新的突变羟基苯基丙酮酸双加氧酶，dna序列和耐受hppd抑制剂除草剂的植物分离的制作方法

专利名称：新的突变羟基苯基丙酮酸双加氧酶，dna序列和耐受hppd抑制剂除草剂的植物分离的制作方法
新的突变羟基苯基丙酮酸双加氧酶，DNA序列和耐受HPPD 抑制剂除草剂的植物分离 本发明涉及编码突变的羟基苯基丙酮酸双加氧酶(hydroxyphenylpyruvate dioxygenase) (HPPD)的核酸序列、包含该序列作为编码序列的嵌合基因以及其在获得耐受 HPPD抑制剂除草剂的植物中的用途。羟基苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD ；EC 1. 13. 11. 27)是一种酶，其催化酪氨酸降解 产物-对羟基苯基丙酮酸(HPP)转化为植物中生育酚和质体醌的前体-尿黑酸(HG)的反 m (Crouch 1卩等，1997;卩1"行狀等，2004)。生育酚起到膜相关抗氧化剂的作用。质体醌 首先是PSII和细胞色素b6/f复合物之间的电子载体，然后是参与类胡萝卜素生物合成的 八氢番茄红素去饱和酶的氧化还原辅因子。大多数植物通过预苯氨酸(arrogenate)合成酪氨酸(Abou-Zeid等1995 ；Bonner 等，1995 ；Byng 等，1981 ；Connely 和 Conn 1986 ；Gaines 等，1982)。在这些植物中，HPP 仅 来自于酪氨酸降解。另一方面，在如酵母酿酒酵母(Sacharomycescerevisiae)或细菌大 肠杆菌(Escherichia coli)等生物体中，HPP是酪氨酸前体，由预苯酸脱氢酶(此后称为 PDH)的作用合成，该酶将预苯酸转化为HPP (Lingens等，1967 ；Sampathkumar和Morrisson 1982)。因此在这些生物体中，HPP的产生直接与芳香族氨基酸的生物合成途径(莽草酸途 径)而非酪氨酸降解途径相关。抑制HPPD导致光合作用的解偶联、辅助捕光色素缺乏，最重要的是，由于缺乏通 常由类胡萝卜素提供的光保护作用，紫外线辐射和活性氧中间体导致叶绿素破坏(Norris 等1995)。对光合作用活性组织进行光漂白会导致生长抑制和植物死亡。一些抑制HPPD和与所述酶特异性结合以抑制HPP转化为尿黑酸的分子已证实是 非常有效的选择性除草剂。市场上最易买到的HPPD抑制剂除草剂属于以下四个化学家族之一1)三酮类，例如，磺草酮(sulcotrione)(即2-[2_氯_4-(甲磺酰基)苯甲酰 基]-1，3-环己二酮)、甲基磺草酮(mesotrione)(即2_[4_(甲磺酰基)_2_硝基苯甲酰 基]-1，3-环己二酮)、特波三酮(tembotrione)(即2_[2_氯_4_(甲磺酰基)-3-[ (2，2， 2-三-氟乙氧基)甲基]苯甲酰基]-1，3-环己二酮)；2) 二酮腈(diketonitrile)类，例如，2_氰基_3_环丙基(2_甲磺酰基_4_三 氟甲基苯基)-丙烷-1，3- 二酮和2-氰基-1- [4-(甲磺酰基)-2-三氟甲基苯基]-3- (1-甲 基环丙基)丙烷-1，3-二酮；3)异噁唑类，例如，异噁氟草(isoxaflutole)(即5_环丙基_4_异噁唑基[2_(甲 磺酰基)-4-(三氟甲基)苯基]甲酮)。在植物中，异噁氟草在DKN中快速代谢，后者是一 种表现出HPPD抑制剂性质的二酮腈化合物；以及4)吡唑特(pyrazolinate)类，例如，苯吡唑草酮(topramezone)(即[3_(4，5_ 二 氢-3-异噁唑基)-2-甲基-4-(甲磺酰基)苯基](5-羟基-1-甲基-IH-吡唑-4-基)甲 酮)和吡拉塞佛托(pyrasulfotole) (5-羟基-1，3-二甲基吡唑-4-基(2-甲磺酰-4-三 氟甲基苯基)甲酮)。
这些HPPD抑制除草剂可用于表现出代谢耐受性的作物如玉米(Zeamays)中的 草和/或阔叶杂草，这些除草剂在其中可快速降解(Schulz等，1993 ；Mitchell等，2001 ； Garcia等，2000 ；Pallett等，2001)。为了拓展这些HPPD抑制除草剂的范围，已作出努力 以赋予植物，尤其是不具有或具有未充分发挥的代谢耐受性的植物对它们的农业水平耐受性。
除试图绕过HPPD介导的尿黑酸产生(US 6，812，010)夕卜，已进行了该敏感酶的过 表达以在植物中产生大量对除草剂充足的靶酶(W096/38567)。HPPD的过表达引起了对异 噁氟草(IFT)的二酮腈衍生物(DKN)更好的萌发前耐受性，但该耐受性不足以作为萌发后 处理的耐受性(Matringe等，2005)。另一种策略是对HPPD进行突变以获得相对突变前的天然HPPD对HPPD抑制剂敏 感性较低的靶酶，而同时保留其催化HPPD转化为尿黑酸的性质。该策略已成功应用于生产耐受两种属于二酮腈家族的HPPD抑制除草剂(W0 99/24585) 2-氰基-3-环丙基-1- (2-甲磺酰基-4-三氟甲苯基)-丙烷-1，3- 二酮和 2_氰基-l-[4-甲磺酰基-2-三氟甲苯基]-3-(l-甲基环丙基)丙烷-1，3-二酮的植物 (ΕΡ496630)。鉴定 Pro215Leu、Gly336Glu、Gly336Il、特别是 Gly336Trp (突变氨基酸的位 置根据SEQ ID NO 2的假单胞菌(PseUdomonas)HPPD标出)是引起对二酮腈除草剂萌发前 处理耐受性增强但并不造成酶活性改变的突变。最近，已证实将假单胞菌HPPD基因导入烟草和大豆的质体基因组远比核转化有 效，赋予对异噁氟草的萌发后使用相同的耐受性(Dufourmantel等，2007)。在WO 04/024928中，发明人设法通过增强HPP前体进入植物细胞的流量来增强植 物细胞中异戊烯苯醌的生物合成(例如，质体醌和生育酚的合成)。这通过过表达PDH酶将 所述前体的合成与“莽草酸”途径进行连接而完成。他们还注意到，用编码PDH酶的基因转 化植物有可能增强所述植物对HPPD抑制剂的耐受性。尽管对二酮腈除草剂表现出耐受性的植物的开发已经获得了这些成功，仍然有必 要开发和/或改进对HPPD抑制剂的耐受性系统，特别是对属于三酮类(例如，磺草酮、甲基 磺草酮和特波三酮)和吡唑特类(例如，苯吡唑草酮和吡拉塞佛托)的HPPD抑制剂。因此，本发明涉及新的突变HPPD酶，其保留催化对羟基苯基丙酮酸(HPP)转化为 尿黑酸的性质，且对HPPD抑制剂的敏感性低于原始的未突变HPPD，其特征在于它们在SEQ ID NO :2所示假单胞菌HPPD的第336位(天然HPPD中为氨基酸甘氨酸)包含一个选自 以下突变的突变Gly336Arg、Gly336His、Gly336Met、Gly336Phe、Gly336Asn、Gly336Cys、 Gly336Val、Gly336Trp、Gly336Glu 和 Gly336Asp。在一个具体的实施方式中，SEQ ID NO 2所示假单胞菌HPPD在第336位的突变 选自以下突变Gly336Arg、Gly336His、Gly336Met、Gly336Phe、Gly336Asn、Gly336Cys 和 Gly336Val，条件是突变的HPPD不是双重突变体Gly334Ala_Gly336Arg (位置根据SEQ ID NO 2所示假单胞菌HPPD给出)。在一个更具体的实施方式中，SEQ ID NO 2所示假单胞菌HPPD在第336位的突变 选自以下突变Gly336His、Gly336Met、Gly336Cys 和 Gly336Phe。在另一个具体的实施方式中，HPPD酶来自植物，特别是来自拟南芥(Arabidopsis thai iana), SEQ ID NO :4所示拟南芥HPPD的氨基酸序列在第422位(即SEQ ID NO :2的假
5单胞菌HPPD的第336位)的甘氨酸包含一个选自以下突变的突变Gly336Arg、Gly336His、 Gly336Met、Gly336Phe、Gly336Asn、Gly336Cys、Gly336Val、Gly336Trp、Gly336Glu 和 Gly336Asp。在一个更具体的实施方式中，SEQ ID NO 4所示拟南芥HPPD在第422位(即SEQ ID NO 2的假单胞菌HPPD的第336位)的突变选自以下突变Gly336His、Gly336Asn、 Gly336Cys和Gly336Val，且突变的HPPD来自植物，特别是来自拟南芥。应注意，SEQ ID NO 2所示假单胞菌HPPD的第336位是SEQ ID NO 4所示拟南芥HPPD的第422位。在一个具体的实施方式中，本发明的突变HPPD对异噁唑类、二酮腈类、三酮类、吡 唑特类的HPPD抑制剂除草剂的敏感性低于原始的未突变HPPD。在一个具体的实施方式中，本发明的突变HPPD对选自以下的HPPD抑制剂除草 剂的敏感性低于原始的未突变HPPD 异噁氟草、特波三酮、甲基磺草酮、磺草酮、吡拉塞佛 托、苯吡唑草酮、2-氰基-3-环丙基-l-(2-S02CH3-4-CF3苯基)-丙烷-1，3- 二酮和2-氰 基-3-环丙基-1-(2-S02CH3-4-2, 3C12 苯基)丙烷-1，3- 二酮。在另一个具体的实施方式中，本发明的突变HPPD对以下HPPD抑制剂的敏感性低 于原始的未突变HPPD 三酮类(称为三酮HPPD抑制剂)，如特波三酮、磺草酮和甲基磺草 酮，特别是特波三酮，或吡唑特类(称为吡唑特HPPD抑制剂)，如吡拉塞佛托和苯吡唑草酮。在一个更具体的实施方式中，本发明的突变HPPD对选自特波三酮、磺草酮和甲基 磺草酮，特别是特波三酮的三酮HPPD抑制剂的敏感性低于原始的未突变HPPD。在另一个具体的实施方式中，除SEQ ID NO 2所示假单胞菌HPPD的第336位的氨 基酸甘氨酸上的第一突变外，本发明的突变HPPD还包含第二突变。在一个更具体的实施方式中，第二突变氨基酸选自以下SEQ ID NO 2所示假单胞 菌 HPPD 序列的氨基酸Pro215、Gly298、Gly332、Phe333、Gly334 和 Asn337。本发明还提供突变的HPPD酶，其保留催化对羟基苯基丙酮酸(HPP)转化为尿黑酸 的性质，且对以下HPPD抑制剂的敏感性低于原始的未突变HPPD 三酮类，如特波三酮、磺草 酮和甲基磺草酮，或吡唑特类，如吡拉塞佛托和苯吡唑草酮，其特征在于它们在SEQ ID NO 2所示假单胞菌HPPD第336位的氨基酸甘氨酸包含突变，以及提供使用这样的酶使植物对 这些HPPD抑制剂具有耐受性，即，将三酮类或吡唑特类除草剂施用于表达这样突变体酶的 植物的，而植物通过在其基因组中包含编码在SEQ ID NO 2所示假单胞菌HPPD的第336位 突变的某些HPPD酶的基因而对这样的三酮类或吡唑特类HPPD抑制剂具有耐受性的过程。在本发明一个具体的实施方式中，突变的HPPD酶对三酮类如特波三酮、磺草酮 和甲基磺草酮的HPPD抑制剂的敏感性低于原始的未突变HPPD，突变根据选自以下突变 的突变，发生在SEQ ID NO 2所示假单胞菌HPPD的第336位Gly336Arg、Gly336Asp、 Gly336Glu、Gly336His、Gly336Met、Gly336Phe、Gly336Trp、Gly336Asn、Gly336Cys 和 Gly336Val。在本发明一个具体的实施方式中，突变的HPPD酶对三酮类如特波三酮、磺草酮和 甲基磺草酮的HPPD抑制剂的敏感性低于原始的未突变HPPD，突变根据选自以下突变的突 变，发生在 SEQ ID NO 2 所示假单胞菌 HPPD 的第 336 位Gly336His、Gly336Met、Gly336Phe 和 Gly336CySo现有技术已对若干HPPD及其初级序列进行了描述，特别是以下HPPD 如假单胞菌等细菌(Ruetschi 等，Eur. J. Biochem.，205，459-466，1992，W096/38567)、如拟南芥(W0 96/38567，Genebank AF047834)、胡萝卜(W0 96/38567，Genebank 87257)、燕麦(Avena sativa)(W0 02/046387)、小麦(W0 02/046387)、臂形草(Brachiaria platyphylla) (W0 02/046387)、蒺藜草(Cenchrusechinatus) (W0 02/046387)、刚性黑麦草(Lolium rigidum) (W0 02/046387)、苇状羊茅(Festuca arundinacea) (W0 02/046387)、大狗尾草 (Setariafaberi) (W0 02/046387)、牛筋草(Eleusine indica) (W0 02/046387)和高粱 (W002/046387)等植物、球孢子菌(Coccicoides) (Genebank C0ITRP)或如小鼠或猪等哺乳 动物的。显示的参考文献中公开的相应序列通过引用纳入本文。通过比对这些已知序列，采用本领域的惯例手段，例如，Thompson, J. D.等描述的 方法(CLUSTAL W:“通过序列加权、位点特异性空位罚分和加权矩阵选择来提高渐进的多 序列比对的敏感性”(improving the sensitivity ofprogressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice. )Nucleic Acids Research, 22 ；4673-4680，1994)，进入这些通过互 联网可获得的序列比对的计算机程序，技术人员能够确定与参比序列的序列同源性并找到 关键氨基酸或确定共有区域。以本发明为例，参比序列是假单胞菌序列，除非特别说明，对具体氨基酸位置的定 义和说明所有均根据SEQ ID NO :2所示初级假单胞菌HPPD序列作出。附

图1显示现有技 术中描述的若干HPPD序列的比对；这些序列的比对以假单胞菌HPPD序列作为参比序列， 包括以下 HPPD 序列阿维链霉菌(Str印tomycesavermitilis) (Genebank SAV 11864)、胡 萝卜(Daucus carota) (Genebank DCU87257)、拟南芥(Genebank AF047834)、玉米、大麦 (Hordeum vulgare) (GenebankHVAJ693)、小麦叶枯病菌(Mycosphaerella graminicola) (Genebank AF038152)、粗球孢子菌(Coccicoides immitis) (Genebank C0ITRP)和小鼠 (Musmusculus) (Genebank MU54HD)。该图提供假单胞菌序列的氨基酸编号，还有这些序列 共有的氨基酸，其中这些氨基酸由星号表示。根据这样的比对，从假单胞菌氨基酸的位置和 性质的定义不难鉴定另一个HPPD序列中的相应氨基酸的位置。图1显示可通过比对不同 植物、哺乳动物和细菌来源的序列做到这点，表明技术人员熟知的该比对方法通用于任何 其它序列。专利申请WO 97/49816中也描述了不同HPPD序列的比对。在W099/24585中，对假单胞菌HPPD单体三级结构的分析显示HPPD的C末端部分 存在，其是酶的活性位点所在，通过保证酶稳定性及其寡聚化(假单胞菌HPPD是四聚体，植 物HPPD是二聚体)的连接肽与其N末端部分连接。该结构由研究晶体X光衍射的常规方 法获得。连接肽可能确定酶C末端部分的N末端，其中以假单胞菌为例，所述连接肽位于第 145位和第157位的氨基酸之间(参见图1)。在附图1所示的序列比对中显示的所有序列 中均会注意到假单胞菌序列中位于第161位和第162位的两个氨基酸(D = Aspl61, H = Hisl62)。根据假单胞菌HPPD，由此可能确定连接肽位于氨基酸Aspl61上游约5到15个氨 基酸之间。根据本发明，应理解“突变的HPPD”为HPPD初级序列的至少一个氨基酸被另一个 氨基酸取代。表述“突变氨基酸”以下用于表示被另一个氨基酸取代的氨基酸，从而表示蛋 白质初级序列中的突变位点。根据本发明，突变发生在SEQ ID NO 2所示假单胞菌序列第336位的氨基酸甘氨酸上，其几乎是所有已鉴定的HPPD序列共有的。在至今已知的240个HPPD序列中，有238 个在第336位包含甘氨酸，仅有聚球菌属(Synechococcussp. )JA-3-3Ab (Acc-No Q2JX04) 和聚球菌属JA-2-3B' a(2-13) (Acc-No Q2JPN8)的HPPD序列在该位置上是丙氨酸。Gly336 是发现于大多数HPPD序列的共有序列“Gly-Phe-Gly-X-Gly-Asn-Phe”的一部分，其中在各 种来源的HPPD中，X可以是20种氨基酸中的任何一种，这可能通过序列比对方法鉴定任何 来源HPPD中的Gly336而没有任何困难。作为例子，假单胞菌序列的Gly336是SEQ ID NO :4所示拟南芥序列的Gly422 (见 图1)，但本文提到的Gly是SEQ ID NO :2所示假单胞菌序列的参比位置第336位的Gly (除 非特别说明)，即使本发明的突变可发生在任何有用的HPPD酶中而并非必然在假单胞菌 HPPD 中。HPPD的酶活性可通过任何方法测定，从而能测定HPP或O2底物量的减少、或测 定任何来源于酶反应的产物即尿黑酸或CO2的积累。特别是，HPPD活性可通过Garcia等 (1997)或Garcia等(1999)中描述的方法测定，二者通过引用纳入本文。根据本发明，三酮类的HPPD抑制剂(或三酮HPPD抑制剂)指具有三酮骨架的HPPD 抑制剂。这样的三酮HPPD抑制剂的一个例子是磺草酮(即2-[2_氯-4-(甲磺酰基)苯甲 酰基]-1，3-环己二酮)、甲基磺草酮(即2- [4-(甲磺酰基)-2-硝基苯甲酰基]-1，3-环己 二酮)和特波三酮(即2-[2_氯-4-(甲磺酰基)-3-[2，2，2_三-氟乙氧基甲基]苯甲酰 基]-1，3-环己二酮)。根据本发明，吡唑特类的HPPD抑制剂(或吡唑特HPPD抑制剂)指具有吡唑基的 HPPD抑制剂。这样的吡唑特HPPD抑制剂的一个例子是苯吡唑草酮(即[3-(4，5_二氢-3-异 噁唑基)-2_甲基-4-(甲磺酰基)苯基](5-羟基-1-甲基-IH-吡唑-4-基)甲酮)和吡 拉塞佛托[(5-羟基-1，3-二甲基吡唑-4-基(2-甲磺酰-4-三氟甲苯基)甲酮)。在本发明的另一个实施方式中，除Gly336的突变外，HPPD在第二氨基酸位置也发 生了突变。该第二突变的存在可进一步增强对与第一突变赋予耐受性的同一 HPPD抑制剂 除草剂的耐受性，或可赋予对另一 HPPD抑制剂除草剂的耐受性。WO 99/24585描述了这些 突变赋予对HPPD抑制剂特别是对二酮腈类和异噁唑类的耐受性的例子。在本发明的一个具体的实施方式中，第二突变的氨基酸选自以下SEQID NO :2所 示假单胞菌序列的参比氨基酸Pro215、Gly332、Phe333、Gly334和Asn337，以及假单胞菌 序列中的Gly298(最后这个氨基酸在其它HPPD中没有对应物，见图1)。在本发明的一个实施方式中，第二突变的氨基酸是SEQ ID NO :2所示假单胞菌序 列的Pro215，该突变特别是Pro215Leu。本发明也涉及一种核酸序列，特别是分离的DNA，其编码如上所述的突变的HPPD。本发明也涉及一种编码突变的HPPD酶的核酸序列，其中突变的HPPD酶保留催化 对羟基苯基丙酮酸(HPP)转化为尿黑酸的性质，且对以下HPPD抑制剂的敏感性低于原始的 未突变HPPD 三酮类，如特波三酮、磺草酮和甲基磺草酮，或吡唑特类，如吡拉塞佛托和苯 吡唑草酮，其特征在于其在SEQ IDNO 2所示假单胞菌HPPD的第336位氨基酸甘氨酸包含 突变。在一个更具体的实施方式中，本发明的核酸序列编码突变的HPPD酶，其对三酮 类的HPPD抑制剂如特波三酮、磺草酮和甲基磺草酮的敏感性低于原始的未突变HPPD，且其中HPPD根据选自以下的突变，在SEQ ID NO :2所示假单胞菌HPPD的第336位发生突 变:Gly336Arg, Gly336Asp、Gly336Glu、Gly336His、Gly336Met、Gly336Phe、Gly336Trp、 Gly336Asn、Gly336Cys和 Gly336VaL·在一个更为具体的实施方式中，本发明的核酸序列编码突变的HPPD酶，其对三酮 类的HPPD抑制剂如特波三酮、磺草酮和甲基磺草酮的敏感性低于原始的未突变HPPD，且其 中HPPD根据选自以下的突变，在SEQ ID NO :2所示假单胞菌HPPD的第336位发生突变 Gly336His、Gly336Met、Gly336Phe 和 Gly336Cys。根据本发明，“核酸序列”应理解为DNA或RNA型的核苷酸序列，优选DNA型，特别 是双链，无论是天然或合成来源，特别是其中编码本发明突变HPPD的密码子已根据要在其 中表达的宿主生物体进行了优化(例如，通过采用相比原始宿主在该宿主生物体或该宿主 生物体所属组的密码子使用表中更优选或最优选的密码子进行密码子取代)，这些优化方 法为本领域技术人员所熟知。本文使用的“分离的DNA ”指非天然产生或不再存在于其原始存在的天然环境中的 DNA，例如，嵌合基因中与其它调控元件相关的DNA编码序列、转移到另一个宿主细胞如植 物细胞中的DNA、或相比任何已知天然产生的DNA具有不同核苷酸序列的人工合成的DNA。编码根据本发明将发生突变的原始未突变HPPD的序列可来自任何来源。其特 别可来自细菌来源。有利例子是假单胞菌属的细菌，例如荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，(Synechocystis) MWMi^ (cyanobacteria) 。Μ ；!5歹自 植物来源，特别是来自双子叶植物、伞状花科植物或单子叶植物。有利例子是植物，如烟草、 拟南芥、胡萝卜、玉米、小麦、大麦、燕麦、小麦、臂形草、蒺藜草、刚性黑麦草、苇状羊茅、大狗 尾草、牛筋草和高粱。之前引用的参考文献中描述了所述编码序列以及分离和克隆所述编 码序列的方法，这些参考文献的内容通过引用纳入本文。在本发明一个具体的实施方式中，所述HPPD来自细菌来源，特别是来自假单胞菌 属，更特别的是来自荧光假单胞菌，或来自植物来源，特别是来自拟南芥。为本发明目的而突变的HPPD可为任何天然产生的HPPD，或其任何活性片段或其 任何变体，其中一些氨基酸(1-10个氨基酸)为克隆目的而被取代、添加或缺失，以形成转 运肽融合等，其保留HPPD活性，即催化对羟基苯基丙酮酸转化为尿黑酸的性质。根据本发明，所述HPPD可为嵌合HPPD。术语“嵌合HPPD”是表示包含来自各种 HPPD的元件的HPPD。专利申请WO 99/24586中特别描述了这样的嵌合HPPD。所述突变可发生在编码原始的未突变HPPD的核酸序列中，可采用任何适当的手 段在所述序列中以对应于用于取代的氨基酸的密码子取代编码突变氨基酸的密码子，其中 所述密码子在文献中有广泛描述，且为本领域技术人员熟知。若干分子生物学方法可用于获得该突变。—种制备本发明突变核酸序列和相应蛋白质的优选方法，包括在编码一个或多个 预先选择的氨基酸的密码子上实施定点突变，包括SEQ ID NO: 2所示假单胞菌HPPD序列 的参比位置Gly336的密码子。获得这些定点突变的方法为本领域技术人员熟知，在文献中 有广泛描述(特别是在《定点突变一种实用方法》(Directed Mutagenesis =A Practical Approach)，1991,Μ. J. McPHERSON编，IRL出版社)，或为可能运用商业试剂盒的方法(例如 法玛西亚公司(PHARMACIA)的U. S. Ε.突变试剂盒)。定点突变后，通过采用适当的筛选辅助方法，选择包含对HPPD抑制剂具有较低敏感性的突变HPPD的细胞是有用的。一种易于 实施的筛选方法是测定完全抑制原始的未突变HPPD且对表达该未突变HPPD的细胞致死的 HPPD抑制剂的剂量，并对突变细胞施加该预定剂量，然后分离耐受该致死剂量的突变细胞， 接着分离并克隆编码该突变HPPD的基因。基于本发明一个具体的实施方式和广泛流行的 解决方法，即对三酮或吡唑特HPPD抑制剂具有较低敏感性的HPPD，可如上所述进行筛选， 采用三酮或吡唑特HPPD抑制剂，特别是选自特波三酮、甲基磺草酮、吡拉塞佛托、苯吡唑草 酮和磺草酮的HPPD抑制剂。基于本发明的另一个实施方式，即除SEQ ID NO :2所示假单胞菌HPPD序列的第 336位的参比氨基酸上的第一突变外，在第二氨基酸上又发生突变的HPPD，可通过与第一 突变同时或相继进行定点突变获得第二突变。作为上述定点突变的替代方法，可采用与适当筛选辅助方法相关的随机突变方法 (如EMS或辐射处理)获得第二突变。这样的突变方法为本领域技术人员熟知，在文献中有 充分描述(特别是Sambrook等，1989)。可如上所述实施筛选方法。本文中通用的术语“包含”某个序列X的DNA或蛋白质指至少包括或包含序列X的 DNA或蛋白质，以使其它核苷酸或氨基酸序列可包括于5'(或N末端)和/或3'(或C 末端)端，例如，选择性标记蛋白质(的核苷酸序列)、转运肽(的核苷酸序列)和/或5' 前导序列或3'尾随序列。类似地，本申请全文和权利要求书中使用的术语“包含”应理解 为意指包括所述的整数或步骤或一组整数或步骤，而不排除任何其它整数或步骤或其它组 整数或步骤。因此本发明也涉及一种制备编码本发明突变HPPD的核酸序列的方法，所述方法 如上定义。本发明也涉及编码本发明突变HPPD的核酸作为标记基因或可能赋予植物对HPPD 抑制剂除草剂耐受性的编码序列在转化植物方法中的用途，以及HPPD抑制剂在包含编码 本发明突变HPPD的核酸序列的植物上的用途。在本发明的一个实施方式中，在这样的用途 中，HPPD抑制剂为三酮类或吡唑特类，优选特波三酮、甲基磺草酮和磺草酮。当然应理解， 该序列也可与其它(另一)基因标记和/或编码一个或多个具有有用农业性质的蛋白质的 序列结合使用。在编码赋予转化植物有用农艺性质的蛋白质的基因中有编码赋予对某些除草剂 耐受性、赋予对某些昆虫耐受性、赋予对某些疾病耐受性等的蛋白质的DNA序列。专利申 请TO91/02071和W095/06128特别描述了这样的基因。在编码赋予转化植物细胞和植物 对某些除草剂耐受性的DNA序列中有赋予对草丁膦除草剂耐受性的bar基因、编码赋予 对具有EPSPS靶的除草剂如草甘膦及其盐的耐受性的合适EPSPS的基因(US 4，535，060、 US4, 769，061、US 5，094，945、US 4，940，835、US 5，188，642、US 4，971，908、US5，145,783、 US 5, 310, 667,US 5, 312, 910,US 5, 627, 06UUS 5，633，435)、编码草甘膦氧化还原酶的基 因(US 5，463，175)。在编码赋予对具有EPSPS靶的除草剂耐受性的合适EPSPS的DNA序列中，特别有 编码植物EPSPS，特别是玉米EPSPS的基因，其具有102和106两个突变，在专利申请FR 2736926中有描述，此后称为EPSPS双突变体，或编码从农杆菌分离的EPSPS的基因，由美国 专利5，633，435的序列ID No. 2和序列ID No. 3描述，此后称为CP4。
在编码EPSPS、更特别是编码以上基因的DNA序列的情况中，编码这些酶的序列之 前最好存在编码转运肽的序列，特别是美国专利5，510，471或5，633，448描述的编码“优化 转运肽”的序列。在编码赋予对昆虫耐受性的新性质的感兴趣蛋白质的DNA序列中，更特别有文献 中广泛描述且为本领域技术人员熟知的Bt蛋白质。还有从细菌如发光杆菌(W0 97/17432 和TO 98/08932)中提取的蛋白质。本发明也涉及一种嵌合基因(或表达盒)，在5’和/或3’位置，至少在5’位置 包含编码序列以及异源调控元件，它们能够在宿主生物体特别是植物细胞或植物中发挥作 用，其中编码序列包含至少一个如前定义的编码突变HPPD的核酸序列。因此本发明涉及一种嵌合基因(或表达盒)，在5’和/或3’位置，至少在5’位置 包含编码序列以及异源调控元件，它们能够在宿主生物体特别是植物细胞或植物中发挥作 用，其中编码序列包含至少一个如前定义的核酸序列。在一个具体的实施方式中，本发明涉及一种如前所述的嵌合基因，其中宿主生物 体选自细菌、酵母、毕赤酵母(Pichia)、真菌、杆状病毒、植物细胞和植物。在另一个具体的实施方式中，本发明涉及一种如前所述的嵌合基因，其中该嵌合 基因在编码突变HPPD核酸序列的5’位置包含编码植物转运肽的核酸序列，其中该序列位 于启动子区域和编码突变HPPD的序列之间，以允许转运肽/突变HPPD融合蛋白的表达。作为植物细胞和植物中的启动子调控序列，可使用植物中天然表达的基因的任何 启动子序列，特别是特别在植物叶子中表达的启动子，例如，细菌、病毒或植物来源的“组成 型”启动子，或“光依赖型”启动子，如植物核酮糖二羧化酶/加氧酶(RuBisCO)小亚基基 因的启动子，或任何合适的已知可使用的启动子。在植物来源的启动子中，可提到如专利申 请EP 0507698所述的组蛋白启动子，或水稻肌动蛋白启动子(US 5，641，876)。在植物病 毒基因的启动子中，有花椰菜花叶病毒(CAMV 19S或35S)的启动子，或环病毒启动子(AU 689311)。也可使用植物特定区域或组织的特异性调控启动子序列，如种子特异性启动子 (Datla，R.等，1997)，特别是napin启动子(EP 255378)、菜豆蛋白(phaseolin)启动子、麦 谷蛋白(glutenin)启动子、向日葵蛋白(helianthinin)启动子(TO 92/17580)、白蛋白启 动子(W0 98/45460)、油质蛋白(oleosin)启动子(W0 98/45461)、SATl 启动子或 SAT3 启 动子(PCT/US98/06978)。诱导型启动子也宜选自苯丙氨酸解氨酶(PAL)、HMG-CoA还原酶(HMG)、几丁质 酶、葡聚糖酶、蛋白酶抑制剂(PI)、PRl家族基因、胭脂碱合成酶(nos)和VspB启动子(US 5670349，表3)、HMG2启动子(US 5670349)、苹果β -半乳糖苷酶(ABGl)启动子或苹果氨 基环丙烷羧酸合成酶(ACC合成酶)启动子(W0 98/45445)。根据本发明，可联用启动子与位于启动子和编码序列之间的其它调控序列，如转 录激活剂(“增强子”)，例如专利申请WO 87/07644描述的烟草花叶病毒(TMV)的翻译激 活剂，或Carrington和Freed 1990描述的烟草蚀纹病毒(TEV)，例如，或内含子，如玉米的 adhl内含子或水稻肌动蛋白的内含子1。作为调控终止子或多聚腺苷酸化序列，可使用细菌来源的任何相应序列，如例如 根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的nos终止子，病毒来源的相应序列，如CaMV35S终止子，或植物来源的相应序列，如例如专利申请EP 0633317描述的组蛋白终止子。“宿主生物体”应理解为可为产生突变HPPD而将本发明嵌合基因引入其中的 任何单细胞或多细胞生物。这些生物，特别是细菌例如大肠杆菌、酵母特别是酿酒酵母 属(Saccharomyces)或克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属、真菌特别是曲霉 (Aspergi 1 Ius)、杆状病毒或优选植物细胞和植物。根据本发明，“植物细胞”应理解为来自或发现于植物的任何细胞，其能够形成以 下或为其一部分未分化组织如愈伤组织、分化组织如胚胎、植物的组成部分、植物或种子。根据本发明，“植物”应理解为能够进行光合作用的任何分化的多细胞生物，特 别是单子叶或双子叶生物，更特别地为用于或非用于动物或人营养的栽培植物，如玉米、 小麦、芸苔属(Brassica)植物如甘蓝型油菜(Brassicanapus)或芥菜型油菜(Brassica jimcea)、大豆、水稻、甘蔗、甜菜根、烟草、棉花、蔬菜植物如黄瓜、韭菜、胡萝卜、番茄、莴苣、 胡椒、甜瓜、西瓜等。在一个实施方式中，本发明涉及植物的转化。在植物中天然表达的基因的任何启 动子序列，或在植物中天然表达的基因的任何杂合或组合的启动子元件，包括农杆菌或植 物病毒启动子，或适合控制除草剂耐受性基因转录的任何启动子均可用作本发明植物中的 启动子调控序列。以上描述了这样合适的启动子的例子。根据本发明，也可能联用启动子调控序列与其它位于启动子和编码序列之间的调 控序列，如内含子序列，或转录激活剂(增强子)。以上描述了这样合适的调控序列的例子。细菌来源的任何相应序列，如根癌农杆菌的nos终止子，或植物来源的任何相应 序列，如专利申请EP 0 633 317描述的组蛋白终止子，均可用作转录终止(和多聚腺苷酸 化)调控元件。在本发明一个具体的实施方式中，在编码突变HPPD的核酸序列的5’采用编码转 运肽的核酸序列，其中该转运肽序列位于启动子区域和编码突变HPPD的序列之间，以允许 转运肽/突变HPPD融合蛋白的表达，其中所述突变HPPD如前所述。转运肽可能引导突变 的HPPD进入质体，更具体说是叶绿体，突变HPPD进入质体时在转运肽和突变HPPD之间切 割融合蛋白。所述转运肽可为单个肽，如EPSPS转运肽(美国专利5，188，642描述的)或植 物核酮糖二羧化酶/加氧酶小亚基(RuBisCO ssu)的转运肽，适当时包括成熟RuBisCO ssu 的N末端部分的几个氨基酸(EP 189 707)，或可为若干转运肽的融合如包含与具有质体位 置的成熟蛋白质N末端序列的一部分融合的第一植物转运肽的转运肽，其中该部分又与如 专利EP 508 909描述的第二植物转运肽融合，更具体地说，包含与玉米RuBisCO ssu N末 端的22个氨基酸融合的向日葵RuBisCO ssu的转运肽的优化转运肽又与专利EP 508 909 描述其编码序列的玉米RuBisCO ssu的转运肽融合。本发明也涉及所述转运肽/突变HPPD融合蛋白和编码这样融合蛋白的核酸或植 物可表达的嵌合基因，其中该融合蛋白的两个元件如上所述。本发明也涉及转化宿主生物体的克隆和/或表达载体，该载体包含至少一个如上 所述的嵌合基因。除以上嵌合基因外，该载体还包含至少一个复制起点。该载体可为通过引 入本发明嵌合基因已被转化的质粒、粘粒、噬菌体或病毒。这样的转化载体依赖于转化的宿 主生物体，为本领域技术人员熟知，在文献中有广泛描述。使用的转化载体特别是转化植物 细胞或植物的载体可为病毒，可用于转化发育的植物，还包含其本身的复制和表达元件。根据本发明，转化植物细胞或植物的载体优选为质粒，如卸甲的(disarmed)农杆菌Ti质粒。本发明也涉及所述宿主生物体，特别是植物细胞或植物，其是转化的，且包含如上 定义的含有编码突变HPPD序列的嵌合基因，以及本发明的植物用于田地生产作物并收获 植物产品例如大豆或玉米谷物的用途，其中在一个实施方式中，所述用途包括将HPPD抑制 剂除草剂用于这样的植物以控制杂草。在本发明的一个实施方式中，在这样的使用中，所述 HPPD抑制剂为三酮类或吡唑特类，优选特波三酮、甲基磺草酮或磺草酮，特别是特波三酮。因此，本发明涉及一种宿主生物体，特别是植物细胞或植物，其特征在于包含至少 一个如上所述的嵌合基因，或至少一个如上所述的核酸序列。在一个具体的实施方式中，本发明涉及一种植物细胞或植物，其特征在于包含 至少一个编码突变HPPD酶的核酸序列，其中突变的HPPD酶保留催化对羟基苯基丙酮酸 (HPP)转化为尿黑酸的性质，且对HPPD抑制剂的敏感性低于原始的未突变HPPD，其特征在 于其在SEQ ID NO 2所示假单胞菌HPPD的第336位(天然HPPD中为氨基酸甘氨酸)包 含选自以下的突变Gly336Arg、Gly336His、Gly336Met、Gly336Phe、Gly336Asn、Gly336Cys 和Gly336Val，条件是突变的HPPD不是双重突变体Gly334Ala_Gly336Arg (位置根据SEQ IDNO 2所示假单胞菌HPPD给出)。在一个更具体的实施方式中，本发明涉及一种植物细胞或植物，其特征在于包含 至少一个编码如上所述的突变HPPD的核酸序列，其中SEQ ID NO 2所示假单胞菌HPPD的 第336位的突变选自以下突变Gly336His、Gly336Met、Gly336Cys和Gly336Phe,特别是 Gly336His0在另一个具体的实施方式中，本发明涉及一种植物细胞或植物，其特征在于包含 至少一个编码突变HPPD的核酸序列，其中突变的HPPD保留催化对羟基苯基丙酮酸(HPP) 转化为尿黑酸的性质，且对HPPD抑制剂的敏感性低于原始的未突变HPPD，其中所述HPPD酶 来自植物，特别是来自拟南芥，并且在SEQ ID NO :4所示拟南芥HPPD的氨基酸序列第422 位(即SEQ ID NO 2所示假单胞菌HPPD的氨基酸序列的第336位)的甘氨酸上包含一个 选自以下的突变Gly336Arg、Gly336His、Gly336Met、Gly336Phe、Gly336Asn、Gly336Cys、 Gly336Val、Gly336Trp、Gly336Glu 和 Gly336Asp。在一个更具体的实施方式中，本发明涉及一种植物细胞或植物，其特征在于包含 至少一个编码上述突变HPPD的核酸序列，其中SEQ ID NO 2所示假单胞菌HPPD的第336 位的突变选自以下突变Gly336His、Gly336Asn、Gly336Cys和Gly336Val，所述突变HPPD是 植物来源，特别是拟南芥。应注意，SEQ ID NO 2所示假单胞菌HPPD的第336位是SEQ ID NO 4所示拟南芥HPPD的第422位。在一个具体的实施方式中，本发明涉及一种植物细胞或植物，其特征在于包含至 少一个编码上述突变HPPD的核酸序列，其中本发明的突变HPPD对异噁唑类、二酮腈类、三 酮类或吡唑特类的HPPD抑制剂的敏感性低于原始的未突变HPPD。在一个更具体的实施方式中，本发明涉及一种植物细胞或植物，其特征在于包含 至少一个编码上述突变HPPD的核酸序列，其中所述突变HPPD对选自以下的HPPD抑制剂的 敏感性低于原始的未突变HPPD 异噁氟草、特波三酮、甲基磺草酮、磺草酮、吡拉塞佛托、苯 吡唑草酮、2-氰基-3-环丙基-1- (2-S02CH3-4-CF3苯基)-丙烷_1，3- 二酮和2-氰基-3-环 丙基-1-(2-S02CH3-4-2, 3C12 苯基)丙烷-1，3- 二酮。
在另一个具体的实施方式中，本发明涉及一种植物细胞或植物，其特征在于包含 至少一个编码上述突变HPPD的核酸序列，其中所述突变HPPD对选自以下的HPPD抑制剂的 敏感性低于原始的未突变HPPD 三酮类，如特波三酮、磺草酮和甲基磺草酮，特别是特波三 酮，或吡唑特类，如吡拉塞佛托和苯吡唑草酮。在一个具体的实施方式中，本发明涉及一种植物细胞或植物，其特征在于包含至 少一个编码上述突变HPPD的核酸序列，其中所述突变HPPD对选自特波三酮、磺草酮或甲基 磺草酮，特别是特波三酮的三酮HPPD抑制剂的敏感性较低。在另一个具体的实施方式中，本发明涉及一种植物细胞或植物，其特征在于包含 至少一个编码上述突变HPPD的核酸序列，其中除SEQ ID NO 2所示假单胞菌HPPD的第336 位氨基酸甘氨酸上的第一突变外，本发明的突变HPPD还包含第二突变。在一个更具体的实施方式中，本发明涉及一种植物细胞或植物，其特征在于包含 至少一个编码上述突变HPPD的核酸序列，其中所述第二突变氨基酸选自以下氨基酸SEQ ID NO 2 所示假单胞菌 HPPD 序列的 Pro215、Gly298、Gly332、Phe333、Gly334 和 Asn337。本发明还涉及一种植物细胞或植物，其特征在于包含至少一个编码突变HPPD酶 的核酸序列，其中突变的HPPD酶保留催化对羟基苯基丙酮酸(HPP)转化为尿黑酸的性质， 且对选自以下HPPD抑制剂的敏感性低于原始的未突变HPPD 三酮类，如特波三酮、磺草酮 和甲基磺草酮，或吡唑特类，如吡拉塞佛托和苯吡唑草酮，其特征在于SEQ ID N0:2所示假 单胞菌HPPD的第336位氨基酸甘氨酸包含突变。在一个更具体的实施方式中，本发明涉及一种植物细胞或植物，其特征在于包含 至少一个编码突变HPPD酶的核酸序列，其中突变的HPPD酶对三酮类或吡唑特类的HPPD 抑制剂的敏感性低于原始的未突变HPPD，根据选自以下的突变，HPPD在SEQ ID NO :2所 示假单胞菌 HPPD 的第 336 位发生突变:Gly336Arg, Gly336Asp、Gly336Glu、Gly336His、 Gly336Met、Gly336Phe、Gly336Trp、Gly336Asn、Gly336Cys 和 Gly336Val。在另一个具体的实施方式中，本发明涉及一种植物细胞或植物，其特征在于包含 至少一个上述核酸序列，还有在植物中发挥作用的基因，从而允许PDH(预苯酸脱氢酶)酶 过表达。本发明也涉及包含转化细胞的植物，特别是从转化细胞再生的植物。再生可通 过适当的方法获得，例如以上参考文献所述，其中所述方法依赖于物种的性质。可引用 以下专利和专利申请，特别是关于转化植物细胞和植物再生的方法us 4，459，355、US 4，536，475、US 5，464，763、US 5，177，010、US 5，187，073、EP 267，159、EP 604 662、EP 672 752、US 4，945，050、US 5，036，006、US 5，100，792、US 5，371，014、US 5，478，744、US 5, 179, 022,US 5, 565, 346,US 5, 484, 956,US 5, 508, 468,US 5, 538, 877,US 5, 554, 798,US 5, 489, 520,US 5, 510, 318,US 5, 204, 253,US 5, 405, 765,EP 442 174,EP 486 233,EP 486 234、EP 539 563、EP 674 725、WO 91/02071和 WO 95/06128。本发明也涉及转化植物或其部分，其通过栽培和/或杂交以上再生植物得到，还 涉及转化植物的种子。本发明也涉及从本发明的植物、其部分或种子获得的终产物如粗碾谷物或油。根据本发明可获得的转化植物可为单子叶型，如谷物、甘蔗、水稻和玉米，或为双 子叶型，如烟草、大豆、芸苔属植物如油菜、棉花、甜菜根、三叶草等。
本发明涉及转化宿主生物体特别是植物细胞或植物的方法，所述方法将上述至少 一个核酸序列或一个嵌合基因整合入这样的生物体中，其中可通过任何适当的已知手段获 得转化，所述手段在专门的文献中有充足描述，特别是在本发明引用的参考文献中，更具体 地说是采用本发明的载体。一系列方法包括用DNA序列附着的粒子轰击细胞、原生质体或组织。另一系列方 法包括采用插入到根癌农杆菌Ti质粒或毛根农杆菌Ri质粒的嵌合基因作为转移入植物 的手段。可采用其它方法，如微注射或电穿孔或用PEG引导沉淀。技术人员可选择任何适 当的方法转化所选宿主生物体，特别是植物细胞或植物。例如，大豆转化的技术在通过引用 纳入本文的EP1186666的实施例1_3中有广泛描述。对于水稻，可进行农杆菌介导的转化 (Hiei等，1994，和Hiei等，1997，通过引用纳入本文)、电穿孔(美国专利5，641，664和美 国专禾Ij 5，679，558，通过引用纳入本文)或轰击(Christou等，1991，通过引用纳入本文)。 通过引用纳入本文的WO 92/09696中描述了单子叶植物特别是水稻转化的合适技术。对于 棉花，已描述了农杆菌介导的转化(Gould J. H.和Magallanes-Cedeno Μ.，1998和Zapata C.，1999，通过引用纳入本文)、聚凝胺(polybrene)和/或处理介导的转化(Sawahel W. A.， 2001，通过引用纳入本文)。在本发明一个具体的实施方式中，突变的HPPD靶向叶绿体。可通过整合上述编码 转运肽/突变HPPD融合蛋白的核酸序列来进行。或者，可采用转化叶绿体基因组将突变的HPPD直接在叶绿体中表达。一个合适的 方法包括用DNA包被的粒子轰击树叶部分，并通过同源重组整合编码本发明蛋白质的引入 基因。合适的载体和选择系统为本领域技术人员已知。可用于这种整合入烟草品系叶绿体 基因组的手段和方法的一个例子在WO 06/108830中给出，其内容通过引用纳入本文。在采 用叶绿体基因组转化将多肽直接靶向入叶绿体时，通常不需要转运肽序列。本发明也涉及获得耐受HPPD抑制剂的植物的方法，其特征在于所述植物用上述 嵌合基因进行转化。因此，本发明也涉及一种获得耐受HPPD抑制剂的植物的方法，其特征在于所述植 物用在5'且任选地在3'位置包含编码序列以及异源调控元件的嵌合基因进行转化，所 述编码序列以及异源调控元件能够在宿主生物体中发挥作用，其特征在于所述编码序列包 含至少一个如上所述的核酸序列。在本发明一个具体的实施方式中，在该方法中，所述HPPD抑制剂是三酮或吡唑特 除草剂，优选特波三酮、甲基磺草酮或磺草酮，特别是特波三酮。在另一个实施方式中，本发明涉及获得上述耐受HPPD抑制剂的植物的方法，其特 征在于所述植物还同时或相继用在该植物中发挥作用从而允许PDH(预苯酸脱氢酶)酶过 表达的基因进行转化。本发明也涉及借助HPPD抑制剂特别是上述除草剂为植物特别是作物选择性除草 的方法，该方法的特征在于在作物播种前、作物萌发前或作物萌发后施用将该除草剂施用 于根据本发明进行转化的植物。在本发明一个具体的实施方式中，在该方法中，所述HPPD抑制剂是三酮或吡唑特 除草剂，优选特波三酮、甲基磺草酮或磺草酮，特别是特波三酮。本发明也涉及在包含如本专利申请之前所述的转化种子的区域或田地里控制杂草的方法，该方法包括对所述田地区域施用对所述杂草有毒剂量的HPPD抑制剂除草剂，而 不显著影响包含如本专利申请之前所述的核酸序列或嵌合基因的种子或植物。在本发明一个具体的实施方式中，在该方法中，所述HPPD抑制剂是三酮或吡唑特 除草剂，优选特波三酮、甲基磺草酮或磺草酮，特别是特波三酮。本发明也涉及一种栽培用本发明嵌合基因转化的植物的方法，该方法包括将包含 本发明嵌合基因的种子种植在适合栽培所述植物的田地区域里，如果存在杂草，将对杂草 有毒剂量的、以上述HPPD为靶标的除草剂施用于所述田地的所述区域，而不显著影响所述 转化种子或所述转化植物，然后在栽培植物或植物部分达到所需成熟阶段时收获所述栽培 植物或植物部分，适当时从收获的植物中分离种子。在本发明一个具体的实施方式中，在该方法中，所述HPPD抑制剂是三酮或吡唑特 除草剂，优选特波三酮、甲基磺草酮或磺草酮，特别是特波三酮。在以上方法中，可根据本发明，在作物播种前、作物萌发前或作物萌发后施用以所 述HPPD为靶标的除草剂。本发明也涉及一种获得油，特别是大豆油或粗碾谷物的过程，包括在田地里种植 表达本发明突变HPPD的作物，特别是大豆作物，任选用HPPD抑制剂除草剂处理这样的作 物，收获谷物，碾磨谷物以制备粗碾谷物并提取油。包含本发明嵌合基因的整个、破碎或碾 碎的植物种子或谷物也是本发明的一部分。因此，本发明涉及获得油或粗碾谷物的方法，包括种植上述的转化植物，任选地用 HPPD抑制剂除草剂处理这样的植物，收获谷物，碾磨谷物以制备粗碾谷物并提取油。在具体的实施方式中，本发明的以上方法包括选自以下的HPPD抑制剂除草剂 异噁氟草、特波三酮、甲基磺草酮、吡拉塞佛托、磺草酮、苯吡唑草酮、2_氰基-3-环丙 基-l-(2-S02CH3-4-CF3 苯基)_ 丙烷-1,3- 二酮和 2-氰基-3-环丙基-1-(2-S02CH3-4_2， 3C12苯基)丙烷-1，3-二酮。在其它具体的实施方式中，本发明的以上方法包括选自以下的HPPD抑制剂除草 剂三酮类，如特波三酮、磺草酮和甲基磺草酮，或吡唑特类，如吡拉塞佛托和苯吡唑草酮， 特别选自特波三酮、磺草酮和甲基磺草酮，更特别地为特波三酮。在本发明的含义中，“除草剂”应理解为本身具有除草剂活性的物质或与改变其功 效的添加剂如例如增强其活性(增效剂)或限制其活性(安全剂)的试剂结合的物质。当 然应理解，就其在实践中的应用来说，以上除草剂以本身已知的方式与农业化学中惯常使 用的配方佐剂结合。在根据本发明转化的植物包含一个或多个其它对其它除草剂耐受性的基因(如 例如，编码赋予植物对草甘膦除草剂耐受性的突变或未突变EPSPS的基因，或赋予对草丁 膦除草剂耐受性的pat或bar基因)时，或在转化植物对另一个除草剂具有天然敏感性(如 磺酰脲耐受性)时，本发明的方法可包括结合所述除草剂或除草剂的组合，例如草甘膦和/ 或草丁膦和/或磺酰脲除草剂，同时或按顺序交错施用HPPD抑制剂。本发明也涉及基于对上述HPPD抑制剂除草剂的选择，编码本发明突变HPPD的嵌 合基因作为某种植物转化期间标记基因的用途。本发明也涉及获得耐受三酮或吡唑特HPPD抑制剂的植物的方法，其特征在于所 述植物用在植物中表达HPPD的嵌合基因进行转化，所述HPPD在SEQ ID NO :2所示假单胞
16菌HPPD氨基酸序列的第336位的氨基酸甘氨酸发生突变。在一个具体的实施方式中，本发明涉及所述获得耐受三酮或吡唑特HPPD抑制 剂的植物的方法，其特征在于所述HPPD突变选自Gly336Arg、Gly336Asp、Gly336Glu、 Gly336His、Gly336Met、Gly336Phe、Gly336trp、Gly336Asn、Gly336Cys 和 Gly336Val。在另一个具体的实施方式中，本发明涉及所述获得耐受选自特波三酮、甲基磺草 酮和磺草酮的三酮HPPD抑制剂的植物的方法。在另一个具体的实施方式中，本发明涉及所述获得耐受三酮或吡唑特HPPD抑 制剂的植物的方法，其特征在于所述植物还同时或相继用在该植物中发挥作用从而允许 PDH(预苯酸脱氢酶)酶过表达的基因进行转化。本发明也涉及在控制区域或田地中杂草的方法，该方法包括在该区域或田地种植 根据上述方法获得的耐受三酮或吡唑特HPPD抑制剂的转化植物或来源于其的转化种子， 施用对杂草有毒剂量的所述三酮或吡唑特HPPD抑制剂，而不显著影响所述转化种子或所 述转化植物。本发明也涉及获得油或粗碾谷物的方法，包括种植根据上述方法获得的耐受三 酮或吡唑特HPPD抑制剂的转化植物或来源于这样植物的转化种子，任选用三酮或吡唑特 HPPD抑制剂处理这样的植物或种子，收获谷物，碾磨谷物以制备粗碾谷物并提取油。本发明也涉及在SEQ ID NO 2所示假单胞菌HPPD氨基酸序列的第336位的氨基 酸甘氨酸发生突变的HPPD以使植物耐受三酮或吡唑特HPPD抑制剂的用途。本发明也涉及上述突变HPPD的用途，其特征在于所述HPPD突变选自Gly336Arg、 Gly336Asp、Gly336Glu、Gly336His、Gly336Met、Gly336Phe、Gly336trp、Gly336Asn、 Gly336Cys 和 Gly336VaL·本发明也涉及上述突变HPPD的用途，其特征在于所述HPPD抑制剂是选自特波三 酮、甲基磺草酮或磺草酮的三酮HPPD抑制剂。本发明也涉及宿主生物体，特别是植物细胞或植物，其包含含有编码本发明突变 HPPD的序列的嵌合基因，还包含在该宿主生物体中发挥作用从而允许预苯酸脱氢酶(本文 缩写为PDH)过表达的基因。在表述“在植物中发挥作用从而允许PDH酶过表达的基因”中，术语“PDH”应解释 为表现出将预苯酸转化为HPP的PDH活性的任何天然或突变的PDH酶。特别地，所述PDH 酶可来源于任何类型的生物。可通过任何可能测定预苯酸底物量的减少或测定来自酶反应 的产物即HPP或辅因子NADH或NADPH之一的积累的方法鉴定具有PDH活性的酶。具体地 说，可通过实施例4中描述的方法测定PDH活性。文献中描述了很多编码PDH酶的基因，其序列可在网址http://VWW. ncbi. nlm. nih. gov/entrez/进行鉴定。特别熟知的是编码以下的PDH酶的基因如Marmhaupt等 (1989)中所述的酿酒酵母(登录号S46037)、杆状菌属(Bacillus)细菌特别是如Hermer等 (1986)中所述的枯草杆菌(B. subtilis)(登录号P20692)、埃希氏菌属(Escherichia)细 菌特别是如Hudson等(1984)中所述的大肠杆菌(登录号KMECTD)、欧文氏菌属(Erwinia) 的细菌特别是如Xia等(1992)中所述的草生欧文氏菌(E. herbicola)(登录号S29934)。本发明还涉及获得耐受HPPD抑制剂的宿主生物体特别是植物细胞或植物的方 法，通过在这样的生物体中整合入上述至少一个核酸序列或一个嵌合基因，再同时或相继
17用在该宿主生物体中发挥作用从而允许PDH(预苯酸脱氢酶)酶过表达的基因对其进行转 化。在一个具体的实施方式中，本发明涉及获得宿主生物体特别是植物细胞或植物的 方法，其对三酮或吡唑特HPPD抑制剂，特别是特波三酮、甲基磺草酮或磺草酮具有耐受性。可用于获得用允许HPPD酶过表达的基因和允许PDH酶过表达的基因二者转化的 宿主生物体特别是植物细胞或植物的手段和方法在W004/024928中有广泛描述，其内容通 过引用纳入本文。本说明书中引用的任何在前出版物(或来源于其的信息)或任何已知事项不是也 不应看作承认、认可或是任何形式的暗示该在前出版物(或信息)或已知事项形成本发明 领域公知常识的一部分。附1 阿维链霉菌、胡萝卜、拟南芥、玉米、大麦、小麦叶枯病菌、粗球孢子菌、小鼠 和荧光假单胞菌的HPPD序列比对。氨基酸根据假单胞菌序列编号，星号表示这些序列共有
的氨基酉2。
序列表
SEQIDNO1 编码荧光假单胞菌HPPD的核酸序列
SEQIDNO2 荧光假单胞菌HPPD的氨基酸序列
SEQIDNO3 编码拟南芥HPPD的核酸序列
SEQIDNO4 拟南芥HPPD的氨基酸序列
SEQIDNO5 编码小鼠HPPD的核酸序列
SEQIDNO6 小鼠HPPD的氨基酸序列
SEQIDNO7 编码粗球孢子菌HPPD的核酸序列
SEQIDNO8 粗球孢子菌HPPD的氨基酸序列
SEQIDNO9 编码小麦叶枯病菌HPPD的核酸序列
SEQIDNO10小麦叶枯病菌HPPD的氨基酸序列
SEQIDNO11编码大麦HPPD的核酸序列
SEQIDNO12大麦HPPD的氨基酸序列
SEQIDNO13编码玉米HPPD的核酸序列
SEQIDNO14玉米HPPD的氨基酸序列
SEQIDNO15编码胡萝卜HPPD的核酸序列
SEQIDNO16胡萝卜HPPD的氨基酸序列
SEQIDNO17编码阿维链霉菌HPPD的核酸序列
SEQIDNO18阿维链霉菌HPPD的氨基酸序列
SEQIDNO19引物序列kerfiOOl
SEQIDNO20引物序列kerfi002
SEQIDNO21引物序列kerfi003
SEQIDNO22引物序列kerfi004
SEQIDNO23引物序列kerfi007
SEQIDNO24 引物序列kerfi008
SEQIDNO25引物序列kerf iO 11
SEQIDNO26引物序列kerfi012
SEQIDNO27引物序列kerf iO 14
SEQIDNO28引物序列kerf iO 16
SEQIDNO29引物序列kerf iO 19
SEQIDNO30引物序列kerfi020
SEQIDNO31引物序列kerfi015
SEQIDNO32引物序列kerf iO 18
实施例在以下实施例的辅助下将会更好的理解本发明的各方面。以下在这些实施例中描 述的所有方法和操作通过举例的方式给出，对应于从可达到相同或相似结果的不同方法中 作出的选择。该选择对结果的质量没有影响，因此技术人员可使用任何合适的方法以达到 相同或相似的结果。DNA片段操作的大多数方法在《现代分子生物学实验技术》(“Current Protocols inMolecular Biology “)，第 1 卷和第 2 卷，Ausubel F. M.等，格林出版公 司(GreenePublishing Associates)禾口 WI 公司(Wiley Interscience) (1989)、《分子克 隆〉〉(Molecular cloning), Τ. Maniatis, Ε. F. Fritsch, J. Sambrook, 1982 或 SambrookJ.禾口 Russell D.，2001，《分子克隆实验手册》(Molecular Cloning :a laboratorymanual)(第 三版)中有描述。实施例1 突变HPPD的制备概述首先将拟南芥AtHPPD编码序列(1335bp)(Genebank AF047834 ；W096/38567)克隆 入表达载体pQE-30 (QIAGEN)的限制性位点BamHI和HindIII之间。首先将荧光假单胞菌PfHPPD 编码序列(1174bp) (Ruetschi 等，Eur. J. Biochem.， 205,459-466,1992，WO 96/38567)克隆入提供起始密码子的表达载体pKK233_2 (法玛西亚 公司)独特的NcoI位点。载体pQE-30-AtHPPD和pKK233-2_PfHPPD用于PCR介导的NcoI限制性位点和编 码N末端His6-标签的序列连接于AtHPPD和PfHPPD的5，端，以及XbaI限制性位点连接 于 AtHPPD 禾口 PfHPPD 的 3’ 段。从琼脂糖凝胶中分离AtHPPD基因的PCR产物，用限制酶NcoI和XbaI切割， 用MinElute PCR纯化试剂盒(恰根公司(Qiagen))纯化，克隆入用相同限制酶切割的 pSE420(RI)NX 载体。对于PfHPPD基因，从琼脂糖凝胶中分离PCR产物，克隆入pCR 2. 1- TOPO 载 体。用限制酶NcoI和XbaI将其从该载体上切离，从琼脂糖凝胶中分离，并克隆入用相同限 制酶切割的pSE420(RI)NX载体。然后对pSE420 (RI)NX-AtHPPD和-PfHPPD 二者进行PCR介导的定点突变，以在两 个基因的相应位点改变指定的密码子。所述密码子分别在WTPfHPPD中编码Gly336和在WT AtHPPD 中编码 Gly422。采用焦磷酸测序(Pyrosequencing )技术分析编码序列中的突变密码子。
PCR介导的编码N末端His6-标签的序列与NcoI和XbaI限制性位点的连接在96孔PCR板的24孔上分别进行各基因(AtHPPD和PfHPPD)的PCR反应。由 于该反应的正向和反向引物在大小上有18 (AtHPPD)和22bp (PfHPPD)的差异，因此实施 40. 90C -64. 5°C的退火温度梯度，各孔置于该范围内的另一个退火温度下。在引物与单链 模板进行第一次退火时，在新链中产生了 5'突出端，直到合成出其互补链，由第一引物的 5'区域形成的该突出端成为模板的一部分。由此编码序列在两端延伸，在两端引入编码N 末端His6-标签的序列和限制性位点。该反应混合物包含500ng pQE-30-AtHPPD (IyL来自质粒大量抽提)或Iyg pKK233-2-PfHPPD DNA (0. 75 μ L 来自质粒大量抽提)、用于 AtHPPD 的 kerf iOOl 和 kerf i002 分别1 μ 1、或用于PfHPPD的kerf i003和kerf i004分别1 μ 1 (所有引物溶液均具有 IOpmol* μ Γ1的浓度)、25 μ 1 HotStarTaq Master Mix (恰根公司)和分子生物学级超纯 水(HyPure Molecular Biology Grade Water)至终体积 50 μ L。PCR 程序设置如下1.95°C15 分钟2. 94"C 30 #40. 9°C-60. 4°C 30 秒72°C3 分钟步骤2重复20次。3. 72 °C 10 分钟
权利要求
1.突变的羟基苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)，其保留催化对羟基苯基丙酮酸(HPP)转化 为尿黑酸的性质，且对HPPD抑制剂的敏感性低于原始的未突变HPPD，其特征在于其在SEQ ID NO 2所示假单胞菌HPPD的氨基酸序列第336位的氨基酸甘氨酸上包含选自下组的突 变Gly336His、Gly336Met、Gly336Phe 和 Gly336Cys。
2.如权利要求1所述的突变HPPD，其特征在于，所述突变HPPD包含第二突变。
3.如权利要求2所述的突变HPPD，其特征在于，所述第二突变氨基酸选自以下氨基酸 SEQ ID NO :2所示假单胞菌HPPD序列的Pro215、Gly298、Gly332、Phe333、Gly334和Asn337。
4.编码如权利要求1-3中任一项所述的突变HPPD的核酸序列。
5.在5’和任选在3’位置包含编码序列以及异源调控元件的嵌合基因，其能在宿主生 物体中发挥作用，其特征在于所述编码序列包含至少一个如权利要求4所述的核酸序列。
6.如权利要求5所述的嵌合基因，其特征在于，其在编码突变HPPD的核酸序列的5’位 置包含编码植物转运肽的核酸序列，其中该序列位于启动子区域和编码突变HPPD的序列 之间，从而允许转运肽/突变HPPD融合蛋白的表达。
7.转运肽/突变HPPD融合蛋白，其中所述突变HPPD如权利要求1_3中任一项定义。
8.用于转化宿主生物体的克隆和/或表达载体，其特征在于其包含至少一个如权利要 求5-6中任一项所述的嵌合基因。
9.植物细胞，其特征在于其包含至少一个如权利要求4所述的核酸序列或如权利要求 5-6中任一项所述的嵌合基因。
10.如权利要求9所述的植物细胞，其特征在于，其还包含在植物中发挥作用从而允许 PDH(预苯酸脱氢酶)酶过表达的基因。
11.转化植物，其特征在于其包含如权利要求9或10所述的转化植物细胞。
12.转化种子，其特征在于其包含权利要求9或10所述的转化植物细胞，且其来源于如 权利要求11所述的转化植物。
13.获得耐受HPPD抑制剂的植物的方法，其特征在于用如权利要求5-6中任一项所述 的嵌合基因转化所述植物。
14.如权利要求13所述的获得耐受HPPD抑制剂的植物的方法，其特征在于，用在该植 物中发挥作用从而允许PDH(预苯酸脱氢酶)酶过表达的第二基因同时或相继进一步转化 所述植物。
15.在包含如权利要求12所述转化种子或如权利要求11所述植物的区域或田地中控 制杂草的方法，该方法包括对所述区域或田地施用对所述杂草有毒剂量的HPPD抑制剂除 草剂，而不显著影响包含如权利要求4所述核酸序列或权利要求5-6中任一项所述嵌合基 因的种子或植物。
16.获得油或粗碾谷物的方法，包括种植如权利要求11所述的转化植物，任选用HPPD 抑制剂除草剂处理该植物，收获谷物，碾磨谷物以制备粗碾谷物并任选提取油。
17.如权利要求13-16中任一项所述的方法，其中HPPD抑制剂是三酮HPPD抑制剂。
18.如权利要求17所述的方法，其中HPPD抑制剂选自特波三酮、甲基磺草酮和磺草 酮，特别是特波三酮。
19.在SEQID NO :2所示假单胞菌HPPD的氨基酸序列第336位的氨基酸甘氨酸上发生 突变的HPPD在赋予植物耐受三酮HPPD抑制剂中的应用，其特征在于所述HPPD突变选自Gly336His、Gly336Met、Gly336Phe 和 Gly336Cys。
20.如权利要求19所述突变HPPD的应用，其特征在于，所述HPPD抑制剂选自特波三酮、甲基磺草酮和磺草酮。
全文摘要
本发明涉及编码突变的羟基苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)的核酸序列、包含该序列作为编码序列的嵌合基因以及其在获得耐受HPPD抑制剂除草剂的植物中的应用。
文档编号C12N5/10GK101998993SQ200980113723
公开日2011年3月30日 申请日期2009年4月10日 优先权日2008年4月14日
发明者A·萨利安德, B·兰伯, K·菲希尔, M·布什 申请人:拜耳生物科学股份有限公司;拜尔农科股份公司