特征在于在作物播种前、作物萌发前或作物萌发后施用将该除草剂施用 于根据本发明进行转化的植物。
[0113] 在本发明一个具体的实施方式中，在该方法中，所述HPPD抑制剂是Ξ酬或化挫特 除草剂，优选特波Ξ酬、甲基横草酬或横草酬，特别是特波Ξ酬。
[0114] 本发明也设及在包含如本专利申请之前所述的转化种子的区域或田地里控制杂 草的方法，该方法包括对所述田地区域施用对所述杂草有毒剂量的HPPD抑制剂除草剂，而 不显著影响包含如本专利申请之前所述的核酸序列或嵌合基因的种子或植物。
[0115] 在本发明一个具体的实施方式中，在该方法中，所述HPPD抑制剂是Ξ酬或化挫特 除草剂，优选特波Ξ酬、甲基横草酬或横草酬，特别是特波Ξ酬。
[0116] 本发明也设及一种栽培用本发明嵌合基因转化的植物的方法，该方法包括将包含 本发明嵌合基因的种子种植在适合栽培所述植物的田地区域里，如果存在杂草，将对杂草 有毒剂量的、W上述HPPD为祀标的除草剂施用于所述田地的所述区域，而不显著影响所述 转化种子或所述转化植物，然后在栽培植物或植物部分达到所需成熟阶段时收获所述栽培 植物或植物部分，适当时从收获的植物中分离种子。
[0117] 在本发明一个具体的实施方式中，在该方法中，所述HPPD抑制剂是Ξ酬或化挫特 除草剂，优选特波Ξ酬、甲基横草酬或横草酬，特别是特波Ξ酬。
[0118] 在W上方法中，可根据本发明，在作物播种前、作物萌发前或作物萌发后施用W所 述HPPD为祀标的除草剂。
[0119] 本发明也设及一种获得油，特别是大豆油或粗娠谷物的过程，包括在田地里种植 表达本发明突变HPPD的作物，特别是大豆作物，任选用HPPD抑制剂除草剂处理运样的作 物，收获谷物，娠磨谷物W制备粗娠谷物并提取油。包含本发明嵌合基因的整个、破碎或娠 碎的植物种子或谷物也是本发明的一部分。
[0120] 因此，本发明设及获得油或粗娠谷物的方法，包括种植上述的转化植物，任选地用 HPPD抑制剂除草剂处理运样的植物，收获谷物，娠磨谷物W制备粗娠谷物并提取油。
[0121] 在具体的实施方式中，本发明的W上方法包括选自W下的HPPD抑制剂除草剂： 异嗯氣草、特波Ξ酬、甲基横草酬、化拉塞佛托、横草酬、苯化挫草酬、2-氯基-3-环丙 基-1- (2-SO2CH3-4-CF3苯基）-丙烷-1, 3-二酬和 2-氛基-3-环丙基-1- (2-SO2CH3-4-2,3CI2 苯基）丙烷-1, 3-二酬。
[0122] 在其它具体的实施方式中，本发明的W上方法包括选自W下的HPPD抑制剂除草 剂：Ξ酬类，如特波Ξ酬、横草酬和甲基横草酬，或化挫特类，如化拉塞佛托和苯化挫草酬， 特别选自特波Ξ酬、横草酬和甲基横草酬，更特别地为特波Ξ酬。
[0123]在本发明的含义中，"除草剂"应理解为本身具有除草剂活性的物质或与改变其功 效的添加剂如例如增强其活性（增效剂）或限制其活性（安全剂）的试剂结合的物质。当 然应理解，就其在实践中的应用来说，W上除草剂W本身已知的方式与农业化学中惯常使 用的配方佐剂结合。
[0124] 在根据本发明转化的植物包含一个或多个其它对其它除草剂耐受性的基因（如 例如，编码赋予植物对草甘麟除草剂耐受性的突变或未突变EPSPS的基因，或赋予对草下 麟除草剂耐受性的pat或bar基因）时，或在转化植物对另一个除草剂具有天然敏感性（如 横酷脈耐受性）时，本发明的方法可包括结合所述除草剂或除草剂的组合，例如草甘麟和/ 或草下麟和/或横酷脈除草剂，同时或按顺序交错施用HPPD抑制剂。
[01巧]本发明也设及基于对上述HPPD抑制剂除草剂的选择，编码本发明突变HPPD的嵌 合基因作为某种植物转化期间标记基因的用途。
[0126] 本发明也设及获得耐受Ξ酬或化挫特HPPD抑制剂的植物的方法，其特征在于所 述植物用在植物中表达HPPD的嵌合基因进行转化，所述HPPD在SEQIDNO: 2所示假单胞 菌HPPD氨基酸序列的第336位的氨基酸甘氨酸发生突变。
[0127] 在一个具体的实施方式中，本发明设及所述获得耐受Ξ酬或化挫特HPPD抑制 剂的植物的方法，其特征在于所述HPPD突变选自Gly336Arg、Gly336Asp、Gly336Glu、 Gly336His、Gly336Met、Gly336I%e、Gly336trp、Gly336Asn、Gly336Cys和Gly336Val。
[0128]在另一个具体的实施方式中，本发明设及所述获得耐受选自特波Ξ酬、甲基横草 酬和横草酬的Ξ酬HPPD抑制剂的植物的方法。
[0129] 在另一个具体的实施方式中，本发明设及所述获得耐受Ξ酬或化挫特HPPD抑 制剂的植物的方法，其特征在于所述植物还同时或相继用在该植物中发挥作用从而允许 PDH(预苯酸脱氨酶）酶过表达的基因进行转化。
[0130] 本发明也设及在控制区域或田地中杂草的方法，该方法包括在该区域或田地种植 根据上述方法获得的耐受Ξ酬或化挫特HPPD抑制剂的转化植物或来源于其的转化种子， 施用对杂草有毒剂量的所述Ξ酬或化挫特HPPD抑制剂，而不显著影响所述转化种子或所 述转化植物。
[0131] 本发明也设及获得油或粗娠谷物的方法，包括种植根据上述方法获得的耐受Ξ 酬或化挫特HPPD抑制剂的转化植物或来源于运样植物的转化种子，任选用Ξ酬或化挫特 HPPD抑制剂处理运样的植物或种子，收获谷物，娠磨谷物W制备粗娠谷物并提取油。
[0132] 本发明也设及在SEQIDNO: 2所示假单胞菌HPPD氨基酸序列的第336位的氨基 酸甘氨酸发生突变的HPPDW使植物耐受Ξ酬或化挫特HPPD抑制剂的用途。
[0133] 本发明也设及上述突变HPPD的用途，其特征在于所述HPPD突变选自：Gly336Arg、 Gly336Asp、Gly336Glu、Gly336His、Gly336Met、Gly336Phe、Gly336trp、Gly336Asn、 Gly336Cys和Gly336Val。
[0134] 本发明也设及上述突变HPPD的用途，其特征在于所述HPPD抑制剂是选自特波Ξ 酬、甲基横草酬或横草酬的Ξ酬HPPD抑制剂。
[0135] 本发明也设及宿主生物体，特别是植物细胞或植物，其包含含有编码本发明突变 HPPD的序列的嵌合基因，还包含在该宿主生物体中发挥作用从而允许预苯酸脱氨酶（本文 缩写为PDH)过表达的基因。
[0136] 在表述"在植物中发挥作用从而允许PDH酶过表达的基因"中，术语"PDH"应解释 为表现出将预苯酸转化为HPP的PDH活性的任何天然或突变的PDH酶。特别地，所述P畑 酶可来源于任何类型的生物。可通过任何可能测定预苯酸底物量的减少或测定来自酶反应 的产物即HPP或辅因子NADH或NADPH之一的积累的方法鉴定具有PDH活性的酶。具体地 说，可通过实施例4中描述的方法测定PDH活性。
[0137] 文献中描述了很多编码PDH酶的基因，其序列可在网址http: //www.ncbi.nlm. nih.gov/entrez/讲行黎定。特别熟知的是编码W下的PDH酶的基因：如Mannhaupt等 (1989)中所述的酿酒酵母（登录号S46037)、杆状菌属度acillus)细菌特别是如化nner等 (1986)中所述的枯草杆菌度.subtilis)(登录号P20692)、埃希氏菌属巧scherichia)细 菌特别是如化dson等（1984)中所述的大肠杆菌（登录号KMECTD)、欧文氏菌属巧rwinia) 的细菌特别是如Xia等（1992)中所述的草生欧文氏菌巧.herbicola)(登录号S29934)。
[0138] 本发明还设及获得耐受HPPD抑制剂的宿主生物体特别是植物细胞或植物的方 法，通过在运样的生物体中整合入上述至少一个核酸序列或一个嵌合基因，再同时或相继 用在该宿主生物体中发挥作用从而允许PDH(预苯酸脱氨酶）酶过表达的基因对其进行转 化。
[0139] 在一个具体的实施方式中，本发明设及获得宿主生物体特别是植物细胞或植物的 方法，其对Ξ酬或化挫特HPPD抑制剂，特别是特波Ξ酬、甲基横草酬或横草酬具有耐受性。
[0140] 可用于获得用允许HPTO酶过表达的基因和允许PDH酶过表达的基因二者转化的 宿主生物体特别是植物细胞或植物的手段和方法在W0 04/024928中有广泛描述，其内容 通过引用纳入本文。
[0141] 本说明书中引用的任何在前出版物（或来源于其的信息）或任何已知事项不是也 不应看作承认、认可或是任何形式的暗示该在前出版物（或信息）或已知事项形成本发明 领域公知常识的一部分。
[0142] 附图
[0143] 图1 :阿维链霉菌、胡萝K拟南芥、玉米、大麦、小麦叶枯病菌、粗球抱子菌、小鼠 和巧光假单胞菌的HPPD序列比对。氨基酸根据假单胞菌序列编号，星号表示运些序列共有 的氨基酸。
[0144] 序列表
[0145] SEQIDNO 1 :编码巧光假单胞菌HPPD的核酸序列
[0146] SEQIDNO 2 :巧光假单胞菌HPPD的氨基酸序列
[0147] SEQ ID NO 3 :编码拟南芥HPPD的核酸序列
[0148] SEQ ID NO 4 :拟南芥HPPD的氨基酸序列
[0149] 沈QIDNO 5 :编码小鼠HPPD的核酸序列
[0150] 沈Q ID NO 6 :小鼠HPPD的氨基酸序列
[0151] SEQIDNO 7 :编码粗球抱子菌HPPD的核酸序列
[0152] SEQ ID NO 8 :粗球抱子菌HPPD的氨基酸序列
[0153] SEQ ID NO 9 :编码小麦叶枯病菌HPPD的核酸序列
[0154]SEQ ID NO 10 :小麦叶枯病菌HPPD的氨基酸序列 [01巧]SEQ ID NO 11 :编码大麦HPPD的核酸序列
[0156] 沈QIDNO 12 :大麦HPPD的氨基酸序列
[0157]SEQ ID NO 13 :编码玉米HPPD的核酸序列
[0158] 沈QIDNO 14 :玉米HPPD的氨基酸序列
[0159]SEQ ID NO 15 :编码胡萝h HPPD的核酸序列
[0160] 沈Q ID NO 16 :胡萝h HPPD的氨基酸序列
[0161]SEQIDNO 17 :编码阿维链霉菌HPPD的核酸序列
[0162] 沈Q ID NO 18 :阿维链霉菌HPPD的氨基酸序列
[016引 SEQ ID NO 19 :引物序列 kerflOOl
[0164] SEQ ID NO 20 :引物序列 kerflOOS
[016引沈Q ID NO 21 :引物序列 kerflOOS
[0166] SEQ ID NO 22 :引物序列 kerflOCM
[0167] SEQIDNO 23 :引物序列kerflOO?
[016引 SEQIDNO 24 :引物序列kerflOOS
[0169]沈QIDNO 25 :引物序列kerflOll
[0170]沈QIDNO 26 :引物序列kerflO。
[0171] SEQIDNO 27 :引物序列kerflOH
[017引 沈QIDNO 28 :引物序列kerflOie
[017引 沈QIDNO 29 :引物序列kerflOig
[0174] SEQIDNO 30 :引物序列kerflOSO
[017引 沈QIDNO 31 :引物序列kerfiois
[0176]沈QIDNO 32 :引物序列kerflOlS 实施例
[0177] 在W下实施例的辅助下将会更好的理解本发明的各方面。W下在运些实施例中描 述的所有方法和操作通过举例的方式给出，对应于从可达到相同或相似结果的不同方法中 作出的选择。该选择对结果的质量没有影响，因此技术人员可使用任何合适的方法W达到 相同或相似的结果。DNA片段操作的大多数方法在《现代分子生物学实验技术》广化rrent ProtocolsinMolecularBiology"),第 1 卷和第 2 卷，AusubelF.Μ.等，格林出版公司 (GreenePublishingAssociates)和WI公司（WileyInterscience) (1989)、《分子克隆》 (Molecularcloning)，Τ.Maniatis,E.F.Fritsch,J.Sambrook, 1982 或SambrookJ.和 RussellD., 2001,《分子克隆：实验手册》(Mole州larCloning:a1 油oratorymanual)(第 Ξ版）中有描述。
[0178] 实施例1 :突变HPPD的制备
[0179] 概述
[0180]首先将拟南芥A地PPD编码序列（133化Ρ)(GenebankAF047834 ;W0 96/38567)克 隆入表达载体P犯-30 (QIAGEN)的限制性位点BamHI和Hindlll之间。
[0181] 首先将巧光假单胞菌P甜PPD编码序列（1174bp) (Riletschi等，Eur. J.Biochem.，205, 459-466, 1992,WO96/38567)克隆入提供起始密码子的表达载体 PKK233-2 (法玛西亚公司）独特的化〇1位点。
[0182] 载体P犯-30-A地PPD和地K233-2-P甜PPD用于PCR介导的化〇1限制性位点和编 码N末端化S厂标签的序列连接于A地PPD和P甜PPD的5'端，W及甜al限制性位点连接 于A地PPD和P甜PPD的3'段。
[0183] 从琼脂糖凝胶中分离A地PPD基因的PCR产物，用限制酶化01和甜al切割， 用Mi址lute?PCR纯化试剂盒（恰根公司（Qiagen))纯化，克隆入用相同限制酶切割的 pSE42(KRI)NX载体。
[0184] 对于P甜PPD基因，从琼脂糖凝胶中分离PCR产物，克隆入pC民"2.1-??ΡΟK载体。 用限制酶化〇1和甜al将其从该载体上切离，从琼脂糖凝胶中分离，并克隆入用相同限制酶 切割的pSE42(KRI)NX载体。
[0185] 然后对PSE420α?Ι)ΝΧ-Α地PPD和-P甜PPD二者进行PCR介导的定点突变，W在两 个基因的相应位点改变指定的密码子。所述密码子分别在WTPfHPPD中编码Gly336和在 WTA地PPD中编码Gly422。
[0186] 采用焦憐酸测序(Pymsequencing")技术分析编码序列中的突变密码子。
[0187] PCR介导的编码N末端化Se-标签的序列与化〇1和甜al限制性位点的连接：
[018引在96孔PCR板的24孔上分别进行各基因（A地PPD和P甜PPD)的PCR反应。由 于该反应的正向和反向引物在大小上有18(A地PPD)和22bp(P甜PPD)的差异，因此实施 40. 9°C-64. 5°C的退火溫度梯度，各孔置于该范围内的另一个退火溫度下。在引物与单链模 板进行第一次退火时，在新链中产生了 5'突出端，直到合成出其互补链，由第一引物的5' 区域形成的该突出端成为模板的一部分。由此编码序列在两端延伸，在两端引入编码N末 端Hise-标签的序列和限制性位点。
[0189] 该反应混合物包含50化gP犯-30-A地PPD(ΙμΙ来自质粒大量抽提）或lyg P邸233-2-P甜PPDDM〇).75μL来自质粒大量抽提）、用于A地PPD的ke计iOOl和ke计i002 分别1μ1、或用于PfHPPD的ke计i003和ke计i004分别1μ1 (所有引物溶液均具有 10pmol*yLi的浓度）、2