专利名称：：筛选方法
技术领域：
：本发明涉及筛选方法，具体地讲，涉及筛选DNA文库、以便鉴定在宿主细胞中表达时能导致所述宿主细胞的表型发生至少一种改变的DNA分子的方法。DNA文库能够方便地储存和分析多核苷酸，以及它们的转录(mRNA)和表达产物(肽，多肽或蛋白质)。本文所使用的术语“DNA文库”意在包括DNA分子的总称，其中，所述文库的各个成员编码不同的单个基因和/或其片段和/或变体。或者，所述文库的每一个成员编码不同的多种基因和/或其片段和/或变体。DNA文库的筛选通常是直接研究异源DNA序列和/或它的表达产物，很少或不考虑它对细胞的影响。另外，大部分已知的DNA文库筛选方法不是快速、高处理量、便于使用的技术。根据本发明，提供了用于筛选DNA文库的方法，包括(i)提供进行电生理学测定的基质，在该基质上可以排布至少一个细胞；(ii)提供能表达至少一种异源DNA序列的至少一个细胞；(iii)将至少一个细胞排布在所述基质上，以便可以检测和/或测定所述细胞的电生理学的变化；和(iv)鉴定具有至少一种表现型改变的至少一个感兴趣的细胞。在本发明的方法中，筛选DNA文库能够精确研究具有已知和未知功能的核苷酸序列，包括与所述细胞表现型相关的基因以及它们的表达肽，多肽和蛋白质。优选的是，所述感兴趣的细胞和/或遗传材料是分离的，以便能够进一步研究所述异源DNA，例如通过测序研究。优选的是，将所述进一步研究的结果保存在信息载体上。最优选的是，所述信息载体是选自下列一组中的一种或多种纸件，电子邮件，计算机磁盘和互联网网页。优选的是，提供多个细胞。最优选的是，每个细胞包括不同的异源DNA序列。因此，所述多个细胞共同构成了DNA文库。优选的是，能表达给定DNA文库的细胞群体的筛选是通过电生理学测定和/或荧光显微术和/或对细胞体积和/或形状的改变的显微镜分析进行的。将本发明的方法用于电生理学测定。在小的膜区域通过在电压钳条件下对所述膜片进行电绝缘研究离子通道的原理，在以下文献中进行了概述Neher，Sakmann，和Steinbackin″细胞外膜片钳，通过生物膜中的开放通道分辩电流的方法″，PfluegerArch.375；219-278，(1978)。所述作者发现，通过将装有乙酰胆碱(ACh)的吸液管压在肌细胞膜的表面上，可以看到电流的不连续地跳动。这是由于ACh-激活的离子通道的开放和关闭造成的。他们的研究工作受到了以下事实的局限与所述通道的阻抗(10GQ)相比，吸液管玻璃和所述膜之间的密封阻抗(10-50MQ)是非常小的。通过这种密封所产生的电噪声大到足以妨碍流过离子通道的电流。随后发现，通过对玻璃吸液管进行火琢(firepolishing)，并且对吸液管的内部施加吸力，用所述细胞的表面可以获得非常高的阻抗(1-100GQ)。这种千兆封口将所述噪音降低了一个数量级，达到可以对大部分感兴趣的生物学通道进行研究的水平，并且大大拓宽了可以进行这种研究的电压范围。这种改进了的密封被称为″千兆封口″，并且将所述吸液管称为″膜片吸液管″(patchpipette)。有关千兆封口的更详细的说明参见以下文献O.P.Hamill，A.Marty，E.Neher，B.Sakmann&F.J.Sigworth用于对来自细胞和无细胞膜片的电流进行高分辨率纪录的改进的膜片钳术。PflugesArch.391，85-100，(1981)。离子通道是能催化无机离子通过细胞膜转运的跨膜蛋白。离子通道与很多细胞过程相关，包括产生和定时动作电位，突触传递，激素分泌，肌肉收缩。很多药物是通过调节离子通道发挥它们的特殊作用的。其例子包括抗癫痫的化合物苯妥英，它能封闭大脑中的电压依赖性Na+-通道，以及抗高血压的药物硝苯吡啶，它能封闭平滑肌细胞中的电压依赖性Ca2+-通道。除了化学诱导的离子通道活性调节之外，所述膜片钳技术使得科学家能够对电压决定型通道进行操纵。该技术包括调整膜片吸液管中的电极的极性，以及改变盐溶液的配方，以便调节浴液中的游离离子水平。优选的是，对表型改变的筛选还可以通过研究异源DNA序列的作用，同时施加细胞内和/或细胞外测试试剂进行。最优选的是，所述测试试剂是选自下列一种或多种成分中的至少一种小有机分子(MW＜1000g/mol)，小肽(少于100个氨基酸)，神经递质，激素和细胞因子。优选的是，所述包括异源DNA序列的细胞是动物细胞，最优选的是选自人类胚胎肾293(HEK293)，中国仓鼠卵巢(CHO)，COS，MDCK，NG108，NIH3T3或T84细胞。当细胞外(例如，离子浓度，温度或配体蛋白浓度)或细胞内(例如，离子浓度，蛋白浓度或异源蛋白)成分改变时，就可能发生细胞条件的改变。因此，重组DNA序列的存在，可能影响细胞条件，以及可测定的表现型。重要的是，所述影响是对细胞内成分产生的，其中，表达了所述重组DNA，因此改变了蛋白浓度，并且通过其中某些蛋白的功能而影响其他细胞过程。所述表达的异源蛋白的影响还可以延伸到影响细胞外条件。所述表达的重组蛋白影响细胞条件的一个例子是当所述表达的重组蛋白是细胞膜离子通道时发生的。细胞内和细胞外条件都受到了影响。离子通道允许和/或导致离子通过细胞膜运动。这种运动是细胞外到细胞内的或者相反，并因此改变了细胞内和细胞外的离子浓度。细胞条件的上述变化是表型变化，这些变化可以测定，并且用于指示感兴趣的基因型的存在，即编码导致宿主细胞表现型发生可测定变化的基因型的重组DNA。所述表型改变是相对源于被转染的宿主细胞相同的细胞系的对照细胞进行的，差别在于所述对照细胞没有用重组DNA序列进行转染。宿主细胞表型的改变可以利用本文所披露的芯片装置测定，以便在与所述芯片的基质接触的同时，对所述宿主细胞进行表型测定。用于本发明的细胞表达的DNA文库的构建，可以通过标准PCR和克隆技术，同时结合逆转录病毒载体技术进行。将DNA文库的每一个成员导入宿主细胞，以便每一个细胞仅包括一种重组DNA构建体。两种或两种以上异源重组构建体的存在，能削弱任何潜在可观察到的表型信号，并且使得所观察表型的原因性基因型的表征变得更困难。将一种重组构建体稳定整合到每一个细胞中的目的，可以通过使用逆转录病毒颗粒的低感染复数(MOI)实现，确保宿主细胞的低水平感染，并且结合进行对包含在逆转录病毒载体上的抗性基因的筛选。优选的是，用于筛选的抗性基因是选自下列一组新霉素，嘌呤霉素，杀稻瘟菌素D或zeomycin。要研究的DNA文库的优选例子是cDNA、随机化的、多态性和基因组文库。我们所说的″cDNA文库″表示通过细胞mRNA的逆转录获得的DNA文库。优选使用标准化cDNA文库，以便消除由于高度表达的基因所产生的偏差，我们所说的标准化cDNA文库表示这样的cDNA文库，其中，降低了高频率cDNAs的频率，产生了大致相等的cDNAs代表。我们所说的″随机化文库″表示单一多核苷酸的DNA文库，其中，该文库的每一个成员与其他成员相差一个或多个核苷酸，并且所述变化是人工引入的。我们所说的″多态性文库″表示单一多核苷酸的DNA文库，其中，该文库的每一个成员与其他成员相差一个或多个核苷酸，其中，所述改变是所述多核苷酸的天然和固有的特征。我们所说的″基因组文库″是通过分级分离完整的细胞基因组DNA获得的DNA文库。DNA文库可以通过若干种不同的分子技术构建。互补的DNA(cDNA)文库——最常用的DNA文库，可以用从真核细胞中分离的mRNA构建。mRNA的结构中引入了在转录后加工期间添加的3′polyA尾巴，使得能够从加工过的mRNA合成cDNA。将分离的mRNA与过量的polyT寡核苷酸和逆转录酶一起温育，其中，所述polyT寡核苷酸与所述互补的polyA尾巴退火。所述逆转录酶随后可以用polyT寡核苷酸作引物，由它启动DNA合成，从而所述mRNA起着模板的作用，生成单链DNA，进而用作双链cDNA合成的模板。可以将所述cDNA用于标准PCR反应中，或用于克隆到载体上，以便制备DNA文库[FMAusubel等″CurrentprotocolsinMolecularBiology-VolumeOne″JohnWiley&sons，Inc.(1995)]。由于是利用mRNA合成的，cDNA与基因组DNA的差别在于，它不包括调控序列或内含子。所产生的cDNA体现了在特定时间细胞的mRNA组成，并且不可能同样体现来自亲本细胞的基因组的每一个基因。因此，cDNA文库有偏向性地体现细胞mRNA，主要包括多拷贝的管家基因，以及以几个或没有拷贝的形式存在的低表达基因。另外，存在未表达的基因，它们并不包括在所产生的cDNAs中。通过统一化方法可以制备能更均等地体现细胞mRNAs的cDNA文库[MBSoares等″统一化cDNA文库的构建和表征″，PNAS91pp.9228-32(1994)]。这一过程是通过以下方法实现的使用互补的单链cDNA作退火配偶体，并且随后筛选游离的单链cDNA。这种方法确保了高频率cDNAs主要与互补链结合，并且显著降低了频率，同时，正常情况下低频率的cDNAs只会中等程度地减少。可以重复用这种方式进行筛选，以便生产能适当等同地体现cDNAs的文库。另一种DNA文库是通过直接分级分离细胞基因组DNA，并且将所得到的片段插入合适的载体上而构建的基因组DNA文库。这样的文库包括具有完整的非编码区的DNA。通常，基因组DNA的分级分离是通过机械或酶促方法实现的。另一种类型的DNA文库是随机化文库，其中，所述文库包括编码单一基因的克隆，每一个克隆包括一个或多个核苷酸的不同修饰，通常与研究中的蛋白质的相同的具体肽结构域相当，但并不排除其他可能。所述随机文库可以是利用PCR方法构建的[TOhmichi等″具有优化的单链启动子的DNA纳米环载体的有效细菌转录″，PNAS99pp.54-59(2002)；TJespersen等，“通过核酸外切酶″外端平整″进行的由非PCR介导的PCR片段的有效的重叠延伸”，Biotechniques23pp.48-52(1997)]。通过掺入了随机化核苷酸序列的PCR引物将随机化修饰导入所述靶核苷酸，因此将所述修饰定点到特定的氨基酸位点。再一种类型的DNA文库是多态性文库。在特定生物群体内的很多基因是多态性的，即编码特定蛋白的相同基因存在天然变体。例如，主要组织相容性复合体(MHC)蛋白包括在肽结合裂缝中的氨基酸多态性，因此所述结合裂缝是不同的，导致不同个体在它们的MHC蛋白结合特定靶的能力方面的改变[PJBjorkman和PParham″I型主要组织相容性复合体分子的结构，功能和多样性″Ann.Rev.Biochem.59pp.253-288(1990)]。因此，多态性文库包括所述文库的每一个成员，这些成员编码单一基因的不同多态性拷贝。所述文库特别有利于药物筛选，以便研究与基因的特定多态性形式相关的不同的反应形式和潜在的副作用。将DNA导入细胞的方法为本领域所熟知[Sambrook&Russell，″Molecularcloning；Alaboratorymanual″3rdedition，ColdSpringHarborLaboratoryPress(2001)]，包括电穿孔，脂质体介导的转移，磷酸钙共沉淀和显微注射。电穿孔是通过对含有DNA和待转染细胞的溶液施加短时间的电脉冲实现的[ReviewKShigekawa&WJDower″真核细胞和原核细胞的电穿孔将大分子导入细胞的通用方法″，Biotechniques6pp.742-751(1988)]。所述电脉冲会导致细胞膜的短时间透化，在此期间，DNA能进入细胞的细胞液。随后该DNA的一部分出现在细胞核中，在这里发生了所导入基因的瞬时表达，通常在转染之后24-72小时之间达到高峰。脂质体介导的转移(脂感染)是利用具有类似天然脂类细胞膜的人工脂膜的小泡(脂质体)携带重组DNA。所述脂质体能够自发地与细胞膜融合，从而将它们的内含物释放到细胞质中。[综述——RJMannino和SGould-Fogerite，″脂质体介导的基因转移″，Biotechniques，6pp.682-690(1988)]。FLBraham和AJvanderEb(″用于分析人类腺病毒5DNA的感染力的新技术″Virol.，52pp.456-467(1973))证实了磷酸钙共沉淀能大大增强基因向宿主细胞的转移。将DNA与磷酸盐缓冲液混合，向该缓冲液中添加氯化钙。该方法产生了磷酸钙和DNA的细小沉淀物，将该沉淀物应用在宿主细胞上，从而所述细胞历经若干小时时间将所述沉淀DNA摄取到细胞质中。通过显微注射方法可以将重组DNA可靠地导入宿主细胞。该方法需要细的针头以便穿入细胞，并且将DNA直接注射到细胞质中[MCapecchi，″通过直接显微注射进入培养的哺乳动物细胞进行高效转化″Cell，22pp.479-488(1980)]。显微注射可以用计算机控制的装置进行，它能提高该技术的精确性和速度。导入靶细胞的DNA序列是异源DNA。我们所说的异源DNA，表示业已导入所述细胞、超出所述细胞的正常DNA组成以外的DNA序列，并且，其中，所述DNA文库的每一个异源DNA成员与其他成员相差一个或多个核苷酸。异源DNA序列的可靠表达是通过将克隆的DNA稳定整合到宿主细胞DNA中实现的。例如，这一目的是利用基于逆转录病毒将它们的基因组稳定整合到宿主细胞DNA中的天然能力的逆转录病毒转导系统可靠地实现的[Mann等″逆转录病毒包装突变体的构建及其在生产无辅助缺陷型逆转录病毒上的用途″，Cell33pp.153-159(1983)]{图1}。在这样的系统中，将克隆的DNA导入病毒基因组。逆转录病毒转导系统通常包括两种功能因子，顺式因子和反式因子。反式因子编码病毒包装蛋白，而顺式因子编码其他必需的病毒核苷酸序列。将克隆的DNA导入所述宿主基因组，以便它被顺式因子包围成不能产生其自身包装蛋白的重组前病毒DNA，因此，将所述前病毒DNA转染到包装细胞中。包装细胞包括反式因子，并且能产生病毒外壳，将克隆的前病毒DNA包装到该外壳中，以便产生感染性颗粒。所述感染性颗粒被从宿主细胞中释放，并且可以收获，以便转染靶细胞培养物，其中，它能稳定地整合病毒基因组，包括包含在它里面的克隆DNA。因此，所述克隆的DNA可以在所述靶细胞中表达，而所述逆转录病毒不能进一步复制，因为所述重组病毒基因组缺乏必要的病毒基因[综述-JMCoffin″逆转录病毒科，病毒及其复制，pp.1767-1845″InDMKnipe等(ed.)″Fieldsvirology″Lippencott-Ravenpublishers(1996)]。附图的说明下面将结合附图对本发明的具体实施方案进行说明图1-表示利用逆转录病毒载体构建DNA文库和DNA文库的细胞表达的示意图。所述载体包括感兴趣的异源DNA(基因)，抗性标记(neo-新霉素抗性)和内部核糖体进入位点(IRES)。所述异源DNA的旁侧是顺式因子，包括长的末端重复(LTR)。该构建体的转录产生了包括所述异源DNA和所述抗性标记的mRNA。特定序列的随机化是通过PCR、随后进行重叠延伸实现的。2号引物包括随机化的核苷酸，以便将核苷酸变化导入特定位点。将通过PCR获得的片段混合在重叠延伸中，以便获得完整长度的载体，用于所述逆转录病毒载体转导系统。将所述载体构建体转染到包装细胞中，在这里，通过瞬时表达产生了上清液，该上清液在提取之后将包含可应用于所述靶细胞的病毒。图2-表示位于芯片上的检测位点处的单一靶细胞的示意图。所述细胞能表达单一基因组构建体。在所述细胞的下面是测试位点和孔之间的小的开口，对位于该位点的细胞膜进行穿孔或将其去掉，以便进行电生理学分析。示出了其他表型分析(点划线)。还通过所述开口提取mRNA进行了基因型检测，在所述开口上的细胞膜是不完整的。图3-是优选的芯片结构示意图，其构造如下1.芯片外壳。2.微型结构单元。3.微型结构单元上的玻璃/硅膜。4.包括含有细胞外缓冲液和化合物的通道/区室的小池。5.含有细胞内缓冲液和来自具有完整细胞结构的细胞的mRNA的通道。6.用于导入细胞和化合物的入口/取液孔。7.细胞捕获位点，包括位于膜3上的孔。所述孔是适当成型的，以便能够进行千兆封口和形成完整细胞。8.悬浮液中的细胞。9.微型泵。图4-表示筛选细胞表现型的方法的示意图。具有用于表达cDNA的稳定整合载体的细胞——由它产生膜结合蛋白(例如，离子通道)。图5-表示肽随机化DNA文库的表型研究的示意图。筛选与已知膜蛋白相互作用的肽调节化合物(编码序列-XXX)。可以测定影响该膜蛋白的肽的调节作用。图6-表示较大的蛋白-细胞调节剂的肽随机化的表型研究示意图。业已将低效率调节子随机化，以便提高它与已知膜蛋白的结合效率。X是来自所述DNA文库的随机化构建体。图7-表示较大的蛋白-受体——例如ScFv——的肽随机化表型研究示意图。ScFV结合位点随机化(改变的区域通过X表示)可能影响结合亲和力，而对这种亲和力可以进行表型测定。实施例实施例1-优选实施方案的说明预测性实施例在细胞系中表达的基因组文库的构建该实验的目的可以是增强特定配体与特定离子通道的结合。这是通过对已知配体与之结合的离子通道内的特定氨基酸进行随机化实现的，包括将这些随机化的基因产物导入细胞，并且在显微阵列系统中对它进行测定。显微阵列测定的例子如例3，4，5所述。将所述离子通道基因插入双顺反子逆转录病毒载体，该载体包括转导靶细胞所必需的所有逆转录病毒顺式因子，以及来自EMCV的内部核糖体进入位点，随后是新霉素选择基因(MorganRA，CoutureL，Elroy-SteinO，RaghebJ，MossB，AndersonWF。包括推测的内部核糖体进入位点的逆转录病毒载体多顺反子基因转移系统的开发以及在人类基因治疗上的应用。NAR1992，201293-9)。当所述离子通道基因被插入IRES因子上游时，所述离子通道基因和neo-基因将出现在来自该逆转录病毒载体转录单位的同一mRNA转录物上。所述离子通道基因随后通过帽子-扫描机制进行翻译，同时，所述neo翻译将从IRES因子开始。所述离子通道中四个氨基酸的随机化是通过基于两步骤PCR的方法完成的(参见图1)(通过核酸外切酶″末端平整″进行的非PCR介导的有效PCR重叠延伸。JespersenT，DuchM，PedersenFSBiotechniques1997Ju1；23(1)48，50，52)。在第一个步骤中，进行对所述转录单位(逆转录病毒载体)的每一个末端进行扩增的两个平行PCR。2号引物编码12个随机化的核苷酸(产生4个氨基酸)，紧靠与DNA链退火的序列的3′末端。在将这些随机化的核苷酸引入到所述离子通道的编码序列上时，将构建出多达204种不同的基因型。2号和3号引物在这些引物的5′末端是彼此互补的，因此通过这些引物导入的序列可用于重叠延伸方法。PCR应当用以下成分进行0.5pM引物(寡核苷酸)，100ng模板/100μl反应体积，2.5单位校正聚合酶(如Pfu(Stratagene)或PlatinumTaqDNApolymeraseHighFidelity(LifeTechnologies))，以及相应的缓冲液和200μMdNTP。PCR条件为在95℃下进行2分钟；随后95℃30秒，50℃15秒，72℃3分钟共15个循环，最后在72℃下进行5分钟。通过诸如BOSC23的逆转录病毒包装细胞，将通过所述重叠延伸方法获得的基因组文库导入靶细胞(PearWS，NolanGP，ScottML，BaltimoreD.通过瞬时转染生产高效价的无辅助逆转录病毒。ProcNatlAcadSciUSA.1993Sep15；90(18)8392-6)(CoffinJM(1996)Retroviridae)。在将所述PCR产物转染(例如，使用lipofectamine(LifeTechnologies)，按照生产商的说明进行)到所述包装细胞系中时，所述DNA可以被转录成RNA，该转录的RNA将被包装到由所述包装细胞所产生的逆转录病毒颗粒中。在转染72小时之后，对培养基进行过滤(0.5μm过滤器)，并直接添加到靶细胞中(转导)。在转导48小时之后，应当将选择(新霉素)培养基添加到所述细胞中。在14天之后，未转导的细胞会死亡，而转导过的细胞将形成集落。应当混合这些集落(胰蛋白酶化)，以便获得含有所述基因组文库的群体。此时，可以将该群体直接用于筛选实验或在-80度下保存。实施例2-用于表型分析的芯片在WO02/9402中披露了用于膜片钳实验的合适的芯片。为了在本发明中使用，对该芯片进行了改进，以便能够从细胞中提取mRNA，其结构如图3所示。所述芯片包括平面基质，它包括第一表面部分和相对的第二表面部分。第一表面部分具有多个位点，其中的每一个位点适合承载包括离子通道的结构。每一个位点包括与它相关联的测量电极，所述基质携带有一个或多个参考电极，所述测量电极和相应的参考电极是在彼此形成电解接触时、并且在它们之间施加电位差时，能够通过由一个电极输送离子、由另一个电极接受离子而在它们之间产生电流的电极。所述每一个位点适合在承载在该位点上的含有离子通道的结构和该位点的表面部分之间提供高电阻密封。在提供这种密封时，可以隔离含有所述离子通道的结构一侧上确定的、并且与测量电极电解接触的结构域与包括所述离子通道的结构的另一侧确定的、与相应的参考电极形成电解接触的结构域。该密封可以对通过所述电极之间的含离子通道结构的离子通道流动的电流进行测定和/或监测。本发明的电极是与所述基质整合的，并且已通过晶片加工技术生产的。可以通过主动或被动方法将存在于溶液中的包括离子通道的结构(例如动物细胞)导向基质上的位点。当所述包括离子通道的结构与所述位点，例如电极周围的基质接触时，接触表面在该位点(例如电极周围)上形成了高电阻密封(千兆封口)，以便可以利用相应的电极测定所述离子通道的电生理学特征。所述电生理学特征可以是通过由所述千兆封口包围起来的所述包括离子通道的结构的膜部分传导的电流。在本说明书中，术语″千兆封口″一般表示至少1G欧姆的密封，并且这是通常追求的最起码的密封程度，不过，对于某些类型的测定来说，当电流较大时，较低的值也可能足以作为阈值。优选使用膜片钳的完整细胞构造方法。该构造可以通过以下方法获得在与每一个许可的位点相关联的测量电极和参考电极之间施加一系列的秒电位差脉冲(secondelectricpotentialdifferencepulses)，监测在测量电极和参考电极之间流动的秒电流(secondcurrent)，并且当所述秒电流超过预定的阈值时，中断所述系列的秒电位差脉冲，以便使最接近测量电极的所述包括离子通道的结构部分破裂。另外，所述完整细胞构造可以通过让所述包括离子通道的结构最接近测量电极的部分与成孔基质相互作用获得。应当指出的是，在本发明中，术语“完整细胞构造”不仅表示其中完整细胞已与测量位点的基质接触、并且业已打孔或通过成孔物质造成开口而与细胞内部发生电接触的构造，而且还包括这样的构造，其中，业已安装了切割的细胞膜片，以便所述膜的外表面是“向上”，朝向要施加的测试样品。由于与一个位点相关联的所述测量电极是所述基质上的多个电极之一，并且所述包括离子通道的结构是存在于溶液中的很多结构之一，优选在特定的基质上存在多个测量位点。所述多个测量位点可以用于对多个测试细胞同时进行分析。实施例3-电生理学测定电生理学测定可以用由所述基质制成的芯片构建体进行，并且按照上文所述以及图3所示方法使用，从而通过对测试细胞施加电压改变来进行膜片钳测试。典型的测定包括在测定装置上添加特定的测试样品，为此，每一个测定装置是与其他测定装置彼此分离的，以避免测试样品的混合，以及在所述装置之间的电流传导。此外，对没有用异源DNA序列转化过的对照细胞进行测定，以便提供所述细胞系的对照表型参数。可以在任何时间对多个测试细胞进行研究，并且进行所述电生理学测定和分析，以便证实哪一个测试细胞表现出与所述对照细胞不同的表型(如果有的话)。将通过对测试细胞施加电压改变产生的电生理学测定值用于分析选自下列细胞表型特征中的一个或多种电流幅度(在去极化脉冲期间测定的最大电流)，激活动力学(在去极化脉冲期间电流增加的时间常数)，失活动力学(在去极化脉冲之后电流减弱的时间常数)，激活阈值(在细胞膜上打开离子可渗透的孔的电压电位)以及尾电流(在去极化脉冲之后测定的电流)(HilleB.Ionchannelsofexcitablemembranes.3thedition.2001.SinauerAssociates，Inc，Sunderland，MA，USA)。实施例4-基于荧光的筛选已知某些荧光探针能结合细胞分子，用于指示多种细胞参数中的一个或多种，包括，但不局限于pH(例如，H+特异性探针)，膜电位和离子的浓度通量(例如，Ca2+(fura2)和Mg2+(mag-fluo4)特异性探针(MolecularProbes，Inc，TheNetherlands))(MethodsCellBiol1989；30157-92BrightGR，FisherGW，RogowskaJ，TaylorDL.Fluorescenceratioimagingmicroscopy)(InoueS.Progressinvideomicroscopy.CellMotilCytoskeleton1988；10(1-2)13-7。在对位于所述基质上的测试细胞施加电压改变时——此时业已额外添加了荧光探针，所述荧光探针将与它的特异性靶分子(如果在测试细胞中存在这样的分子的话)结合，导致荧光信号的诱导。可以通过荧光显微术对所述荧光信号进行定量(MethodsCellBiol1989；30157-92BrightGR，FisherGW，RogowskaJ，TaylorDL.Fluorescenceratioimagingmicroscopy)(InoueS.Progressinvideomicroscopy.CellMotilCytoskeleton1988；10(1-2)13-7)，并由此翻译成被测量的细胞内条件的直接测定值，以便将测试细胞与对照细胞进行比较，从而确定表现出不同表现型的测试细胞。实施例5-大小或形状测定值对表达所述DNA文库的细胞大小或形状改变的测定能够用于鉴定与对照细胞相比业已影响了宿主细胞的总体物理构型的多核苷酸和/或基因和/或肽和/或多肽和/或蛋白。所述测定是通过自动化显微检测进行的(FoskettJK.[Ca2+]imodulationofCl-contentcontrolscellvolumeinsinglesalivaryacinarcellsduringfluidsecretion.AmJPhysiol1990Dec；259(6Pt1)C998-1004)(SMuallem，BXZhang，PALoessberg，和RAStar，在单个骨肉瘤细胞UMR-106-01中同时记录细胞体积变化和细胞内pH或Ca2+浓度。J.Biol.Chem.199226717658-17664)。实施例6-mRNA的分离和“命中”的表征提供“阳性”结果或“命中”(hit)的细胞是这样的细胞与来自相同细胞系的未转化过的对照细胞相比，它们具有改变了的表现型。一旦鉴定了阳性细胞，则表征其基因型就是筛选异源DNA序列的下一个步骤。通过从阳性细胞中分离mRNA，分析造成所述阳性表型信号的基因型的表征。所述mRNA的提取可以通过选自吸液、细胞裂解和机械取出的一种或多种方法进行。吸液是通过将吸液管、注射器、针头或类似的工具之一插入细胞并取出细胞质部分来进行的。优选的吸液方法是通过从所述芯片的测试基质的细胞固定位点上的通道抽取细胞质进行的{图2&3}。另外优选的是，通过所述通道取出mRNA的过程是通过微型泵(9)施加的吸力实现的，或在通过所述通道之后，将吸液管、注射器、针头或类似的工具之一插入所述细胞来实现的。裂解是通过将裂解缓冲液(例如，0.2MNaOH，1％SDS)添加到装有细胞的腔室中实现的，以便分解细胞膜，并且释放细胞成分。mRNA提取的机械方法是通过以下步骤进行的使用专门设计成从阵列的孔中取出细胞的工具将细胞从腔室中刮出。将所述细胞从所述腔室上刮掉的过程使所述细胞破裂，并且释放出细胞成分，然后从这些成分中提取mRNA。受到所施加的刺激影响的多核苷酸、肽、多肽和/或蛋白的进一步表征是通过从所述测试细胞中分离的mRNA进行RT-PCR(逆转录酶PCR)表征进行的。为了只扩增感兴趣的核苷酸，RT-PCR引物的设计需要对感兴趣的核苷酸序列有事先了解，或对感兴趣的核苷酸旁侧序列有事先的了解。在本发明中，位于所述感兴趣的核苷酸旁侧的区域是已知的，因为它们包括位于所述异源DNA序列旁侧的病毒载体区域。在从所述阳性细胞中分离了mRNA之后，将被设计成与感兴趣的核苷酸的旁侧病毒区互补的RT-PCR引物用于进行逆转录反应，以便合成单链cDNA。将该cDNA进一步用作常规PCR反应的模板，用于该反应的引物包括已知的限制位点，以便来自PCR的双链产物能够方便地亚克隆到其他载体上。这种包括感兴趣的核苷酸的新型载体可用于测序反应和用于表达合适的产物，以便更好地表征感兴趣的核苷酸，并且，如果合适的话，可以表征它的表达产物。例如，所述表达产物的进一步表征可以通过常规膜片钳技术或荧光测试实现。通过芯片技术分析细胞表达的cDNA文库，能够用于筛选多种已知和未知蛋白。可以针对所研究的蛋白质功能，对在具体筛选中所采用的参数进行调整，例如，如果所述筛选针对的是新的电压门控离子通道的话，所述筛选方法优选涉及电生理学参数。实施例7-测试试剂的应用优选的实施方案还可以包括让测试细胞接触测试试剂的步骤，所述测试试剂可能会或不会影响与异源DNA序列有关的表型。将所述测试细胞的表型与业已额外接触了所述测试试剂的对照细胞进行比较。优选的是，所述测试试剂是下列一组中的至少一种有机小分子，小肽，神经递质，激素和细胞因子。实施例8-本发明的其他用途本发明的主要用途是筛选DNA文库，但本发明的用途是多种多样的。本发明的潜在用途包括，但不局限于新型治疗化合物和新型药物目标的鉴定和/或表征和/或合成。其他用途包括以下成分的鉴定和/或表征参与或影响细胞级联反应和/或转导途径的分子；与靶分子结合相关和/或必需的结合蛋白的氨基酸。本发明的另一种用途是筛选随机化的和/或多态性文库，用于鉴定和/或表征具有增强的和/或减弱了的功能的变体。实施例9-作为起点的随机化文库随机化肽的表达，在新药物的潜在发现和小肽的功能和相互作用方式研究中都有重要意义{图5}。可以通过某些小肽改变蛋白功能和细胞途径，这一目的是通过它们与蛋白质内的特定肽结构域结合实现的。因此，所述小肽具有治疗疾病的潜在能力。对在本发明中发现的所述肽的进一步研究可能显示体内功能缺乏。不过，用分离的mRNA和表达的产物，还可以建立所述肽的结构模型，通过它可以得到能模拟所述肽的功能的合成有机化合物。另外，业已在体内的细胞外和细胞内发现了具有未知功能的多种小肽。随机化肽的表达是阐明所述小肽功能的一种方法。实施例10-作为起点的大蛋白质随机化文库其他随机化文库可以包括较大蛋白质内的局部肽结构域随机化{图6&7}。结合蛋白包括具有不同功能的结构域，即结合结构域和通常的效应子结构域。已知多种这样的结构蛋白能以较低的亲和力结合它们的靶分子，因此，将所述结合结构域进行随机化，以便提高(例如，抗体)或降低(例如，降低副作用)配体和靶蛋白之间的亲和力，可以产生要研究的理想文库。实施例11-作为起点的多态性文库存在于人群中的很多基因是多态性的。多态性文库在筛选潜在药物的副作用和不同的反应方式方面是具有价值的。当所述多态性文库较大和/或并非所有多态性序列都是已知的时，通过芯片技术进行筛选可能是有利的，因为这种技术有利于研究的方便性。权利要求1.一种用于筛选DNA文库的方法，其中包括(i)提供进行电生理学测定的基质，在该基质上可以排列至少一个细胞；(ii)提供表达至少一种异源DNA序列的至少一个细胞；(iii)将至少一个细胞排布在所述基质上，以便检测和/或测定所述细胞的电生理学的变化；和(iv)鉴定具有至少一种表现型改变的至少一个感兴趣的细胞。2.如权利要求1的方法，其中所述方法包括分离感兴趣的细胞和/或其遗传学材料的额外步骤。3.如权利要求2的方法，其中，所述方法包括从在步骤(iii)中鉴定的感兴趣的细胞中分离mRNA的额外步骤。4.如权利要求3的方法，其中，所述方法还包括对所述遗传学材料进行测序的步骤。5.如权利要求4的方法，其中，所述方法还包括将所述序列信息保存或纪录在诸如计算机磁盘的信息载体上的步骤。6.如上述权利要求中任意一项的方法，其中，在步骤(ii)中提供多个细胞。7.如上述权利要求中任意一项的方法，其中，在步骤(ii)中提供多个细胞，每一个细胞包括不同的异源DNA序列。8.如权利要求6或7的方法，其中，所述多个细胞共同包含了异源DNA的DNA文库。9.如权利要求8的方法，其中，所述DNA文库是cDNA文库。10.如上述权利要求中任意一项的方法，其中，所述细胞的电生理学变化是通过膜片钳技术检测和/或测定的。11.如上述权利要求中任意一项的方法，其中，所述细胞在步骤(iii)之前用测试试剂处理过。12.如权利要求11的方法，其中，所述测试试剂选自下列一组中的至少一种小有机分子，小肽，神经递质，激素和细胞因子。13.如上述权利要求中任意一项的方法，其中，所述细胞是动物细胞。14.如上述权利要求中任意一项的方法，其中，所述动物细胞选自人类胚胎肾293(HEK293)，中国仓鼠卵巢(CHO)，COS，MDCK，NG108，NIH3T3或T84细胞。15.如权利要求6-14中任意一项的方法，其中，所述细胞被排布在所述基质内或基质上的有间隔的位点处。全文摘要本发明涉及筛选方法，具体地讲，涉及筛选DNA文库，以便鉴定当在宿主细胞中表达时能够导致所述宿主细胞的表型发生至少一种改变的DNA分子的方法，所述表型改变可使用膜片钳芯片构建体检测。另外，本发明涉及与产生所述细胞表型改变的DNA分子相当的mRNA的分离。文档编号C12M1/34GK1665928SQ03815552公开日2005年9月7日申请日期2003年6月6日优先权日2002年6月7日发明者T·贾斯博森,M·贝克,J·库特钦斯基,S·P·奥尔森,R·泰伯瑞斯基申请人:索菲昂生物科学有限公司