新的突变羟基苯基丙酮酸双加氧酶，dna序列和耐受hppd抑制剂除草剂的植物分离的制作方法
【专利说明】新的突变超基苯基丙鋼酸双加氧酶，DNA序列和耐受HPPD抑制剂除草剂的植物分离
[0001] 本申请为分案申请，其原申请的申请日为2009年4月10日，申请号 为200980113723.X，名称为"新的突变径基苯基丙酬酸双加氧酶，DNA序列和耐受 HPPD抑制剂除草剂的植物分离"。本发明设及编码突变的径基苯基丙酬酸双加氧酶 (hy化〇巧地enylpyruvatedio巧genase) (HPPD)的核酸序列、包含该序列作为编码序列的 嵌合基因W及其在获得耐受HPPD抑制剂除草剂的植物中的用途。
[0002] 径基苯基丙酬酸双加氧酶（HPPD;EC1. 13. 11. 27)是一种酶，其催化酪氨酸降解 产物-对径基苯基丙酬酸（HP巧转化为植物中生育酪和质体酿的前体-尿黑酸（HG)的反 应（化ouchN.P等，1997 ;化itze等，2004)。生育酪起到膜相关抗氧化剂的作用。质体酿 首先是PSII和细胞色素b6/f复合物之间的电子载体，然后是参与类胡萝h素生物合成的 八氨番茄红素去饱和酶的氧化还原辅因子。
[0003] 大多数植物通过预苯氨酸（arrogenate)合成酪氨酸（Abou-Zeid等1995;Bonner 等，1995;Byng等，1981;Connely和Conn1986;Gaines等，1982)。在运些植物中，HPP仅 来自于酪氨酸降解。另一方面，在如酵母酿酒酵母（Sacharomycescerevisiae)或细菌大 肠杆菌巧scherichiacoli)等生物体中，HPP是酪氨酸前体，由预苯酸脱氨酶（此后称为 PDH)的作用合成，该酶将预苯酸转化为HPP(Lingens等，1967 ;Sampathkuma;r和Morrisson 1982)。因此在运些生物体中，HPP的产生直接与芳香族氨基酸的生物合成途径（莽草酸途 径）而非酪氨酸降解途径相关。
[0004] 抑制HPPD导致光合作用的解偶联、辅助捕光色素缺乏，最重要的是，由于缺乏通 常由类胡萝l·素提供的光保护作用，紫外线福射和活性氧中间体导致叶绿素破坏（Norris 等1995)。对光合作用活性组织进行光漂白会导致生长抑制和植物死亡。
[0005] -些抑制HPPD和与所述酶特异性结合W抑制HPP转化为尿黑酸的分子已证实是 非常有效的选择性除草剂。
[0006] 市场上最易买到的HPPD抑制剂除草剂属于W下四个化学家族之一：
[0007] 1)S酬类，例如，横草酬（sulcotrione)(即2-[2-氯-4-(甲横酷基）苯 甲酯基]-1，3-环己二酬）、甲基横草酬（mesotrione)(即2- [4-(甲横酷基）-2-硝 基苯甲酯基]-1，3-环己二酬）、特波Ξ酬（tembotrione)(即2-[2-氯-4-(甲横酷 基）-3-[(2,2,2-Ξ-氣乙氧基）甲基]苯甲酯基]-1,3-环己二酬）；
[000引 2)二酬腊（diketonitrile)类，例如，2-氯基-3-环丙基-1-(2-甲横酷基-4-Ξ 氣甲基苯基）-丙烷-1,3-二酬和2-氯基-1-[4-(甲横酷基）-2-Ξ氣甲基苯基]-3-(1-甲 基环丙基）丙烷-1,3-二酬；
[000引如异嗯挫类，例如，异嗯氣草（isoxaflutole)(即5-环丙基-4-异嗯挫基[2-(甲 横酷基）-4-(Ξ氣甲基）苯基]甲酬）。在植物中，异嗯氣草在DKN中快速代谢，后者是一 种表现出HPPD抑制剂性质的二酬腊化合物；W及
[0010] 4)R比挫特（pyrazolinate)类，例如，苯R比挫草酬（topramezone)(即[3-(4, 5-二 氨-3-异嗯挫基）-2-甲基-4-(甲横酷基）苯基](5-径基-1-甲基-1H-化挫-4-基）甲 酬）和R比拉塞佛托（pyrasulfotole)巧-径基-1, 3-二甲基R比挫-4-基（2-甲横酷-4-Ξ氣甲基苯基）甲酬）。
[0011] 运些HPPD抑制除草剂可用于表现出代谢耐受性的作物如玉米狂eamays)中的 草和/或阔叶杂草，运些除草剂在其中可快速降解（Schulz等，1993 ;Mitchell等，2001; Garcia等，2000 ;Pallett等，2001)。为了拓展运些HPPD抑制除草剂的范围，已作出努力 W赋予植物，尤其是不具有或具有未充分发挥的代谢耐受性的植物对它们的农业水平耐受 性。
[0012] 除试图绕过HPPD介导的尿黑酸产生扣S6, 812, 010)夕F，已进行了该敏感酶的过 表达W在植物中产生大量对除草剂充足的祀酶（W096/38567)。HPPD的过表达引起了对异 嗯氣草（IFT)的二酬腊衍生物她脚更好的萌发前耐受性，但该耐受性不足W作为萌发后 处理的耐受性（Matringe等，2005)。
[0013] 另一种策略是对HPPD进行突变W获得相对突变前的天然HPPD对HPPD抑制剂敏 感性较低的祀酶，而同时保留其催化HPPD转化为尿黑酸的性质。
[0014] 该策略已成功应用于生产耐受两种属于二酬腊家族的HPPD抑制除草剂（W0 99/24585) 2-氯基-3-环丙基-1- (2-甲横酷基-4- Ξ氣甲苯基）-丙烷-1，3-二酬和 2-氯基-1-[4-甲横酷基-2-Ξ氣甲苯基]-3-(1-甲基环丙基）丙烷-1,3-二酬的植物 (EP496630)。鉴定Pro215Leu、Gly336Glu、Gly336Il、特别是Gly336T巧（突变氨基酸的位 置根据SEQ ID N0:2的假单胞菌（Pseudomonas)HPPD标出）是引起对二酬腊除草剂萌发前 处理耐受性增强但并不造成酶活性改变的突变。
[0015] 最近，已证实将假单胞菌HPPD基因导入烟草和大豆的质体基因组远比核转化有 效，赋予对异嗯氣草的萌发后使用相同的耐受性值ufourmantel等，2007)。
[0016] 在W0 04/024928中，发明人设法通过增强HPP前体进入植物细胞的流量来增强植 物细胞中异戊締苯酿的生物合成（例如，质体酿和生育酪的合成）。运通过过表达PDH酶将 所述前体的合成与"莽草酸"途径进行连接而完成。他们还注意到，用编码PDH酶的基因转 化植物有可能增强所述植物对HPPD抑制剂的耐受性。
[0017] 尽管对二酬腊除草剂表现出耐受性的植物的开发已经获得了运些成功，仍然有必 要开发和/或改进对HPPD抑制剂的耐受性系统，特别是对属于Ξ酬类（例如，横草酬、甲基 横草酬和特波Ξ酬）和化挫特类（例如，苯化挫草酬和化拉塞佛托）的HPPD抑制剂。
[0018] 因此，本发明设及新的突变HPPD酶，其保留催化对径基苯基丙酬酸（HP巧转化为 尿黑酸的性质，且对HPPD抑制剂的敏感性低于原始的未突变HPPD，其特征在于它们在SEQ IDNO:2所示假单胞菌HPPD的第336位（天然HPPD中为氨基酸甘氨酸）包含一个选自 W下突变的突变：Gly336Arg、Gly336His、Gly336Met、Gly336I%e、Gly336Asn、Gly336切S、 Gly336Val、Gly336Trp、Gly336Glu和Gly336Asp。
[0019] 在一个具体的实施方式中，SEQ ID NO:2所示假单胞菌HPPD在第336位的突变 选自W下突变：Gly336Arg、Gly336His、Gly336Met、Gly336I%e、Gly336Asn、Gly336切S和 Gly336Val，条件是突变的HPPD不是双重突变体Gly334Ala-Gly336Arg(位置根据沈Q ID NO:2所示假单胞菌HPPD给出）。
[0020] 在一个更具体的实施方式中，SEQIDNO: 2所示假单胞菌HPPD在第336位的突变 选自W下突变：Gly33細is、Gly336Met、Gly336切S和Gly336I%e。
[0021] 在另一个具体的实施方式中，HPPD酶来自植物，特别是来自拟南芥（Ar油idopsis 地曰11曰11曰)，569 10^:4所示拟南芥册口0的氨基酸序列在第422位（即569 10^:2的假 单胞菌HPPD的第336位）的甘氨酸包含一个选自W下突变的突变：Gly336Arg、Gly336化S、 Gly336Met、Gly336I%e、Gly336Asn、Gly336切S、Gly336Val、GlySSeiYp、Gly336Glu和 Gly336Asp〇
[0022] 在一个更具体的实施方式中，SEQ ID NO:4所示拟南芥HPPD在第422位（即SEQ ID N0:2的假单胞菌HPPD的第336位）的突变选自W下突变：Gly336His、Gly336Asn、 Gly336切S和Gly336Val，且突变的HPPD来自植物，特别是来自拟南芥。应注意，SEQ ID NO :2所示假单胞菌HPPD的第336位是SEQ ID NO :4所示拟南芥HPPD的第422位。
[0023] 在一个具体的实施方式中，本发明的突变HPPD对异嗯挫类、二酬腊类、Ξ酬类、化 挫特类的HPPD抑制剂除草剂的敏感性低于原始的未突变HPPD。
[0024] 在一个具体的实施方式中，本发明的突变HPPD对选自W下的HPPD抑制剂除草 剂的敏感性低于原始的未突变HPPD:异嗯氣草、特波Ξ酬、甲基横草酬、横草酬、化拉塞佛 托、苯化挫草酬、2-氯基-3-环丙基-1-(2-SO2CH3-4-CF3苯基）-丙烷-1，3-二酬和2-氯 基-3-环丙基-1-(2-SO2CH3-4-2,3CI2苯基）丙烷-1, 3- 一酬。
[0025] 在另一个具体的实施方式中，本发明的突变HPPD对W下HPPD抑制剂的敏感性低 于原始的未突变HPPD 酬类（称为Ξ酬HPPD抑制剂），如特波Ξ酬、横草酬和甲基横草 酬，特别是特波Ξ酬，或化挫特类（称为化挫特HPPD抑制剂），如化拉塞佛托和苯化挫草酬。
[0026] 在一个更具体的实施方式中，本发明的突变HPPD对选自特波Ξ酬、横草酬和甲基 横草酬，特别是特波Ξ酬的Ξ酬HPPD抑制剂的敏感性低于原始的未突变HPPD。
[0027] 在另一个具体的实施方式中，除SEQ ID NO: 2所示假单胞菌HPPD的第336位的氨 基酸甘氨酸上的第一突变外，本发明的突变HPPD还包含第二突变。
[0028] 在一个更具体的实施方式中，第二突变氨基酸选自W下SEQ ID NO:2所示假单胞 菌HPPD序列的氨基酸：Pro215、Gly298、Gly332、化6333、Gly334和Asn337。
[0029] 本发明还提供突变的HPPD酶，其保留催化对径基苯基丙酬酸（HP巧转化为尿黑 酸的性质，且对W下HPPD抑制剂的敏感性低于原始的未突变HPPD 酬类，如特波Ξ酬、 横草酬和甲基横草酬，或化挫特类，如化拉塞佛托和苯化挫草酬，其特征在于它们在SEQID NO: 2所示假单胞菌HPPD第336位的氨基酸甘氨酸包含突变，W及提供使用运样的酶使植物 对运些HPPD抑制剂具有耐受性，即，将Ξ酬类或化挫特类除草剂施用于表达运样突变体酶 的植物的，而植物通过在其基因组中包含编码在SEQIDNO:2所示假单胞菌HPPD的第336 位突变的某些HPPD酶的基因而对运样的Ξ酬类或化挫特类HPPD抑制剂具有耐受性的过 程。
[0030] 在本发明一个具体的实施方式中，突变的HPPD酶对Ξ酬类如特波Ξ酬、横草酬和 甲基横草酬的HPPD抑制剂的敏感性低于原始的未突变HPPD，突变根据选自W下突变的突 变，发生在SEQIDN0:2所示假单胞菌HPPD的第336位：Gly336Arg、Gly336Asp、Gly336Glu、 Gly336His、Gly336Met、Gly336I%e、Gly336Trp、Gly336Asn、Gly336Cys和Gly336Val。
[0031] 在本发明一个具体的实施方式中，突变的HPPD酶对Ξ酬类如特波Ξ酬、横草酬和 甲基横草酬的HPPD抑制剂的敏感性低于原始的未突变HPPD，突变根据选自W下突变的突 变，发生在SEQID^:2所示假单胞菌册?0的第336位：61733細13、61733616*、617336口}16 和Gly336切s。
[0032] 现有技术已对若干HPPD及其初级序列进行了描述，特别是W下HPPD:如假单胞 菌等细菌（Riletschi等，Eur.J.Biochem.，205, 459-466, 1992,W0 96/38567)、如拟南芥 (W0 96/38567,GenebankAF0478：M)、胡萝h(W0 96/38567,Genebank87257)、燕麦（Avena sativa)(WO02/046387)、小麦（WO02/046387)、臂形草度rachiariaplatyphylla) (WO02/046387)、裝襲草（Cenc虹usechinaUis)(WO02/046387)、刚性黑麦草化olium rigidum)(WO02/046387)、韦状羊茅（FesUicaarundinacea)(WO02/046387)、大狗尾草 (Setariaf油eri)(WO02/046387)、牛筋草巧leusineindica)(WO02/046387)和高梁（WO 02/046387)等植物、球抱子菌（Coccicoides)(GenebankCCHTRP)或如小鼠或猪等哺乳动 物的。显示的参考文献中公开的相应序列通过引用纳入本文。
[0033] 通过比对运些已知序列，采用本领域的惯例手段，例如，Thompson,J.化等描述的 方法（CLUSTALW:"通过序列加权、位点特异性空位罚分和加权矩阵选择来提高渐进的多 序歹LItk对白勺敏感t生，，（improvingthesensitivityofprogressivemultiplesequence alignmentthroughsequenceweighting,positions-specificgappenaltiesand wei曲tmatrixchoice.)NucleicAcidsResearch, 22 ;4673-4680, 1994)，进入运些通过互 联网可获得的序列比对的计算机程序，技术人员能够确定与参比序列的序列同源性并找到 关键氨基酸或确定共有区域。
[0034] W本发明为例，参比序列是假单胞菌序列，除非特别说明，对具体氨基酸位置的定 义和说明所有均根据SEQIDNO:2所示初级假单胞菌HPPD序列作出。附图1显示现有技 术中描述的若干HPPD序列的比对；运些序列的比对W假单胞菌HPPD序列作为参比序列， 包括W下HPPD序列：阿维链霉菌（Str巧tomycesavermitilisHGenebankSAV11864)、胡 萝h值aucuscarota)(GenebankDCU87257)、拟南芥（GenebankAF0478：M)、玉米、大麦 化ordeumvulgare)(GenebankHVAJ693)、小麦叶枯病菌（Mycosphaerellagraminicola) (GenebankAF038152)、粗球抱子菌（Coccicoidesimmitis)(GenebankCCHTRP)和小鼠 (Musmus州lus)(GenebankΜ呪4皿）。该图提供假单胞菌序列的氨基酸编号，还有运些序列 共有的氨基酸，其中运些氨基酸由星号表示。根据运样的比化从假单胞菌氨基酸的位置和 性质的定义不难鉴定另一个HPPD序列中的相应氨基酸的位置。图1显示可通过比对不同 植物、哺乳动物和细菌来源的序列做到运点，表明技术人员熟知的该比对方法通用于任何 其它序列。专利申请W0 97/49816中也描述了不同HPPD序列的比对。
[0035] 在W099/24585中，对假单胞菌HPPD单体Ξ级结构的分析显示HPPD的C末端部分 存在，其是酶的