述CendR元件的C端氨基酸；或者偶联于除所述C端氨基酸之外的 CendR元件的氨基酸。所述封闭基团还可以偶联或缔合于CendR缀合物中除所述CendR 元件之外的部分，条件是它可以阻断所述CendR元件内化和/或穿透组织。可活化的CendR元件的细胞内化以及/或者组织穿透可被阻断。一般而言，将 同时阻断可活化的CendR元件的细胞内化和组织穿透。这类可活化的CendR元件可以 称为可活化的内化和穿透CendR元件。然而，一些可活化的CendR元件仅被阻断组织 穿透，或者仅被阻断细胞内化。这类可活化的CendR元件可以称为可活化的内化CendR 元件(对于仅被阻断细胞内化的CendR元件)，或者称为可活化的内化和穿透CendR元 件(对于仅被阻断组织穿透的CendR元件)。一般而言，可活化的内化CendR元件应为可活化的内化CendR元件。与之类似，可活化的穿透CendR元件一般应为可活化的穿透 CendR元件。可活化的内化和穿透CendR元件应为可活化的内化和穿透CendR元件。 除去所述封闭基团后将使得所述CendR元件可内化至细胞中和/或穿透组织。“蛋白酶可活化的CendR元件”(或“蛋白酶活化的CendR元件”)是指这样 的可活化CendR元件，即其中所述封闭基团经肽键偶联于所述CendR元件，并且其中所 述肽键可被蛋白酶切割。蛋白酶可活化的CendR元件中该肽键的切割使得所述CendR元 件能够内化至细胞中和/或穿透组织。在一个实例中，所述封闭基团可以经可切割键或 不稳定键偶联于所述CendR元件。例如，所述可切割键可以被酶或化合物切割。可活化 CendR元件中的切割或“不稳定”键可使得所述CendR元件能够内化至细胞中和/或穿 透组织。这类切割或“不稳定”可称为所述CendR元件的活化。蛋白酶可活化的CendR 元件为一种形式的可活化CendR元件。根据具体目的可以选择X1X2X3X4形式的CendR 元件的X2和X3氨基酸。例如，可以选择X2和/或X3以形成蛋白酶识别序列的全序列 或部分序列。例如，这可用于具体表示含有作为一种潜伏或隐性CendR元件的CendR元 件的肽的切割或使所述切割进行，所述潜伏或隐含CendR元件被X4氨基酸之后的切割作 用所活化。这类氨基酸选择的实例显示于表1和4中。一类可用的CendR元件可以由 未封闭的CendR元件和可活化的CendR元件组成，该类CendR元件排除不可活化的封闭 CendR元件。可用的蛋白酶包括在碱性残基(CendR元件的C端残基可以是碱性残基)的C端 侧切割的酶以及识别它们的切割位点的C端侧序列的酶(因此使得可自由选择切割产物 的C端序列)。可用的蛋白酶的实例包括例如，丝氨酸蛋白酶(包括例如纤溶酶和纤溶 酶原激活齐[J)、前蛋白转化酶(参见例如 Duckert et al., Prediction of proprotein convertase cleavage sites Protein engineering Design and Selection 17(1) 107-112 (2004)) > 弗林蛋 白酶(forin)和羧肽酶。丝氨酸蛋白酶可特别用于靶向癌细胞和肿瘤的CendR元件和 CendR缀合物。在碱性残基的C端侧切割的酶的实例包括Arg-C蛋白酶(它在精氨酸残 基的 C 端侧切害Ij ； Keil，Specificityof Proteolysis (Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg-New York) (1992))、梭菌蛋白酶(它在精氨酸残基的C端侧切割；Keil，1992)、肠激酶 (它在序列-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-(SEQ ID NO 131)后切割)、Xa 因子(它在 序列-Gly-Arg-后切害1J ； Fujikawa et al., Activation of bovine factor X (Stuart factor) conversion of factor Xa alpha to factor Xa beta, Proc.Natl.Acad.Sci.72 3359-3363 (1975))、 Lys-C (它在赖氨酸残基的C端侧切割；Keil，1992)、凝血酶(它在精氨酸残基的C端侧 切割；Keil，1992)、胰蛋白酶(它在精氨酸和赖氨酸残基的C端侧切割；Keil，1992)、 丝氨酸蛋白酶、前蛋白转化酶(例如PCI、PC2、PC3、PC4、PC5、PC6、PC7、PC8、 弗林蛋白酶、Pace、PACE4、位点 1 蛋白酶、SIP、SKI、NARC-U PCSKU PCSK2、 PCSK3、PCSK4、PCSK5、PCSK6、PCSK7、PCSK8 禾口 PCSK9)、纤溶酶和纤溶酶原激 活剂。可识别其切割位点C端侧序列的酶的实例包括Asp-N内肽酶(它切割天冬氨酸的 N端侧；Keil，1992)和羧肽酶如羧肽酶A(它切割除脯氨酸、赖氨酸和精氨酸之外的C 端残基)。蛋白酶的实例还记载于 Hook, proteolytic and cellular mechanisms in prohormone and proprotein processing, RG Landes Company, Austin, Texas, USA(1998) ； Hooperetal.，Biochem.J.321 265-279(1997) ； Werb, Cell 91 439-442(1997) ； Wolfsberg etal., J.Cell Biol. 131 275-278(1995) ； Murakami and Etlinger, Biochem.Biophys.Res. Comm. 146 1249-1259(1987) ； Berg et al.，Biochem.J.307 313-326(1995) ； Smyth and Trapani, Immunology Today 16 202-206 (1995) ； Talanian et al.，J.Biol.Chem.272 9677-9682(1997)；以及 Thornberry et al.，J.Biol.Chem.272 17907-17911(1997)。表4.切割规则底物切割I----P4-P3-P2-P1-P1' -P2' -P3' -P4'-----如下的酶在出现各自切割位点的组合时可切割。
权利要求
1.一种形成CendR缀合物的方法，所述方法包括(a)选择一种氨基酸序列用于内化至细胞中和/或穿透组织，其中所述氨基酸序列包 含一个CendR元件，(b)使一种运载组合物共价偶联于或非共价缔合于一种包含所述选择的氨基酸序列 的蛋白或肽，其中所述运载组合物偶联或缔合于所述蛋白或肽的所述CendR元件的N端 侧，其中所述CendR缀合物包含所述蛋白或肽以及所述偶联或缔合的运载组合物。
2.权利要求1的方法，其中步骤(b)的蛋白或肽在步骤(a)所选择的氨基酸序列存在 于所述蛋白或肽中时可以被内化至细胞中，但当所选择的氨基酸不存在于所述蛋白或肽 中时不能被内化至细胞中。
3.权利要求1的方法，其中步骤(b)的蛋白或肽在步骤(a)所选择的氨基酸序列存在 于所述蛋白或肽中时可以穿透组织，但当所选择的氨基酸不存在于所述蛋白或肽中时不 能穿透组织。
4.权利要求1的方法，其中步骤(b)的蛋白或肽在步骤(a)所选择的氨基酸序列存在 于所述蛋白或肽中时可以被内化至细胞中并可穿透组织，但当所选择的氨基酸不存在于 所述蛋白或肽中时不能被内化至细胞中也不能穿透组织。
5.权利要求1的方法，其中步骤(a)所选择的氨基酸序列在不与步骤(b)的组合物缔 合情况下可以被内化至细胞中。
6.权利要求1的方法，其中步骤(a)所选择的氨基酸序列在不与步骤(b)的组合物缔 合情况下可以穿透细胞。
7.权利要求1的方法，其中步骤(a)所选择的氨基酸序列在不与步骤(b)的组合物缔 合情况下可以被内化至细胞中并可穿透组织。
8.权利要求ι的方法，其中步骤ω所选择的氨基酸序列是步骤(b)的蛋白或肽中仅 有的功能性内化元件。
9.权利要求1的方法，其中步骤(a)所选择的氨基酸序列是所述CendR缀合物中仅有 的功能性内化元件。
10.权利要求1-9任一项的方法，其中所述CendR元件为可活化的CendR元件。
11.权利要求6的方法，其中所述可活化CendR元件为蛋白酶可活化的CendR元件。
12.权利要求1-11任一项的方法，其中所述蛋白或肽是环状的。
13.权利要求1-9任一项的方法，其中所述CendR元件位于所述蛋白或肽的C末端。
14.权利要求1-12任一项的方法，其中步骤(b)的运载组合物是抗血管生成剂、促血 管生成剂、纳米颗粒、癌症化学治疗剂、细胞毒剂、抗炎剂或抗关节炎剂。
15.权利要求1-14任一项的方法，其中步骤(b)的运载组合物包含归巢序列。
16.权利要求15的方法，其中所述运载组合物选择性地归巢于肿瘤。
17.权利要求16的方法，其中所述运载组合物选择性地归巢于肿瘤血管。
18.权利要求1-17任一项的方法，其中所述氨基酸序列被选择以用于内化至细胞中。
19.权利要求1-17任一项的方法，其中所述氨基酸序列被选择以用于组织穿透。
20.权利要求1-17任一项的方法，其中所述氨基酸序列被选择以用于内化至细胞中和 组织穿透。
21.一种由包括如下步骤的方法制备的CendR缀合物(a)选择一种氨基酸序列用于内化至细胞中和/或穿透组织，其中所述氨基酸序列包 含一个CendR元件，(b)使一种运载组合物共价偶联于或非共价缔合于一种包含所述选择的氨基酸序列 的蛋白或肽，其中所述运载组合物偶联或缔合于所述蛋白或肽的所述CendR元件的N端 侧，其中所述CendR缀合物包含所述蛋白或肽以及所述偶联或缔合的运载组合物。
22.权利要求21的CendR缀合物，其中所述CendR元件为可活化的CendR元件。
23.权利要求22的CendR缀合物，其中所述可活化的CendR元件为蛋白酶可活化的 CendR元件。
24.权利要求21-23任一项的CendR缀合物，其中所述蛋白或肽是环状的。
25.权利要求21的CendR缀合物，其中所述CendR元件位于所述蛋白或肽的C末端。
26.权利要求21-25任一项的CendR缀合物，其中所述氨基酸序列被选择以用于内化 至细胞中。
27.权利要求21-25任一项的CendR缀合物，其中所述氨基酸序列被选择以用于组织穿透。
28.权利要求21-25任一项的CendR缀合物，其中所述氨基酸序列被选择以用于内化 至细胞中和组织穿透。
29.—种将运载组合物递送至细胞中的方法，所述方法包括(a)将一个CendR元件偶联于所述运载组合物，从而形成一种CendR缀合物；并且(b)将所述细胞暴露于所述CendR缀合物，其中所述CendR缀合物然后可以进入所 述细胞，从而将所述运载组合物递送至所述细胞中。
30.权利要求29的方法，其中所述CendR元件为可活化的CendR元件。
31.权利要求30的方法，其中所述可活化的CendR元件为蛋白酶可活化的CendR元件。
32.权利要求29-31任一项的方法，其中所述蛋白或肽是环状的。
33.权利要求30-32任一项的方法，其中在所述细胞暴露于所述CendR元件时，一种 切割剂活化所述CendR缀合物的可活化CendR元件。
34.权利要求29的方法，其中所述CendR元件位于所述蛋白或肽的C末端。
35.—种鉴定可以内化CendR元件的细胞的方法，所述方法包括(a)将一种细胞暴露于一个CendR元件；(b)确定所述CendR元件是否被内化。
36.权利要求35的方法，其中所述细胞在一个测定中。
37.权利要求35或36的方法，其中所述CendR元件偶联于一种蛋白或肽。
38.权利要求35-37任一项的方法，其中所述CendR元件为可活化的CendR元件。
39.权利要求38的方法，其中所述可活化的CendR元件为蛋白酶可活化的CendR元件。
40.权利要求35-39任一项的方法，其中所述蛋白或肽是环状的。
41.权利要求35-40任一项的方法，其中所述可活化的CendR元件在暴露于所述细胞之前被活化。
42.权利要求35-37任一项的方法，其中所述CendR元件位于所述蛋白或肽的C末端。
43.权利要求38-41任一项的方法，其中所述可活化的CendR元件为蛋白酶可活化的 CendR元件。
44.一种鉴定癌细胞作为基于CendR的疗法的候选物的方法，所述方法包括(a)将所述癌细胞暴露于一个CendR元件；(b)确定所述CendR元件是否被所述癌细胞内化，其中内化的CendR元件将所述癌 细胞鉴定为基于CendR的疗法的候选物。
45.权利要求44的方法，其中所述细胞在一个测定中。
46.权利要求44的方法，其中所述细胞在受试者中。
47.权利要求44-46任一项的方法，其中所述CendR元件偶联于一种蛋白或肽。
48.权利要求44-47任一项的方法，其中所述CendR元件为可活化的CendR元件。
49.权利要求48的方法，其中所述可活化的CendR元件为蛋白酶可活化的CendR元件。
50.权利要求48-49任一项的方法，其中所述蛋白或肽是环状的。
51.权利要求48-47任一项的方法，其中所述CendR元件位于所述蛋白或肽的C末端。
52.一种产生可活化的CendR元件的方法，所述可活化的CendR元件在接近目的细胞 时可以被活化，所述方法包括形成一个可活化的CendR元件，其中一个封闭基团经可切 割键偶联于一个CendR元件，其中所述可切割键可被存在于目的细胞附近的酶切割。
53.权利要求52的方法，其中所述细胞在受试者中。
54.权利要求52或53的方法，还包括在形成所述可活化的CendR元件之前鉴定存在 于目的细胞附近的酶。
55.权利要求52-54任一项的方法，还包括在形成所述可活化的CendR元件之前，基 于存在于目的细胞附近的酶选择所述可切割键。
56.一种形成可活化的CendR元件的方法，所述方法包括(a)选择一种氨基酸序列用于内化至细胞中和/或穿透组织，其中所述氨基酸序列包 含一个CendR元件，(b)使一个封闭基团共价偶联于所述CendR元件，其中偶联所述封闭基团和所述 CendR元件的键是可切割的，其中共价偶联于所述CendR元件的所述封闭基团可减少或 阻止细胞内化和/或组织穿透，其中所述可活化的CendR元件包含所述选择的氨基酸序列和所述封闭基团。
57.权利要求56的方法，其中所述CendR元件包含末端羧基，其中所述封闭基团偶 联于所述末端羧基。
58.权利要求57的方法，所述方法还包括，在步骤(b)之前选择可被存在于目的细胞 附近的蛋白酶切割的、偶联所述封闭基团和所述末端羧基的键。
59.权利要求56的方法，其中所述封闭基团偶联于所述CendR元件的C端氨基酸。
60.权利要求56的方法，其中所述封闭基团偶联于所述CendR元件的C端氨基酸之外的所述CendR元件的氨基酸。
61.权利要求56-60任一项的方法，其中一种运载组合物共价偶联于或非共价缔合于 一种包含所述选择的氨基酸序列的蛋白或肽，其中所述运载组合物偶联或缔合于所述蛋 白或肽的所述CendR元件的N端侧。
62.权利要求56-61任一项的方法，其中所述氨基酸序列被选择以用于内化至细胞中。
63.权利要求56-61任一项的方法，其中所述氨基酸序列被选择用于组织穿透。
64.权利要求56-61任一项的方法，其中所述氨基酸序列被选择以用于内化至细胞中 和组织穿透。
65.权利要求56-62任一项的方法，其中共价偶联于所述CendR元件的所述封闭基团 可减少或阻止细胞内化。
66.权利要求56-61或63任一项的方法，其中共价偶联于所述CendR元件的所述封 闭基团可减少或阻止组织穿透。
67.权利要求56-61或64任一项的方法，其中共价偶联于所述CendR元件的所述封 闭基团可减少或阻止细胞内化和组织穿透。
68.一种由包括如下步骤的方法制备的可活化的CendR元件(a)选择一种氨基酸序列用于内化至细胞中和/或穿透组织，其中所述氨基酸序列包 含一个CendR元件，(b)使一个封闭基团共价偶联于所述CendR元件，其中偶联所述封闭基团和所述 CendR元件的键是可切割的，其中共价偶联于所述CendR元件的所述封闭基团可减少或 阻止细胞内化和/或组织穿透，其中所述可活化的CendR元件包含所述选择的氨基酸序列和所述封闭基团。
69.权利要求68的CendR元件，其中所述CendR元件包含末端羧基，其中所述封闭 基团偶联于所述末端羧基。
70.权利要求69的CendR元件，其中所述方法还包括，在步骤(b)之前选择可被存 在于目的细胞附近的蛋白酶切割的、偶联所述封闭基团和所述末端羧基的键。
71.权利要求68的CendR元件，其中所述封闭基团偶联于所述CendR元件的C端氨 基酸。
72.权利要求68的CendR元件，其中所述封闭基团偶联于所述CendR元件的C端氨 基酸之外的所述CendR元件的氨基酸。
73.权利要求68-72任一项的CendR元件，其中一种运载组合物共价偶联于或非共价 缔合于一种包含所述选择的氨基酸序列的蛋白或肽，其中所述运载组合物偶联或缔合于 所述蛋白或肽的所述CendR元件的N端侧。
74.权利要求68-73任一项的CendR元件，其中所述氨基酸序列被选择以用于内化至 细胞中。
75.权利要求68-73任一项的CendR元件，其中所述氨基酸序列被选择以用于组织穿透。
76.权利要求68-73任一项的CendR元件，其中所述氨基酸序列被选择以用于内化至 细胞中和组织穿透。
77.权利要求68-74任一项的CendR元件，其中共价偶联于所述CendR元件的所述封 闭基团可减少或阻止细胞内化。
78.权利要求68-73或75任一项的CendR元件，其中共价偶联于所述CendR元件的 所述封闭基团可减少或阻止组织穿透。
79.权利要求任一项68-73或76的CendR元件，其中共价偶联于所述CendR元件的 所述封闭基团可减少或阻止细胞内化和组织穿透。
80.一种鉴定可以被CendR元件穿透的组织的方法，所述方法包括(a)将一种组织暴露于一个CendR元件，并且(b)确定所述CendR元件是否穿透所述组织。
81.一种鉴定肿瘤作为基于CendR的疗法的候选物的方法，所述方法包括(a)将所述肿瘤暴露于一个CendR元件，并且(b)确定所述CendR元件是否穿透所述肿瘤，其中穿透的CendR元件将所述肿瘤鉴 定为基于CendR的疗法的候选物。
82.一种鉴定肿瘤作为基于CendR的疗法的候选物的方法，所述方法包括(a)将来自所述肿瘤的细胞暴露于一个CendR元件，并且(b)确定所述CendR元件是否被所述细胞内化，其中内化的CendR元件将所述肿瘤 鉴定为基于CendR的疗法的候选物。
全文摘要
公开了用于将分子靶向和内化至目的细胞以及用于分子穿透目的组织的组合物和方法。所述组合物和方法是基于可被细胞选择性地内化以及/或者可穿透组织的肽序列。所公开的内化和组织穿透可用于将治疗试剂和可检测试剂递送至目的细胞和组织。
文档编号C12P21/04GK102016058SQ200980114056
公开日2011年4月13日 申请日期2009年2月20日 优先权日2008年2月21日
发明者E·罗斯拉赫蒂, T·特萨鲁, 菅原一树 申请人:伯纳姆医学研究所