专利名称：发酵戊糖的发酵单胞菌菌株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及纤维素类物质向燃料和化学物质的生物转化，特别涉及可将木糖、阿拉伯糖和甘露糖以及以上三种糖类发酵转化为乙醇的运动发酵单胞菌菌株(Zymomonas mobilis)。
背景技术：
发酵技术对于可再生的生物纤维素类物质转化为化学物质例如乙醇是非常有用的。典型的纤维素类物质包括35-45％的纤维素，30-40％的半纤维素和15％的木质素。水解成分含有葡萄糖聚合物，半纤维素的水解成分大部分是木糖。阿拉伯糖也是存在于生物材料例如switchgrass草和谷物纤维中的重要的可发酵底物。因此，在戊糖发酵中达到较高的特定产物的形成速率和转化效率对于利用可再生物质工业化生产燃料和化学物质是至关重要的。
现有技术广泛报道了运动发酵单胞菌在较低的pH、厌氧培养和含有抑制性化合物特别是与木质纤维素水解产物有关的抑制性化合物的培养基中，具有将葡萄糖底物快速、有效地转化为乙醇的能力。然而利用运动发酵单胞菌最明显的缺点是它不能发酵戊糖。为了克服这一缺点，现有技术使用可催化木糖和阿拉伯糖代谢的外源基因来构建重组运动发酵单胞菌菌株，它能发酵葡萄糖和木糖或阿拉伯糖的混合物或者上述三种糖的混合物。这些菌株和克隆载体都基于具有抗生素抗性标记的多拷贝质粒的使用。
美国专利No.5514583公开了一种转化了外源基因的发酵木糖的运动发酵单胞菌菌株(CP4/pZB4和pZB5)，编码木糖异构酶、木酮糖激酶、转醛酶和转酮酶的质粒载体(pZB4和pZB5)，进一步包括被发酵单胞菌识别的至少一种启动子(Pgap和Peno)，其可以调节至少一种所述基因的表达。该微生物能够生长于以木糖为唯一碳源的培养基中，发酵木糖转化为乙醇，最大理论产率88％。美国专利No.5712133和No.5726053公开了一种发酵阿拉伯糖的转化运动发酵单胞菌(39676/pZB206)，含有编码L-阿拉伯糖异构酶、L-核酮糖激酶和L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶、转醛酶和转酮酶的外源基因，上述酶可影响阿拉伯糖向乙醇转化的发酵能力。此外，还描述了质粒载体(pZB206)以及利用转化子发酵葡萄糖和阿拉伯糖底物的方法。美国专利No.5843760公开了一种发酵木糖和阿拉伯糖的转化运动发酵单胞菌(206C/pZB301)，含有编码木糖异构酶、木酮糖激酶、L-阿拉伯糖异构酶、L-核酮糖激酶、L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶、转醛酶和转酮酶的外源基因，进一步包括被发酵单胞菌识别的至少一种启动子，其可以调节至少一种所述基因的表达，所述微生物能够生长于以阿拉伯糖或木糖为唯一碳源或者两者结合作为碳源的培养基中，发酵阿拉伯糖和木糖转化为乙醇。此外，还描述了转化子结合质粒载体(pZB301，pZB401，pZB402，pZB403)使用的方法。虽然在控制条件的单一培养物中杂交质粒更容易保留在运动发酵单胞菌里，但当宿主生物生长于缺乏维持质粒的选择压力即存在抗生素时，杂交质粒开始变得不稳定。例如，上面所述菌株的外源基因能够稳定的表达约四十代。当运动发酵单胞菌生长于混合培养物例如纤维素同时糖化发酵过程中，它将与其他微生物竞争，此时质粒的不稳定性就会加剧。此外，对于工业应用例如乙醇的大规模生产而言，抗生素抗性标记是不受欢迎的。因此，最好能将克隆基因插入运动发酵单胞菌的基因组中，使其保持在一个较低的天然拷贝数水平，不会过表达，而且同基因组DNA一样稳定。
在大肠杆菌中，将外源基因插入基因组的经典方法是使用在溶原状态下能够稳定存在的噬菌体载体。基因的插入也可以通过同源重组，如果基因能够克隆到转座子允许的位点，也可以通过转座来实现。虽然已经证实在运动发酵单胞菌中存在转座(Pappas，K.M.，et al.，(1997)Journal of Aoolied Microbiology，82379-388)，但仅限于随机辅源营养的小Mm或者Tn5的多转座或者用于基因分析的抗生素抗性表型。据报道，通过Tn5衍生物插入的基因仅能稳定5-15代(Pappsa，K.M.，et seq.P.383，FIG.1.)。而且，在运动发酵单胞菌中通过同源重组来实现定点插入并未被证实，从发酵单胞菌中没有分离到噬菌体。
转座子Tn5和Tn10是本领域所熟知的，广泛用于诱变和各种革兰氏阴性菌的克隆DNA的插入，Herrero，M.，等人(1990)(J.Bacteriol.1726557-6567)描述了结合两套质粒将外源基因克隆并稳定插入革兰氏阴性真细菌染色体中的过程，(i)Tn10和Tn5的转座特性，(ii)对某些化合物的抗性，(iii)基于R6K的质粒pGP704自杀传递性质。最终构建物含有Tn10或者Tn5反向重复序列内的NotI或者SfiI位点。借助于两个附加的特定克隆质粒pUC18Not和pUC18Sfi，这些位点用于克隆DNA片段。新衍生的构建物只保留在受体宿主菌株中并产生R6K特异p蛋白，其是R6K及其衍生的质粒的基本复制蛋白。含有杂交转座子的受体质粒与染色体整合RP4转化入特定溶原性大肠杆菌例如E.coil Sm10(lpir)中，所述染色体整合RP4提供了广泛的宿主范围接合转移功能。通过与目标菌株接合，受体质粒转移到选择的宿主细菌中。位于转座子外部的质粒编码的关联转座酶介导杂交转座子从传递自杀质粒到目标复制子的转座。由于转座酶的功能在目标细胞中不能保持，这些细胞对进一步的转座免疫。在同一菌株的多次插入因此仅受明显选择标记的限制。
Herrero，M.，等人(1990)(Journal of.Bacteriol.172(11)6568-6572)描述了Tn5衍生的小转座子例如Tn5Tc集合体的构建。有可能利用Tn5衍生的小转座子例如Tn5Tc结合外源DNA片段进入各类革兰氏阴性菌的基因组中。小转座子由对卡那霉素有特异抗性的基因、作为选择标记的四环素和侧接了Tn5末端重复序列19个碱基对的NotI克隆位点组成。转座子定位在基于R6K的自杀传递质粒上，该质粒提供了IS50R转座酶tnp基因但位于转移元件的外部，其向受体的接合转移由受体中的RP4转移功能介导。由于不存在转座酶介导的次级转座、缺失和倒置，这些元件产生的插入通常更加稳定。也可参见Berg et al.，(1989)Transposable elements and the genetic engineering of bacteria，p.p.879-926，in D.E.Berg，Mobile DNA，American Society ofMicrobiology，Washington，DC.通过这种方法，衍生自Tn10的元件也能获得稳定的插入。Way，J.C.et al.，(1984)(Gene 32369-379)。
Herrero等seq.，p.6569描述了小Tn5Tc的结构，其用于诱变插入或者作为转座子载体用于侧接了NotI位点的DNA片段的克隆(克隆DNA片段首先进入pUC18衍生物pUC18Not和pUC18Not分离)。使用标准的重组DNA技术体外构建小Tn5Tc元件(Maniatis，T.，et al.，(1989)Molecular cloninga laboratorymanual.Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.)。质粒的EcoRI片段将它们作为插入子忍受时，就可确定其四环素抗性(Fellay，R.，et al.(1987)Interposon mutagensesis of soiland wate bacteriaa family of DNA fragments designed for in vitroinertion mutagenesis of Gram-negative bacteria.Gene 52147-154)。片段克隆到pUC18Sfi单一的EcoRI位点上，作为SfiI片段被切除，并插入到pUT里Tn5末端的19个碱基对之间，从而在任何情况下转移单元都会作为转移质粒XbaI-EcoRI部分存在。最终元件是小Tn5Tc。
基于Tn10的转座子载体传递系统描述于Herrero，M.et seq.1726557-6567，IRP167的衍生物噬菌体1携带有5.1kb的含有小Tn10Km元件的EcoRI插入片段，IS10R的转座酶基因定位于移动元件反向重复序列的外侧和PTac启动子的下游。为了获得可独立于宿主调节其转座的转座子转移质粒，EcoRI插入片段与pBOR8连接，它衍生于pGP704，含有来源于质粒pMJR1560的laclq基因。这一质粒由于缺乏pir基因的R6K特异性p蛋白产物，因此不能在宿主菌株内复制。pGP704含有RP4质粒的接合转移来源(oriT序列)，所以当被赋予移动功能时，就可以转移到革兰氏阴性菌中。含有小Tn10的起始卡那霉素抗性基因的起始特异性p蛋白产物的MiuI片段在反向重复序列内，并被含有SfiI-Pttz组件的片段取代，通过加入NotI位点和MluI结合体使之被适当修饰，产生pLODPtt。这一构建体在小Tn10的反向重复序列之间具有SfiI，NotI和XbaI克隆位点。pLODPtt的Ptt抗性标记(Ptt’)转变为卡那霉素抗性以生成质粒pLOFKm。
为了形成含有戊糖发酵生产乙醇所必需的遗传成分的遗传稳定菌株，需要对运动发酵单胞菌进行遗传操作，然而这一操作仍然存在困难，使发酵单胞菌能够利用戊糖的遗传成分编码木糖异构酶、木酮糖激酶、转醛酶和转酮酶。
由于上述原因，需要构建稳定的重组运动发酵单胞菌菌株，其能够发酵戊糖例如木糖和阿拉伯糖或者二者从而生成乙醇。因此，需要编码戊糖代谢的酶的基因的稳定插入。同时还需要稳定的工业运动发酵单胞菌菌株，这类菌株具有抗生素抗性，在非选择性培养基中至少稳定40代以上。有价值的工业菌株最好还具有较高的接近与最大理论值的产物生成速率。现有技术中乙醇的微生物生产所存在的缺陷在本发明中得以克服。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种制备含有编码利用和发酵戊糖所需酶的外源结构基因的稳定的发酵单胞菌整合体的方法。在一些实施例中，这些酶选自由xylAB、tal/tkt和araBAD组成的组。在另一些实施例的构建体中，至少包括一种调节基因以诱导结构基因进入运动发酵单胞菌的基因组中。
本发明的另一个目的是提供一种改进的运动发酵单胞菌菌株，它能够稳定的表达编码在非选择培养基(即缺乏抗生素或抗生素抗性标记)中利用戊糖所必需的酶的结构基因。
本发明的另一个目的是提供一种改进的染色体或天然质粒修饰的运动发酵单胞菌菌株，它能稳定的表达结构基因，快速生成特定产物并具有较高的转化效率。本发明的稳定的发酵单胞菌整合体在80到160代以后仍然具有稳定性。在另一实施中，本发明提供一种改进的用于纤维素水解产物反应混合物的生物催化剂。这些生物催化剂是重组的发酵单胞菌，其构成本发明的部分内容。
本发明还提供一种对外源基因稳定插入细菌基因组非常有用的转座子。在一个实施例中，转座子包括至少一个具有编码酶的结构基因的操纵子，所述酶选自由xylAB、araBAD和tal/tkt组成的组；至少一个用于在细菌中表达结构基因的启动子；一对反向插入序列；操纵子包含在插入序列内，转座酶基因位于插入序列的外侧。在另一方面，本发明提供一种能够使戊糖发酵酶编码基因转化到发酵单胞菌基因组的质粒穿梭载体。在一些实施例中，质粒穿梭载体包括至少一个具有编码酶的结构基因的操纵子，所述酶选自由xylAB、araBAD和tal/tkt组成的组；至少一个用于在细菌中表达结构基因的启动子；与被转化的细菌基因组基因具有同源性的至少两段DNA片段。在另一个实施例中，本发明提供了整合至少两个含有戊糖发酵酶编码基因的操纵子的方法。在一个实施例中，这两个操纵子是PgapxylAB和Penotaltkt或者Pgaptaltkt。在本发明的另一个实施例中，运动发酵单胞菌ATCC31821菌株的复合限制系统可以用来生成稳定的戊糖发酵菌株。在另一个实施例中，转座子和穿梭质粒用来构建改进的稳定的能够发酵含有戊糖的底物从而生成乙醇的运动发酵单胞菌。此外，还提供了一种使用在非选择性培养基中稳定表达的遗传修饰的发酵单胞菌来将来源于纤维素的戊糖转化为燃料和化学物质的方法。
本发明的一方面特别提供了一种使用遗传修饰的发酵单胞菌由戊糖生产乙醇的方法。
在一个实施例中，该方法包括制备整合的发酵单胞菌菌株，其稳定的插入了编码至少四种戊糖发酵酶即木糖异构酶、木酮糖激酶、转醛酶和转酮酶的基因，所述整合包括至少两步整合，第一步为同源重组，第一操纵子结合第一和第二戊糖发酵酶的编码基因，第二步为转座，第二操纵子结合第三和第四戊糖发酵酶的编码基因，把整合的发酵单胞菌菌株加入到含有戊糖的原料中，通过发酵戊糖从而获得含有乙醇的混合物。
在一些实施例中，戊糖包括木糖、阿拉伯糖或者两者的混合物。因此，在一些实施例中，戊糖进一步被描述为来源于生物量。方法的一个特别方面在于使用了运动发酵单胞菌菌株(Z.Mobilis)ATCC31821。本发明的整合运动发酵单胞菌菌株被定义为整合的运动发酵单胞菌ATCC31821 Penotaltkt/PgapxylAB。在实施例中，特定的整合菌株被称作int2/321，int2/1821，x9t(enott)Pi#4，x9t(enott)Pi#8，321(5)，481，2032，2122，8b和321-a。
在一些实施例中，本发明提供了在相对高浓度的醋酸盐或者醋酸的存在下，能够发酵戊糖(木糖，阿拉伯糖)生成乙醇的整合的发酵单胞菌及其衍生物。在实施例中，本发明提供了在醋酸盐或者醋酸浓度为2g/L、4g/L、8g/L、10g/L、12g/L甚至高达16g/L时能够生产乙醇的整合的菌株。
本发明的另一个实施例提供了能够发酵戊糖原料生成乙醇的整合的发酵单胞菌。这些整合菌株的具体例子是int2/321，int2/1821，x9t(enott)Pi#4，x9t(enott)Pi#8，321(5)，481，2032，2122，8b和321-a。
在另一个实施例中，构建了携带有利用甘露糖的基因(manA)的载体并将载体转化运动发酵单胞菌ATCC31821和39676，从而得到发酵甘露糖的发酵单胞菌菌株。同样的转化方法用于本发明的整合的菌株，以产生能够发酵生物物质中的木糖和甘露糖或者木糖、阿拉伯糖和甘露糖的发酵单胞菌菌株。
在另一个实施例中，利用甘露糖的基因(manA)和利用甘露糖所需的任何其他基因被整合入运动发酵单胞菌ATCC31821和39676及其衍生物和所述的各种整合菌株的基因组中，产生能够发酵生物物质中木糖和甘露糖或者木糖、阿拉伯糖和甘露糖的整合菌株。
本发明的其他优点将在下面部分作进一步描述，通过描述和实施本发明，其优点是显而易见的。通过所附的权利要求中所描述的方法，将能够理解并达到本发明的优点。
附图的简要说明附图与说明书结合在一起构成说明书的一部分，其描述了发明的至少一个实施例，与说明书一起阐述了发明的实质。
图1是根据本发明的pGP704中的小Tn5的质粒图谱，其含有木糖同化酶操纵子。
图2是根据本发明的小Tn5系列构建物的质粒图谱。
图3描述了形成pUCtaltktSfi质粒图谱的一系列构建。
图4是tal/tkt-xylAxylB运动发酵单胞菌转接合子与Tal探针Southern杂交分析的结果。C是控制质粒Tn5 tal/tkt-xylAxylB。λ/H是DNA大小标记。
图5是tal/tkt-xylAxylB运动发酵单胞菌转接合子与Tnp探针Southern杂交分析的结果。C是控制质粒小Tn5 tal/tkt-xylAxylB。λ/H是DNA大小标记。
图6是根据本发明的稳定的发酵木糖的运动发酵单胞菌菌株的几种分离物的酶活性的示意图。
图7是图6的四种分离物(nos.21，22，5和11)的发酵曲线示意图，并与包含质粒菌株39673/pZB4和BC1/pZB4L进行比较。
图8描述了根据本发明的稳定的发酵木糖的运动发酵单胞菌菌株C25和D92的稳定性。图表以乙醇的产率和木糖利用参数为指标，表明了包含质粒菌株和基因组整合的木糖发酵菌株的稳定性。本发明的菌株C25和D92在90代以后仍然保持稳定。发酵培养基包括含有1葡萄糖和5％木糖的RM，温度恒定为30℃。
图9描述了生物量浓度(a)、乙醇浓度(b)，木糖利用率(c)，根据本发明的基因组整合的木糖发酵菌株C25和D92在含有4.5％葡萄糖和％木糖的RM培养基中间歇发酵的产率和％木糖利用结果的比较，发酵条件是pH5.0和pH5.5，温度30℃。
图10是整合质粒pZB1862-ldh-ara的图谱。araBAD插入到ldhL的NotI位点从而切断ldh。构建是以运动发酵单胞菌的复制质粒pZB1862为基础的。
图11是Tn10G的质粒图谱。IS10R是转座酶基因。IR是转座子的反向重复序列。AraBAD被插入到两段反向重复序列之间的NotI位点。
图12显示了通过同源重组得到的基因组整合的发酵木糖/阿拉伯糖的运动发酵单胞菌菌株与DIG-ara和DIG-ldh探针Southern杂交分析的结果。AX1，13，23，101，104和107是araBAD整合体。C25是对照宿主。PZB1862-ldhL-ara是分离自DH5α的对照质粒。λ/H是分子量标记23，9.4，6.6，4.3，2.3和2.0kb。
图13代表了通过转座子整合得到的基因组整合的发酵木糖/阿拉伯糖的运动发酵单胞菌菌株与DIG-tnp和DIG-ara探针Southern杂交分析的结果。G5，6，11，15，17，14和19是araBAD整合体。C25是对照宿主。Tn10G是对照质粒。λ/H是分子量标记23，9.4，6.6，4.3，2.3和2.0kb。图13(a)是tnp探针和PstI消化，图13(b)是ara探针和PstI消化。
图14代表了基因组整合菌株的转酮酶、转醛酶、木糖异构酶和木酮糖激酶的酶活性的条线图。206C/pZB301是对照质粒。206C是对照宿主。C25是木糖发酵整合体。G8是源自Tn10转座的木糖/阿拉伯糖发酵整合体。AX1和AX101是源自同源重组的木糖/阿拉伯糖发酵整合体。
图15代表了基因组整合菌株的L-阿拉伯糖异构酶、L-核酮糖激酶和L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶的酶活性的条线图。206C/pZB301是对照质粒。206C是对照宿主。C25是木糖发酵整合体。G8是源自Tn10转座的木糖/阿拉伯糖发酵整合体。AX1和AX101是源自同源重组的木糖/阿拉伯糖发酵整合体。
图16代表了基因组整合的发酵木糖和阿拉伯糖的发酵单胞菌菌株在RMGXA(1∶2∶2％)上乙醇产率的条线图，发酵条件是30℃，不控制pH。这些菌株在不同的代数时从培养物中接种到非选择性培养基上。
图17代表了基因组整合的发酵木糖和阿拉伯糖的发酵单胞菌菌株在30℃、控制pH下在含有1％葡萄糖，2％木糖和2％阿拉伯糖的RM上木糖和阿拉伯糖利用结果的条线图。这些菌株在不同的代数时从培养物中接种到非选择性培养基上。
图18代表了基因组整合的发酵木糖和阿拉伯糖的发酵单胞菌菌株在30℃、pH5.5时在含有4％葡萄糖，4％木糖和2％阿拉伯糖的RM上发酵能力的折线图。
图19是用于同源重组到运动发酵单胞菌菌株31821的pZB510XTc(19A)和pZB512XTc(19B)的质粒图谱。
图20是用于整合转座到运动发酵单胞菌菌株31821的pMODPenotaltktCm的质粒图谱。
图21A和B代表了运动发酵单胞菌31821整合体的Southern杂交印迹。实验中使用探针xylB(21A)和tkt(21B)。对照质粒包括pMODPenotaltktCmpZB510XTc和pZB512XTc，并注明了int2/321中的PgapxylAB来自pZB512XTc。int2/1821中的PgapxylAB来自pZB510XTc。λ/H作为分子量标记。
图22代表了x9t(inott)Pi#4、x9t(inott)Pi#8、int2/321和int2/1821以及对照菌株酶活性的条线图。
图23代表了x9t(inott)Pi#4、x9t(inott)Pi#8、int2/321和int2/1821在RMX培养基中生长适应的折线图。
图24是用于整合转座到运动发酵单胞菌菌株31821的pMODPgaptaltktCm的质粒图谱。
图25代表了#20和#21在RMX培养基中生长适应的折线图。
图26A和B代表了运动发酵单胞菌31821整合体的Southern杂交印迹。实验中使用探针xylB(26A)和tkt(26B)。对照质粒包括pMODPenotaltktCm、pMODPgaptaltktCm和pZB512XTc，并注明了321(5)中的PgapxylAB来自pZB512XTc。λ/H作为分子量标记。
图27A到C描述了发酵单胞菌整合体在RMGX中的木糖(27A)和葡萄糖(27B)的利用以及乙醇产量(27C)。
图28A和B描述了发酵单胞菌整合体在RMX中的木糖(28A)的利用以及乙醇产量(28B)。
图29A到C描述了发酵单胞菌整合体在RMGX(1％∶6％)中的控制pH发酵的葡萄糖(29A)和木糖(29B)的利用以及乙醇产量(29C)。
图30A到C描述了发酵单胞菌整合体在RMGX(3.5％∶3.5％)中的控制pH发酵的葡萄糖(30A)和木糖(30B)的利用以及乙醇产量(30C)。
图31描述了稳定性测试实验。
图32A和B代表了根据本发明的稳定的发酵木糖的运动发酵单胞菌菌株2032、8b、481和2/321-2的稳定性的条线图。图中用木糖的利用率(32A)和乙醇产率(32B)来表示基因组整合的发酵木糖菌株的稳定性。本发明的菌株2032、8b、481和2/321-2在80代以后仍然保持稳定。发酵培养基包含2％葡萄糖和2％木糖的RM并且温度恒定为30℃。
图33A和B代表了根据本发明的稳定的发酵木糖的运动发酵单胞菌菌株8b、2032、481和包含质粒菌株(31821/pZB5)的稳定性的条线图。图中用木糖的利用率(33A)和乙醇产率(33B)来表示基因组整合的发酵木糖菌株的稳定性。本发明的菌株2032、8b和481在80代以后仍然保持稳定。发酵培养基包含2％葡萄糖和2％木糖的RM并且温度恒定为30℃。
图34A到F描述了在pH为5.0、5.5和6.0且存在醋酸盐的情况下，葡萄糖利用(34A)、木糖利用(34B)、阿拉伯糖利用(34C)、生长(34D)、乙醇产量(34E)和乙醇产率(34F)的曲线。
图35A和B描述了从葡萄糖和木糖连续恒定的生成乙醇(35A)，和在醋酸盐浓度提高时副产物的形成(35B)。
图36A和B是在醋酸盐浓度为0、2、4和6g/L时木糖利用(36A)和乙醇产率(36B)的条线图。
图37A和B是在醋酸盐浓度为0、8、12和16g/L时木糖利用(37A)和乙醇产率(37B)的条线图。
图38是含有甘露糖利用基因的pZB701的质粒图谱。
图39A和B是#2、4、6、13和19在RMM培养基中的生长适应图。
发明的最佳实施方式除非特别说明，这里所使用的技术术语或者科学术语与本领域技术人员所公知的具有相同的含义。尽管任何与这里描述的类似的或者等同的方法和材料都可以用于本发明的实施和检验，但这里描述了较佳的方法和材料。所有提及到的美国专利都作为参考并收入本篇。
为了获得能够利用戊糖的遗传稳定的运动发酵单胞菌ATCC31821，使用两种整合方法，包括同源重组和转座。构建两个操纵子PgapxylAB和Penotaltkt(或者Pgaptaltkt)，每个都可以作为单一组件进行整合。优选的，每个操纵子都含有用于筛选整合体的抗生素抗性基因。
对于同源重组，PgapxylAB操纵子整合入菌株31821的ldh使用了4kb的DNA片段，其具有1kb的ldh区域并侧接了pgm和adhI基因。这一同源DNA片段被称作ldhL4。以31821DNA为模板，使用Pfu聚合酶，将片段ldhL4扩增为两个DNA片段(5’ldhLR和3’idhL4)，通过载体pZB1861的克隆进行重排。在PCR反应中引入NotI和SfiI位点，用于接下来的PgapxylAB和Tcr的克隆(见下面的实施例)。根据运动发酵单胞菌CP4的DNA序列设计引物(Yamano et al(1993)J.Bact.1753926-3933)。
对于转座，发现菌株31821具有一种限制系统，其可以降解导入宿主细胞中的甲基化的DNA。使用MiniTn5Tc via E.coli.Sm10(λpir)作为供体宿主的转座是不成功的。因此，Penotaltkt或者Pgaptaltkt操作子的整合是通过使用EZ∷TNTM插入试剂盒(Epicentre，Wisconsin)实现的，该试剂盒提供了高效的转座酶(基于Tn5)和携带有遗传改进的插入序列(Mosaic末端)的载体(pMOD)。使用该试剂盒，用转座子(转座酶束缚的Penotaltkt或者Pgaptaltkt)对宿主细胞进行转化，在这里，通过甲基化缺陷型宿主或者整合了Penotaltkt的天然运动发酵单胞菌31821质粒来制备DNA。
虽然下面的描述和实施例是关于两个操纵子整合到运动发酵单胞菌的基因组中的，但本发明的方法可以经过适当修饰从而用于四种戊糖利用基因中的每一种基因在其启动子控制下的整合。此外，任意数目的启动子都可用于本发明中进行目标基因的表达，只要该启动子能够使利用木糖的基因在运动发酵单胞菌中直接表达。
下面将对本发明的优选实施例作详细的描述，同时以附图作必要的说明，在下面描述的实施例中，“包含质粒菌株”与相关领域已审美国专利中所描述的菌株和载体相同或者相关。“运动发酵单胞菌基因组或基因”是指所有已经在给定运动发酵单胞菌中表达或者具有潜在表达可能性的基因。
实施例菌株，质粒和培养基大肠杆菌E.coli菌株C118λ(pir)，CC118(pir)(mini-tn5Tc)，SM/0λ(pir)和含有小转座子Tn5和Tn10的质粒pUC19，pLOF/Km，pUC18sfi，pUT/Tc和pUC18由K.Timmis博士(GBF-GesellschaftFur Biotechnoloische Forschung mbH，Mascheroder weg 1D-38124Braunschweig，联邦德国)惠赠。E.coliDH5α(生命技术)作为构建质粒的宿主。E.coliSM10λpir在接合试验中作为供体菌株使用。运动发酵单胞菌菌株ATCC39676及其变异株206C(美国专利No.5843760)在本发明中作为受体使用。构建基于Tn10的质粒并包含在E.coliCC118中。整合质粒在转化运动发酵单胞菌ATCC31821宿主或其变异株5C之前，先转化甲基化缺陷型E.coli宿主例如JM110和DM1，整合质粒是通过消除质粒31821/Pzb5得到的。在LB培养基中于37℃条件下振荡(200rpm)培养E.coli。除非特别说明，运动发酵单胞菌菌株保存于RM(10g/L酵母提取物，2g/L KH2PO4)中并添加20g/L葡萄糖、D-木糖或者L-阿拉伯糖。所有包含质粒的菌株都生长于适当抗生素存在的条件下，例如四环素(Tc)，对于运动发酵单胞菌和E.coli来说，在液体培养基中的浓度为10ug/ml，在琼脂培养基中，对于运动发酵单胞菌是20ug/ml，对于E.coli是10ug/ml。氨苄青霉素(Ap)，对于E.coli是100ug/ml。氯霉素(Cm)，对于运动发酵单胞菌是120ug/ml，对于E.coli是100ug/ml。为了再生和筛选运动发酵单胞菌转化体或者转接合子，使用接合平板(MMG或者MMX；10g/L酵母提取物，5g/L蛋白胨，2.5g/L(NH4)2SO4，0.2g/L K2HPO4和50g/L糖)并添加四环素或萘啶酮酸(20ug/ml)。所有的琼脂平板都用15g/L琼脂来制备。
在一些实施例中，含有所有四种基因(xylA，xylB，tal和tkt)的整合体生长于木糖培养基中。整合体从RMGTcCm转移到RMX(1∶50)，并于30℃条件下进行培养。为了适应RMX，在木糖培养基中生长的培养物在达到指数生长期时即转移到新鲜的RMX中。生长情况通常是由Spectronic 601(Milton Roy)的OD600测量来监控的。
通过将含有PpdcmanA的DNA片段克隆至穿梭载体pZB188来构建质粒pZB701。用PCR对Ppdc和ManA结构基因分别进行扩增，然后通过第三次PCR(重叠延伸PCR)结合在一起，从而使PDC基因的包括RBS启动子的5’转录和翻译调节区域和起始密码子与manA结构基因精确的融合。
重组DNA技术质粒DNA分离、限制性内切酶消化、连接和转化、琼脂糖凝胶电泳和其他的重组DNA技术的操作参见公开出版物Sambrook等人，(1989)，Molecular cloninga laboratory manual，Cold Spring Harbor laboratory press，Cold Spring Harbor，NY，或者各类试剂产品的说明书，这是本领域所熟知的。细胞重悬浮在250ml的50mM Tris-50mM EDTA缓冲液中过夜，从三毫升的悬浮细胞中提取运动发酵单胞菌的基因组DNA。在37℃下100ml的5％SDS溶液中用溶酶体处理细胞30分钟，然后加入RNA酶(终浓度等于20ng/ml)再培养30分钟。酚-三氯甲烷提取操作两次，以除去蛋白。乙醇沉淀回收基因组DNA。可选择的，也可使用Pruegen试剂盒(GentraSystem，MN)提取运动发酵单胞菌基因组总DNA，利用Qiaprep Spin Miniprep试剂盒(Qiagen，CA)提取质粒DNA。
接合，转座和转化采用过滤接合技术(Conway等，1987)将质粒从供体菌株E.coliSM10λpir或者S17-1转移到运动发酵单胞菌中。
在一些实施例中，使用商品试剂盒EZ∷TNTM插入试剂盒来生成用于转座的转座子。根据生产说明书的内容并稍作变化用转座酶处理质粒pMODPenotaltktCm。对于体外转座，在运动发酵单胞菌31821天然质粒(目标DNA)存在的情况下，用转座酶在37℃下处理整合质粒2小时。在转化到运动发酵单胞菌31821之前，反应在0.1％SDS和反渗析5％甘油以及5mMTris(pH7.6)中加热至70℃并维持10分钟。对于体内转座，用转座酶在室温下处理整合质粒1小时随即进行电穿孔(Bio-Rad基因脉冲发生器，0.1cm间隙容器，1.6kY，200ohms，25μFD)。在OD600＝0.4-0.6时收集细胞从而制备电感受态运动发酵单胞菌或者大肠杆菌细胞。用冰预冷的无菌水清洗细胞一次随即用10％甘油处理，并浓缩至约1000倍。将细胞等分并保存于-80℃下。
也可根据Zhang等人，(1995)Science 267240-243所描述的电穿孔的方法将质粒DNAs转化到运动发酵单胞菌39676或大肠杆菌细胞中。
Southern印迹分析采用Stratagene Posi印迹压力吸纸将DNA转移到尼龙膜上。通过聚合酶链反应(PCR)对DNA探针Tc，xylB，Tnp和Tal进行地高辛-UTP标记。用于DNA标记的引物如下所示Tc5’-TTGCTAACGCAGTCAGGC-3’(SEQ ID NO1)5’-GAATCCGTTAGCGAGGTG-3’(SEQ ID NO2)xylB 5’-TATGGGTTCAGCGGCATGAG-3’(SEQ ID NO3)5’-ATGGGCATGAGATCCATAGCC-3’(SEQ ID NO4)Tnp 5’-TCCTAACATGGTAACGTTC-3’(SEQ ID NO5)5’-CCAACCTTACCAGAGGGC-3’(SEQ ID NO6)Tal5’-CGTCTAAAAGArTTTAAGAAAGGTTTCGATATGACGGACAAATTGACC-3’(SEQ ID NO7)5’-CATTTTGACTCCAGATCTAGATTACAGCAGATCGCCGATCATTTTTTCC-3’(SEQ ID NO8)预杂交和杂交都是按照Boehringer Mannheim杂交试剂盒的说明书描述的内容来进行。
聚合酶链反应(PCR)扩增为了构建用于基因整合的整合质粒，使用Pfu聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)PCR扩增以下片段，其引物对也如下所示
1.5’IdhL4(1.9kb)模板运动发酵单胞菌31821 DNA引物P16(F)5’CCATCGATTCTAGAATCTCGCGTAATAAAACTATCAGGCGCAATCG3’(SEQ ID NO9)P17(R)5’CGCGGATCCAGATCTGGCCTAGGCGGCCTCATAATATGGGCAAAGACACTCCCG3’(SEQ ID NO10)2.3’IdhL4(2.4kb)模板运动发酵单胞菌31821 DNA引物P18(F)5’GAAGATCTGCGGCCGCGTTTTGGTGCCAATGTTATCGCC3’(SEQ ID NO11)P19(R)5’GAAGATCTAAGCTTGGATAGCGGCTTATAGCAACGAGTG3’(SEQ ID NO12)3.Tcr(1.5kb)模板pBR322引物Tc(F)5’AAAGGCCGCCTAGGCC3’(SEQ ID NO13)Tc(R)5’AAAGGCCTAGGCGGCC3’(SEQ ID NO14)
4.Cmr(1kb)模板pZB186引物Cm(F，Eag)5’CCGAATAAATACGGCCGCCTGTGACGGAAGATCACTTC3’(SEQ ID NO15)Cm(R，Eag)5’TAACGACCCTGCCGGCCGCCTGAACCGACGACCGGGTCG3’(SEQ ID NO16)构建pZB512XTc和pZB510xTc用于同源重组将PgapXylAB(来自pZB4)和Tcr(PCR产物)插入到5’IdhL4(1.9kb)和3’IdhL4(2.4kb)片段之间的NotI和SfiI位点之间，从而构建得到整合质粒pZB510xTc(见图19(A))。质粒pZB512XTc(见图19(B))的构建途径与此相似，只是PgapXylAB的定位与pZB510xTc中相反。
构建pMODPenotaltktCm用于转座PCR产生的Cmr片段克隆到载体pMOD(Epicentre，WI)的SmaI位点，获得pMODCm。来自pUCtaltk(zhang等人，(1995)Science 267240-243)的BglII片段克隆至pMODCm的BamHI位点形成pMODPenotaltktCm(见图20)。克隆到pMOD的片段两端侧接了19bp的Mosaic末端(IS)，其可以被转座酶识别从而进行转座。
从同源重组消除质粒以获得xylAB将生长于RMGTcCm(30℃)的运动发酵单胞菌5C/pZB512XTc的过夜培养物每天转移到5ml的37℃的RMG试管中进行继代培养(1∶100)，共转移10次。每次转移中，测量培养物中质粒的损失并与RMG和RMGCm平板的克隆数目进行比较。当包含质粒细胞的数量低于总数的10％，将培养物接种(1∶100)到RMGTc使潜在的PgapxylABTc整合体富集生长。RMGTc富集培养物转入RMGTc平板上并在RMGTc和RMGCm平板上影印培养。具有TcrCms表型的克隆应作进一步分析从而确定整合体。
酶分析在一些实施例中，根据Zhang等人，(1995)Science 267240-243的方法稍作改变，用运动发酵单胞菌整合体的无细胞提取物和控制菌株对木糖异构酶(XI)、木酮糖激酶(XK)、转醛酶(TKT)和转酮酶(TAL)进行分析。收集处于迟滞后期的培养物(30℃，OD600约1.2)用超声处理缓冲液(10mM Tris-Cl，pH7.6，10mM MgCl2)清洗一次随即进行超声处理以制备运动发酵单胞菌的无细胞提取物。离心(14,000rpm，45分钟，4℃)除去细胞碎片。
实施例1以下实施例描述了含有编码木糖同化酶基因的小Tn5Tc的构建以及该构建物接合转移到运动发酵单胞菌206C和ATCC39676。将Pgap-xylAxylB操纵子插入到质粒pGP704中小Tn5Tc的特异性NotI位点上，从而构建含有编码木糖同化酶基因的小Tn5Tc。参见图1。Pgap-xylAxylB操纵子取自质粒pZB4或pZB5，美国专利Nos.5712133和5726053。最终质粒命名为小Tn5Tc xylA/xylB(X4)和小Tn5Tc xylAxylB(X5)，通过电穿孔将其转化到供体菌株E.coli SM10λpir中并与运动发酵单胞菌ATCC39676或者206C菌株进行接合。运动发酵单胞菌206C公开于美国专利No.5843760，此处纳入作为参考。在含有Tc和萘啶酮酸的培养基中，挑选含有小Tn5Tc xylAxylB(X4)和小Tn5TcxylAxylB(X5)的SM10λpir供体获得九个发酵单胞菌Tcr转接合子。参见图2(b)。
然后对九个运动发酵单胞菌Tcr转接合子的基因组和质粒DNA进行Southern印迹分析。来自转接合子的基因组和质粒DNA用SphI消化，在杂交转座子和木糖操纵子内进行切割，并使印迹与Tc探针、XylB探针或者转座酶Tnp探针杂交。通过放射自显影可以确定(1)木糖操纵子Pgap-xylAxylB与Tcr基因一起插入发酵单胞菌的基因组中；(2)每个转接合子只有一个插入；(3)每个插入都在基因组的显著位置；(4)Tcr基因与XylB不存在于质粒部分；(5)tnp转座酶基因不存在于转接合子中。
对发酵单胞菌TcrPgap-xylAxylB转接合子进行酶分析以确定发酵单胞菌Tc Pgap-xylAxylB转接合子中木糖异构酶(XI)和木酮糖激酶(XK)得以表达。分析表明，所有转接合子的木糖异构酶水平大约为相应质粒酶水平的一半。类似的，包含质粒的菌株的木酮糖激酶活性的一半也与整合体的酶活性相当。在发酵单胞菌基因组中通过基因单拷贝表达的XI和XK的活性与包含质粒菌株的每个细胞10个拷贝相比，明显要高得多。
实施例2(C25)实施例描述了如何构建表达四种戊糖发酵基因的发酵单胞菌整合体。通过该方法可以构建一种在缺乏抗生素选择的情况下基因稳定性提高的发酵单胞菌整合体。为了制备戊糖发酵菌株，需要用小Tn5将几种酶基因转入运动发酵单胞菌基因组中，这些酶基因是木糖同化基因xylA和xylB，编码木糖异构酶和木酮糖激酶；戊糖磷酸途径基因talB和tktA，编码转醛酶和转酮酶。含有Pgap-xylAxylB和Peno-talB/tktA的两个操纵子在小Tn5中进行配置，得到的质粒结合到运动发酵单胞菌中。在位于小Tn5组件外侧的转座酶的作用下，单拷贝的Pgap-xylAxylB和Peno-talB/tktA插入到运动发酵单胞菌基因组中，这通过Southern杂交可以显示出来。对木糖异构酶、木酮糖激酶、转醛酶和转酮酶的酶分析显示，所有基因都得到表达，整合菌株表现出包含质粒菌株30-70％的酶活性。这些酶水平足以使机体生长并将特定的戊糖如木糖发酵生成乙醇。
为了简化克隆步骤，含有操纵子Peno-talB/tktA的Bg/II片段插入到新构建的辅助质粒pUSCfiMCS的BamHI位点(如图3所示)。将含有来自pUC19的多克隆位点的EcoR I-Hind III片段插入到pUCSfi中，从而构建得到辅助质粒pUSCfiMCS。
参见图2，Peno-talB/tktA作为SfiI片段从pUCtaltktSfi上切除，并克隆到小tn5-Tc-xylAxylB上。如图所示，在tn5-Tc-xylAxylB上，Tcr基因侧接了SfiI位点。用Sfi I对小tn5-Tc-xylAxylB进行部分或者完全消化并与Peno-talB/tktASfi片段连接，如图2(c)所示。部分消化生成含有Tcr基因的质粒，命名为小tn5-Tctal/tkt-xylAxylB(图2(c))，而完全消化产生的质粒不含Tcr基因，命名为小Tn5-Tc tal/tkt-xylAxylB，见图2(d)。
以上两种质粒都转化到供体菌株E.coli，S17-1中并与运动发酵单胞菌206C接合。在含有葡萄糖、Tc和萘啶酮酸的接合培养基中筛选小Tn5-Tc tal/tkt-xylAxylB的转接合子，对于小tn5-Tctal/tkt-xylAxylB，直接在含有木糖和萘啶酮酸的接合培养基中筛选转接合子。获得大量的生长于葡萄糖的小tn5tal/tkt-xylAxylB-Tc的Tcr转接合子。获得若干生长于木糖的小tn5tal/tkt-xylAxylB转接合子。
在80ml含有2％木糖的RM中，于30℃不控制pH的条件下，静态检测初始间歇培养物，以确定其发酵动力学。将RM+2％木糖平板上的克隆转移到RM2％木糖培养基上过夜培养，温度为30℃，直到培养物达到稳定的生长期(光密度600在500nm处为0.1)。它们作为接种物使用。使用P1047装配的Hewlett-Packard1090L高效液相色谱对木糖和乙醇进行分析。在65℃条件下操作折射率检测仪和Biorad HPX-87H有机酸分析柱，以0.01N的硫酸作为流动相，流速为0.6ml/min。通过发酵的糖的重量或者培养基中的总糖量来计算乙醇产量。最大理论产量为0.51g乙醇/g木糖。
对来自运动发酵单胞菌转接合子的基因组和质粒DNA样品进行Southern杂交分析，从而确定小tn5 tal/tkt-xylAxylB组件是否发生了转座。从小tn5 tal/tkt-xylAxylB的四个转接合子制备基因组和质粒DNA，用SphI消化。SphI在组件内切割两次，产生具有Tal探针同源性的一个片段。印迹与Tal探针或者Tnp探针进行杂交。图4的放射自显影显示了一条大于4kb(Peno-talB/tktA的大小)的带，它与运动发酵单胞菌的DNA相邻，所有制备的DNA与Tal探针杂交时都能检测到。三个样品(可能同源的nos.22，23和24)在质粒部分也显示出一条带，这表明天然质粒中发生了整合。样品no.21的运动发酵单胞菌基因组内也发生了整合，并且只插入了一个拷贝。这些转接合子的基因组合质粒DNA样品与Tnp探针的杂交(图5)表明样品DNA与Tnp探针之间没有同源性。这些结果表明，木糖同化和戊糖磷酸途径基因与Tcr基因一起转座到运动发酵单胞菌的基因组内，每个转接合子只进行了一个插入，插入位于基因组中不同的位置。
发酵单胞菌转接合子的木糖异构酶、木酮糖激酶、转醛酶和转酮酶的活性的测定方法如前所述(Zhang等人，1995)。前面已经提及，单一Pgap-xylAxylB拷贝在基因组的表达量大约为包含质粒菌株的XI和XK酶量的一半。不过，为了确定转醛酶(TAL)和转酮酶(TKT)是否已经在运动发酵单胞菌tal/tkt-xylAxylB-Tc和tal/tkt-xylAxylB转接合子内进行表达，进行了酶分析，如图6所示，对于所有的转接合子(nos.4，5，17，18，21，23和24)而言，其TAL的酶水平大约为其对应质粒的50-70％。整合体中TKT的活性大约为包含质粒菌株的30-70％。通过发酵单胞菌基因组内单拷贝基因的表达，质粒整合体的TAL和TKT的活性虽然只是稍有增加，但与包含质粒菌株每个细胞10个拷贝相比，活性明显提高。
所有四个tal/tkt-xylAxylB发酵单胞菌整合体(nos.21，22，5和11)都能在木糖上生长。以2％的木糖为底物，温度为30℃，研究这些整合体的初始发酵，发酵曲线如图7所示。从图中可以看出，运动发酵单胞菌整合体no.21的生长速率和糖利用速率比包含质粒菌株39676/pZB4慢。不过，大多数的运动发酵单胞菌整合体(nos.22，5，和11)与包含质粒菌株相当。所有的整合体都能通过木糖生产乙醇，最大理论产率为92％。
在非选择性培养中，对这些基因组整合菌株和三个包含质粒菌株的稳定性进行测量。所有的菌株都培养于RMG培养基中，每天连续大约每10代转移一次。40代以后，接种到含有1％葡萄糖和5％木糖的RM培养基的摇瓶中，以测量其将木糖转化为乙醇的能力。乙醇的产率和木糖的利用速率是衡量稳定性的重要标志。有两个基因组整合菌株(C25和D92)的稳定性显示超过90代，而包含质粒菌株(206/pZB4，206/pZB4L和BclpZB4L)只能稳定约40代。参见图8。
在含有不同葡萄糖和木糖总浓度(1％葡萄糖和5％木糖；3％葡萄糖和3％木糖；4.5％葡萄糖和4.5％木糖)的RM培养中，同时控制pH，分析菌株C25和D95的发酵行为。如图9所示，在pH为5和5.5且含有4.5％葡萄糖和4.5％木糖的RM培养基中，菌株C25显示出比菌株D92更高的木糖利用能力和乙醇产率。在下面的实施例中，阿拉伯糖同化基因被整合到C25基因组中。实施例3(AX)以下实施例描述了通过同源重组将阿拉伯糖同化酶引入到C25的基因组中，这是通过ldh和使用小转座子Tn10的转座来实现的。下面将要描述质粒pZB1862-ldhL-ara，通过电穿孔被转化到运动发酵单胞菌或者大肠杆菌中。在添加了葡萄糖和四环素的接合平板上筛选转化体。Tcr克隆能够生长在添加了木糖或者阿拉伯糖的RM培养基(RMX和RMA)，因此确定其为Ara+Xyl+。下面还会提及质粒Tn10G，采用过滤接合技术(Conway等人，1987)使其从大肠杆菌SM10λpir供体中转移到运动发酵单胞菌C25。产生的转接合子在含有阿拉伯糖的接合平板上进行筛选。
A.构建pZB1862-ldhL-ara并通过同源重组整合入C25过去曾经尝试，利用1kb的ldh片段作为同源区域，将araBAD整合入发酵单胞菌的基因组内，但没有成功。为了提高重组频率，需要有更大的同源区域。通过PfuPCR，包含ldh和侧接区域的2.5kb的DNA片段得到扩增。根据Yamano I.，(1993)Journal ofBacteriology，Vol.175，3926-3933公开的运动发酵单胞菌CP4的DNA序列设计引物。通过PCR没有得到所预想的2.5kb的片段，而是3.4kb的片段。用BamHI消化3.4kb片段，得到2.5和0.9kb两个片段。两个片段都通过PCR检测，使用设计的引物退火至只有ldh。2.5kb的片段产生了大小适当的PCR产物，而0.9kb片段却没有，这说明前者含有ldh序列。因此，克隆2.5kb的BamHI片段(命名为ldhL)并将其作为基因整合到C25的同源区域。
使用Pfu(Stratagene，La Jolla，CA)DNA聚合酶(Qiagen，Valencia，CA)PCR扩增ldhL片段。采用如下引物序列ldhL5’-TCGCGGATCCTCTATCCCTTTATTTTTCTATCCCCATCACCTCGG-3’(SEQ ID NO17)5’-TCGCGGATCCGCGGCTGACATACATCTTGCGAATATAGGG-3’(SEQ ID NO18)为了克隆的目的，需要将NotI位点引入ldhL，使寡核苷酸5’-CATGCGCGGCCGCC-3’(SEQ ID NO19)插入NcoI位点，其位于ldh基因的中部。新的NotI位点距离ldhL两端分别为1.4和1.1kb。含有NotI位点的ldhL的BamHI片段(2.5kb)连接到pZB1862的BcII位点。最后，分离自pZB206(美国专利Nos.5712133和5726053)的4.4kb的Pgap-araBAD克隆到ldhL的NotI位点，从而形成整合质粒pZB1862-ldhL-ara。如图10所示。
含有三个阿拉伯糖同化基因的Pgap-araBAD操纵子，通过同源重组整合到C25基因组的ldh位点。为了使araBAD基因整合到C25的基因组中，在大肠杆菌DH5α内构建pZB1862-ldhL-ara。通过电穿孔将质粒pZB1862-ldhL-ara转移到C25内。筛选和检测Tc抗性转化体以生长于阿拉伯糖上。在转化体的增殖过程中，可以使ldhL’-araBAD-ldhL’组件代替IdhL通过同源重组使Pgap-ara-BAD整合到C25基因组中。
为了富集和分离转化体，对转化体的质粒进行消除。质粒pZB1862-ldhL-ara将在运动发酵单胞菌中进行复制。不过，运动发酵单胞菌在次最优生长条件下(例如37℃)容易丢失外源基因。利用这一性质，将C25转化体在37℃、缺乏Tc的情况下亚培养，经过几次转移，就可以消除pZB1862-ldhL-ara。每一次转移，都检测培养物中质粒的消除情况。在第三次转移时，100％的细胞变为Tc5，说明质粒已经消除。将第三次、第四次、第五次和第六次转移的培养物接种到含有阿拉伯糖(RMA)的30℃的RM中，使潜在的Pgap-araBAD整合体富集生长。富集的细胞转移到RMG平板然后复制挑选到RMA、RMX和RMGTc平板上。对一些具有Xyl+Ara+Tc5表型的整合体(AX)作进一步分析，具体说明如下。这些整合体能够将木糖和阿拉伯糖作为唯一的碳源来使用。
B.构建Tn10G并接合到C25使用小Tn5来构建带有Peno-tal/tkt和Pgap-xylAB操纵子的C25。尽管C25中不存在转座酶基因，但利用小Tn10来进行后面的Pgap-araBAD的整合，以避免相同转座子之间任何的不相容性。以基于Tn10的传递质粒pLOFKm来构建质粒Tn10G(图11)。Kmr基因被分离自pZB206的Pgap-araBAD的NotI片段取代。构建Tn10G并保留在大肠杆菌C118内。然后将质粒转移到接合供体大肠杆菌SM10λpir从而与运动发酵单胞菌接合。由于Tn10G在运动发酵单胞菌中是自杀性质粒，所以只有整合了araBAD的转接合子才能在添加了阿拉伯糖的接合平板上生长。由于平板中有萘啶酮酸的存在，大肠杆菌SM10λpir供体受到抑制。在7天内平板上可以看到转接合子。在RAM和RMX上复制筛选克隆以确定其表型。筛选的克隆有86％是Xyl+Ara+。来自筛选平板的20个克隆交叉转移到不同的平板(例如从木糖平板转移到阿拉伯糖平板，反之亦然)。这些克隆有60％仍然保持Xyl+Ara+的表型。初始Southern杂交对20个克隆进行分析。使用tnp探针，大约50％的菌株其基因组内含有转座酶基因。用Southern杂交对8个整合体作进一步分析。通过Southern杂交，确定Pgap-araBAD整合到C25的Idh内，因为pZB1862-ldhL-ara使用了DIG标记的ara和Idh探针。如图12(a)和(b)所示。使用TaqDNA聚合酶(Qiagen，Valencia，CA)PCR扩增地高辛(DIG)标记的ldh，ara和tnp探针。DIG-UTP购自Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN。tnp探针用来筛选IS10R，其为Tn10的转座酶基因。ldh，ara和tnp的PCR产物分别为1，1.4和0.8kb。使用以下引物序列DIG-ldh5’-TCGCGGATCCGTCTATGCGCGCGTCGCAATATTCAGTTCC-3’(SEQ ID NO20)5’-TCGCGGATCCGTCGCTTGTCTATTAAACAAGCGCATCCGGC-3’(SEQ ID NO21)DIG-ara5’-CTAACATGTTGACTCCTTCTCTAGACTTAGCG-3’(SEQ ID NO22)5’-GTTGAAACCGCTGGGCACCACGC-3’(SEQ IDNO23)DIG-tnp5’-CGCACTACACGGTCGTTCTGTTAC-3’(SEQ IDNO24)5’-GGTTGCAGCCACGAGTAAGTCTTC-3’(SEQ IDNO25)
从印迹中可以看出，pZB1862-ldhL-ara只有一个PstI位点，并且定位于Pgap-araBAD。因此，使用ara探针，从PstI消化的质粒可以预计到一条12.9kb的杂交条带。随着Pgap-araBAD整合到基因组中，可以预计到两条带，分别由Pgap-araBAD的PstI位点和定位于Pgap-araBAD外侧的基因组附属PstI位点产生。图13(a)的结果清楚的显示了制备的总DNA与ara探针杂交所形成的两条带，表明了Pgap-araBAD的整合。发酵单胞菌整合体的质粒DNA没有杂交条带说明整合发生于基因组内而不是天然质粒中。为了显示由于Pgap-araBAD整合而使Idh断开，转移相同的DNA并与ldh探针杂交。和预计的一样，整合体的两个杂交图谱印迹都相同，除了C25以外，如图12(b)所示。C25是Pgap-araBAD整合的宿主菌株，其总DNA中有完整的ldh，其只显示了一条带。这一结果确定了araBAD是整合到C25的ldh中。
图13(a)和(b)显示了用DIG标记的Tnp和ara探针对八个Pgap-araBAD转座子的Southern杂交，这八个转座子是通过Tn10转座产生的。用PstI限制性酶消化DNA。PstI将Tn10G切割成两个片断，与ara探针杂交。通过印迹分析，只有G8、G11、G15和GH17是ara阳性和tnp阴性的。不同的图谱表明Pgap-araBAD整合到基因组的不同位置。虽然不希望转座酶基因留在整合体基因组内，上述八个菌株之外的四个菌株(G5、G6、G14和G19)仍然含有转座酶基因。此外，G14和G19含有的转座酶基因在质粒上。使用ara探针，预计通过整合体可看到两条带，然而只观察到一条带。为了进一步明确，以ara作为引物，对整合体进行PCR操作，结果证明，所有八个整合体的基因组内都含有Pgap-araBAD。
根据Zhang等人，1995和Deanda等人，1996描述的方法并稍作变化，使用运动发酵单胞菌整合体和控制菌株的无细胞提取物对木糖异构酶(XI)、木酮糖激酶(XK)、L-阿拉伯糖异构酶(L-AI)、L-核酮糖激酶(L-RK)、L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶(L-Repi)、转酮酶(TKT)和转醛酶(TAL)进行分析。收集处于对数生长后期(30℃，OD600大约1.2)的培养物，超声缓冲液(10mMTris-HCl，pH7.6，10mM MgCl2)洗涤一次，然后进行超声处理，从而制备无细胞提取物。通过离心(14,000rpm，45min 4℃)除去细胞碎片。在L-AI分析中，定时样品的体积按比例减少一半(50μl)，加入70％H2SO4和0.12％咔唑(50μl)。在70％H2SO4加入之前和加入之后，所有的试管都保温在25℃的水浴中，然后读取吸光度。分别在反应0、5、10和20分钟时取出样品。无论是通过同源重组还是转座子整合得到的整合体都能在D-木糖和L-阿拉伯糖上生长。通过测量酶活性来确定整合基因的表达水平。选择C25/AX1，C25/AX101和C25/G8用来进行酶分析，因为它们是最稳定的整合体，这是通过下面的稳定性分析确定的。酶分析的结果总结于图14和15。在所有的分析中(无论是否有木酮糖激酶)，与控制菌株(C25和/或206C)相比，整合体都表现出活性。在大多数分析中(不包括L-核酮糖激酶和木糖异构酶)，整合体比包含质粒菌株(206C/pZB301)的活性低。这可能与基因的拷贝数有关。
为了作稳定性分析，培养物被接种到含有RMG的试管中，30℃下过夜培养，并转移到RMG试管中，每天一次。对接种物进行控制，使得每10代转移一次。每过40代，将细胞接种于含有各类糖的混合物的摇瓶中，30℃，不控制pH，检测细胞对糖类的发酵能力。间歇发酵分析在Bio-StatQR恒化器中进行，30℃并控制pH，以500ml作为工作体积。用2N NaOH自动控制pH。每一批次的初始糖浓度和pH有所差别，取决于培养条件。所有使用的糖均为试剂纯。发酵过程中定时取样，通过HPLC分析糖、乙醇和副产物，方法如前所述(Zhang 1995)。测量600nm时的光密度(OD600)，以监测细胞的生长情况。乙醇产量以可利用的总糖量为基础。
用同源重组和转座的方法获得一些基因组整合的发酵木糖和阿拉伯糖的运动发酵单胞菌菌株，分析其在非选择性培养基(RMG)中的稳定性。这些菌株培养在RMG培养基中并依次进行转移，每天一次，大约经过了10代。每40代以后，将细胞接种到含有1％葡萄糖和2％木糖以及2％阿拉伯糖的摇瓶中，检测其发酵木糖和阿拉伯糖生成乙醇的能力。乙醇产量、木糖和阿拉伯糖的利用速率作为菌株稳定性的标志。有两个分离株在160代时仍然保持稳定性。参见图16和17。对三个整合菌株和一个包含质粒菌株的发酵过程作进一步检测，培养基含有4％葡萄糖、4％木糖和2％阿拉伯糖的混合物，pH5.5，温度为30℃。如图18所示，所有三株菌在72小时内都利用了葡萄糖、木糖和阿拉伯糖，而包含质粒菌株仍然残留了6g/L的阿拉伯糖。不过，整合菌株产生的木糖醇要比包含质粒菌株多，分别为4g/l和1g/L。两个同源重组AX1和AX101菌株不产生乳酸，因为在基因整合过程中乳酸脱氢酶基因失活。整合菌株的产量(理论值大约83％)与包含质粒菌株非常接近。而且，整合菌株生长后具有更大的细胞密度，这反映了由于七种基因的单拷贝数，菌株的代谢负担减小。
实施例4以下实施例描述了通过同源重组将PgapxylAB整合到运动发酵单胞菌31821-5C的ldh中。前面已经表明，运动发酵单胞菌31821对高含量的糖类进料、高温和醋酸具有增加的耐受力。因此，对于四种利用木糖的基因(tal，tkt，xylA和xylB)而言，运动发酵单胞菌31821是非常优良的用来整合的目标菌株。然而，通常的大肠杆菌宿主的DNA很难转化菌株31821。该菌株表现出种独特的基因特性，即限制甲基化宿主的DNA。已有的方法即使用小Tn5Tc以大肠杆菌Sm10(λpir)作为供体菌株的转接在31821-5C中不起作用。因此尝试了不同的整合方法。小Tn5和小Tn10系统并不适用，因为缺少甲基化缺陷型大肠杆菌，而这又是31821菌株中转座质粒转接所必需的。做了两个尝试，将小Tn5(在插入序列之间含有Tcr基因)接合入31821-5C内，没有获得转接合子。考虑到像Tcr这样的小片段(1.5kb)通过小Tn5转座都不能接合并整合到31821-5C的基因组中，那么更大的片段例如PgapxylABTc或者PenotaltktCm的整合或许也不可行。因此采用了一种基于转化而不是接合到宿主中的转座方法(使用了EZ∷TN插入试剂盒，见下)，并提供了更大的用于同源重组的同源区域，因为菌株31821的重组效率低。
通过多次努力，使用EZ∷TN试剂盒将所有四种基因(排列在两个操纵子——PgapxylAB和Penotaltkt内)整合到31821的基因组中，但都不成功。这是由于两个潜在的问题。第一，插入序列的长度对于整合到基因组而言太大；第二，在木糖培养上直接筛选不能使基因能够及时表达从而使整合体得以生长。为了克服这些问题，必须设计不同的方法使基因整合到31821中。与所有四种基因整合不同，同一时间只整合两种基因(采用一个操纵子PgapxylAB或Penotaltkt)。两个操纵子依次整合到同一个宿主中。每个操纵子连接一个抗生素标记(Tcr或者Cmr)用于整合体的初始筛选。通过这一方法，利用抗生素抗性就可以筛选整合体。两次整合方法用于木糖利用基因整合到31821-5C中(同源重组和转座)。使用2kb的包括ldh的同源区域(即ldhL)将Tcr基因整合到31821-5C的ldh内。在将PenotaltktTc片段整合到2kb的ldh基因座的两次尝试中，花费了相当长的时间才获得整合体，因为有冗长的切割和富集过程(至少需要14天)。然而，含有PgapxylAB的质粒转化到整合体时，整合体不能在木糖上生长。使用ldh特异性引物并以整合体基因组DNA为模板，获得PCR片段，对其DNA序列进行分析。结果显示，在Penotaltkt操纵子中并没有引入突变。有两个问题要考察。第一，taltkt基因的定位与pgm基因相反，pgm基因在基因组中紧接ldh并在其上游。Pgm基因具有很强的启动子，它可能会抵消taltkt的表达。第二，在发酵单胞菌中，Peno是相对较弱的启动子。Penotaltkt在整合体中的单拷贝对于基因的表达是不够的。所以尝试通过转座来整合Penotaltkt(因为ldh位点带来了上游强启动子的问题)以及利用同源重组来实现PgapxylAB的整合。更重要的是，整合所需的同源区域被扩大至超过2kb ldhL区域从而提高了重组的效率。新的同源区域延伸至包括了ldh的侧接区域(pgm和adhI基因)。总的同源区大小约为4kb(称为ldhL4)。
为了将PgapxylAB操纵子整合到31821的基因组内，以复制质粒pZB1861为基础，构建了pZB510XTc和pZB512XTc(参见图19A和19B)，和两个更相似的质粒pZB511XTc和pZB513XTc，其中基因的构建方式不同。通过两次PCR反应，产生同源片段ldhL4，包括5’和3’片段。PCR产生的片段5’ldhL4(1.9kb)和3’ldhL4(2.4kb)随后插入到穿梭载体pZB1861的BamHI-XbaI位点和BamHI位点。在PCR过程中，NotI和SfiI限制性位点被引入5’ldhL4和3’ldhL4之间。插入PgapxylAB(来自pZB4)和Tcr(PCR产物)到NotI和SfiI位点从而构建整合质粒pZB510xTc。质粒pZB512XTc的构建方法相似，只是PgapXylAB的定位与pZB510XTc中的相反。
使用电穿孔将质粒导入菌株31821-5C。质粒pZB510XTc、pZB512XTc、pZB511XTc和pZB513XTc被用来转化31821-5C。经过数次尝试，pZB510XTc和pZB512XTc的转化获得成功。pZB511XTc和pZB513XTc却没有实现转化。
整合组件包含Tcr标记，其用于整合体的筛选。不过Cmr却位于质粒中该组件之外。筛选TcrCmr转化体并在Tc存在的条件下培养，每天转移2到4次。在转化体繁殖过程中，PgapxylABTc通过同源重组整合到宿主的ldh内。消除质粒，使整合体富集并进行分离。将转化体在抗生素缺乏的条件下37℃亚培养7到14天，每天转移一次，从而实现质粒的消除。持续检测每一次转移的培养物中质粒的消除情况。经过三次转移后，大于99％的细胞都变为Cms，说明质粒已经消除。使第三次、第四次、第五次和第六次转移的培养物30℃下接种到RMGTc，使潜在的PgapxylAB整合体富集生长。富集的培养物接种到RMGTc平板上，复制挑选到RMGCm和PMGTc平板上。整合体(TcrCms)与野生型(TcsCms)和包含质粒(TcrCmr)细胞有明显的不同，因为其具有抗生素抗性的表型。分离可能的PgapxylAB整合体并作进一步分析。将来自整合体的质粒DNA后转移到大肠杆菌DH5a从而除去包含质粒菌株。分别使用Tc、xylAB和Cmr引物对对克隆进行PCR分析，以测定整合体的基因型。四个分离株x4i、x6i、x9i和x10i证实为整合体，因为在后转化中没有得到转化体，并且PCR结果显示出xylAB和Tc条带而没有Cmr条带。用发酵单胞菌复制质粒pZB192转化PgapxylAB整合体(x4i、x6i、x9i和x10i)，该质粒携带了Penotaltkt而不是PgapxylAB。转化体能够在RMX上生长，说明当tal和tkt基因以多拷贝数提供到质粒上时，单拷贝数的整合的PgapxylAB为木糖的利用提供了足够的木糖异构酶和木酮糖激酶活性。这一结果也保证了我们可以进一步将Penotaltkt整合到PgapxylAB整合体中，从而构建完全的木糖发酵整合菌株31821(见实施例6)。
实施例5以下实施例描述了通过转座将Penotaltkt整合到运动发酵单胞菌31821-5C的基因组中。小Tn5和小Tn10都不适合31821，因为缺少用于接合的甲基化缺陷型供体宿主。因此采用一种新的转座方法(EZ∷TN插入试剂盒)。当电穿孔进入细胞以后，转座酶连接到PenotaltktCm侧接的Mosaic末端并对片段进行切割，同时仍然与末端连接。在细胞内，转座酶引发DNA片段转座到宿主的基因组内。整合质粒pMODPenotaltktCm(见图20)是发酵单胞菌内的非复制型质粒，通过甲基化缺陷型大肠杆菌宿主制备得到。细胞被电穿孔后接种到MMGCm平板上。Cmr转化体就应是整合体。通过这种转座方法得到的三个Cmr整合体在这里分别称为int1、int2和int3。使用tal或者Cm的引物进行PCR筛选可以进一步确认整合体。或者使质粒从整合体后转化到大肠杆菌以确定PenotaltktCmr没有在质粒pMOD上，这样也可以确认整合体。用质粒pZB188-xyl转化整合体，该质粒携带PgapxylAB(而不是Penotaltkt)。电穿孔细胞直接接种到MMX平板上。在这一互补实验中，没有得到转化体。Penotaltkt的单一拷贝数不能够提供足够的用于在木糖平板上初始生长的转醛酶和转酮酶活性。发酵单胞菌的强启动子如Ppdc(丙酮酸脱羧酶基因)和Pgap(甘油醛磷酸脱氢酶基因)可以弥补低拷贝数对taltkt表达的影响。
实施例6以下实施例描述了Penotaltkt/PgapxylAB整合体的构建。尝试将四种木糖利用基因整合，然而无论是采用转座还是同源重组都没获得成功。因为当木糖同化基因提供到质粒上时，单一拷贝数的Penotaltkt整合到31821-5C的基因组不能使菌株在木糖上生长。申请人通过在体外将pMODPenotaltktCm转座到菌株31821的天然质粒上，从而提高整合Penotaltkt的拷贝数。转座后的天然质粒通过电穿孔进入PgapxylAB整合体x9i。用TcrCmr筛选，最终得到的整合体称为x9t(enott)Pi。从整合体分离出的质粒用于运动发酵单胞菌31821-5C和大肠杆菌DH5a的后转化。结果得到了运动发酵单胞菌的后转化体，而大肠杆菌则没有。这表明基因整合到x9i的天然质粒中。另一个方法是，从大肠杆菌DM1制备含有PgapxylABTcr的整合质粒pZB510XTc和pZB512XTc并转化到int2中。经过多次电穿孔，最终获得TcrCmr转化体。对转化体进行如前所述的质粒消化和富集处理。对上述两种方法制备得到的整合体进行检测，让其生长在含有木糖的培养基中(RMX)。可以观察到有整合体在RMX上生长，但数量极少。经过在PMX中的一系列适应以后(参见下面实施例)，每个整合组有两个整合体(x9t(enott)Pi#4和#8；int2/321和int2/1821)在RMX中表现出相对更好的生长情况，对其作进一步分析。对得到的潜在的Penotaltkt/PgapxylAB整合体进行Southern杂交分析以确定目标DNA的存在。从这些整合体制备总DNA和质粒DNA，用SphI消化得到xylB探针，以进行杂交。预计质粒pZB512XTc(作为对照)有两条带，5.4和2.5kb，其中2.5kb的带与整合体x9t(enott)Pi#4，#8和int2/321的总DNA是共有的。预计质粒pZB510XTc有两条带，4.2和3.7kb，其中3.7kb的带与整合体int2/1821的总DNA是共有的。所有的整合体都以x9i为基础，其中PgapxylAB整合到基因组的LDH基因座上。
所有的整合体都有一条与其整合质粒共同的条带，而第二条带则与预计质粒产生的条带不同。所有的整合体含有总DNApreps中的带而不是质粒DNApreps中的，这说明PgapxylAB整合到ATCC31821染色体中而不是天然质粒中。在与tkt探针杂交中，从这些整合体制备的总DNA和质粒DNA用BssHII消化(图21B)。预计质粒pMODPenotaltktCm(作为对照)有4条带包括4.2，1.5，0.9和0.1k，其中1.5和0.9kb带是与所有整合体的总DNA所共有的。0.1kb的带由于太小，所以保留在凝胶上。如图21B所示，x9t(enott)Pi#4和#8所包含的1.5和0.9kb的带存在于总DNA和质粒DNApreps中，从而证实Penotaltkt整合到天然质粒中。#4和#8的印迹显示缺失第三条带，可能是由于太小从而留在凝胶上。根据图谱(见图20)可以看到，这条带只有0.4kb大小。除了两条共有带以外，int2/321和int2/1821还具有一条6.4kb的带，其与质粒的不同，说明Penotaltkt整合到这两个整合体的染色体中。
实施例7以下实施例描述了整合发酵单胞菌的酶活性。分别将第5次(对于x9(enott)Pi#4和#8)和第4次(对于int2/321和int2/1821)转移的培养物从RMX接种到RMG，生长16小时后，再接种到新鲜的RMG上。在OD600＝1.0时收集生长在RMG上的细胞进行分析。结果如图22所示。
以31821-5C为基础的菌株int2，是染色体整合Penotaltkt的菌株；31821-5C/pZB112，是在穿梭质粒(衍生自pZB1861)上含有Penotaltkt的包含质粒菌株；以及宿主菌株31821-5C，都作为对照物包括在TAL和TKT分析中。对所有的整合体和对照菌株进行木糖异构酶、木酮糖激酶、转醛酶和转酮酶的酶分析。和预计的一样，菌株31821-5C/pZB112显示出很高的转醛酶和转酮酶活性。从整合体中观察到不同的酶水平。而且，即使采用相似的整合方法得到的整合体中所观察到的酶水平也是不同的。在所有的分析中，菌株x9t(enott)Pi#4表现出最高的活性，int2/321次之。这些菌株在RMX中生长得更好(参见图23)。值得注意的是，天然质粒整合菌株(x9t(enott)Pi#4和#8)并非必然就具有较高的TAL、TKT活性。
实施例8以下实施例描述了运动发酵单胞菌38121-5CPenotaltkt/PgapxylAB整合体在RMX上经过一系列适应以后，能够将D-木糖发酵生成乙醇。整合体接种到RMX(含有2％木糖)试管里，并用石蜡膜密封以防止蒸发。采用OD600测量方法对生长情况进行监测。将处于对数生长期的培养物转移到新鲜的RMX中。如图23所示，对第1次和第4次转移的生长曲线作了比较。
经过一段适应时期后，生长速率和最终OD600读数都提高了。最后的OD从0.08(第1次转移)提高到0.6(第4次转移)。经过50次转移后，生长速率和最大OD读数都趋于稳定。可以肯定的是，在适应过程中培养物发生了突变。RMX为具有更有效的木糖利用能力的突变株提供了自然选择。在四种分析的整合体中，x9t(enott)Pi#4和int2/321表现出最高的生长速率和ODs。在140小时时间点，从第4次/第3次转移的培养物中取样进行HPLC分析。如表1所示，木糖的初始浓度为20g/L，经过利用之后变为4-14g/L，并生成了显著水平的乙醇，这说明运动发酵单胞菌31821-5C Penotaltkt/PgapxylAB整合体能够发酵D-木糖生成乙醇。
表1RMX中运动发酵单胞菌31821 Penotaltkt/PgapxylAB整合体于140小时的HPLC分析
实施例9本实施例描述了pMODPgaptaltktCm的构建用于转座到运动发酵单胞菌中。构建pMODPenotaltktCm的方法与之相似，除了引入两个loxP位点。通过BglII/XbaI消化从pUCtaltkt中分离出2.2kb的tkt片段并克隆至pMOD载体，用BamHI/XbaI消化，产生pMODtkt。使GAP(甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因)的发酵单胞菌启动子区域融合到tal的结构基因从而产生PCR片段Pgaptal。用XbaI消化这一片段并克隆到质粒pMODtkt中。最后，含有侧接Cmr(CmloxP)的两段loxP序列(Palmeros等人，2000，Gene247255-264)的PCR片段被插入到质粒的SfiI位点以形成整合质粒pMODPgaptaltktCm(图24)。侧接Cmr的loxP序列可以作为噬菌体Cre重组酶的结合靶，必要时，它可以将Cmr从整合体基因组中去除。类似的，这一方法可用于Tc抗性基因的去环。具有去除抗生素抗性基因的能力是很有利的。为了实现这一目的，申请人引入了loxP/cre系统。用于上述构建的PCR的寡核苷酸序列如下1.Pgap(0.3kb)模板pZB4引物PgapXbSfi(F)5’CAGTCTAGAGGCCGCCTAGGCCGTTCGATCAACAACCCGAATCC3’(SEQ ID NO26)3’Pgap5’tal(R)5’CAATTTGTCCGTCATGTTTATTCTCCTAAC3’(SEQ ID NO27)2.tal(1kb)模板pZB4引物3’Pgap5’tal(F)5’GTTAGGAGAATAAACATGACGGACAAATTG3’(SEQ ID NO28)talXb(R)5’CCAGATCGTCTAGATTACAGCAGATCGCC3’(SEQ ID NO29)3.Pgaptal(1.3kb)模板Pgap和tal
引物PgapXbSfi(F)5’CAGTCTAGAGGCCGCCTAGGCCGTTCGATCAACAACCCGAATCC3’(SEQ ID NO30)talXb(R)5’CCAGATCGTCTAGATTACAGCAGATCGCC3’(SEQ ID NO31)4.CmloxP(1.1kb)模板pZBl86Cmlox(F，sfi)5’CAGGGCCGCCTAGGCCATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATCCTGTGACGGAAGATCACTTCGC3’(SEQ ID NO32)Cmlox(R，sfi)5’CAGGGCCTAGGCGGCCATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCCTGAACCGACGACCGGGTCG3’(SEQID NO33)实施例10以下实施例描述了以运动发酵单胞菌31821-5C为基础的Pgaptaltkt/PgapxylAB整合体的构建。从大肠杆菌DM1或者JM110制备质粒pMODPgaptaltktCm，用EZ∷TN转座酶处理以制备转座子。通过电穿孔使转座子混合物进入PgapxylAB整合体，x9i。在RMGTcCm上筛选获得Pgaptaltkt/PgapxylAB整合体(Tc抗性基因已经整合到x9i的基因组中)。对来自整合体的质粒DNA进行初始分析，例如在大肠杆菌中进行后转化，以鉴别是真正的整合体还是包含质粒菌株。对几种整合体质粒DNA进行大肠杆菌后转化并去除假的整合体。潜在的TcrCmr整合体接种到以木糖为唯一碳源的RM上并在30℃下培养。在OD600进行测量以监测生长情况。所有的菌株初始OD0.3时都能在RMX上缓慢生长。不过，在RMX中经过6次转移后，生长速率和最终ODs都提高了。生长最好的两个菌株(#20，#21)的生长曲线如图25所示。
实施例11以下实施例描述了Penotaltkt/PgapxylAB和Pgaptaltkt/PgapxylAB发酵单胞菌整合体的分离过程。为了在混合体中分离出更好的生长菌株，对细胞在RMX平板上进行划线分离。菌株x9t(enott)Pi#4和x9t(enott)Pi#8在4次转移后划线；int2/xy1321和int2/xyl1821在3次转移后划线；#20和#21在6次转移后划线。上述一轮分离称为第1次分离。在RMX平板上观察到不同大小的克隆。挑选大的克隆并在RMX平板上划线(第2次分离)。挑选一些明显大的克隆并接种到RMX液体培养基中以进行生长分析。有四株菌在RMX上表现出良好的生长态势，将其挑选出来并作进一步研究，包括Southern杂交、发酵和酶分析。这四株菌分别名为321(5)(来源于int2/xyl321)、481(来源于x9tP(enott)Pi#4)、2032(来源于#20)和2122(来源于#21)。采用与实施例6相同的方法进行Southern杂交。如图26A(以xylB作为探针)和图26B(以tkt作为探针)所示，在质粒preps中缺少杂交条带，从而证实了整合的实现，除了图26B中的菌株481(来源于x9tP(enott)Pi#4)例外，它是特意将Penotaltkt整合到运动发酵单胞菌31821的天然质粒中构建得到。481和对照pMODPenotaltktCm在带型上的区别表明条带不是天然质粒的。相反，它们来自天然质粒中整合的PentaltktCm。在图26A中，和期望的一致，在pZB512xTc和所有四种整合体中观察到一个共同的2.5kb的条带。然而pZB512xTc和整合体的第二条带却存在区别，这说明xylAB整合到染色体中(推测是ldh基因)。2032中出现更高分子量的条带，这可能是因为基因组接近ldhL4区域的SphI位点自发的发生改变。在图26B中，pMODPenotaltktCm或者pMODPgaptaltkt和所有的整合体具有共同的1.5，0.9和0.1kb的条带。不同的条带证实了pMODPenotaltktCm或者pMODPgaptaltkt整合到31821-5C的基因组内。
使四种整合体，321(5)、481、2032和2122以及对照菌株，31821/pZB5(包含质粒菌株)、C25(基于39676的木糖发酵整合体)和31821-5C(宿主)进行初步发酵。发酵条件是培养瓶中是80mlRMX(2％木糖)或者RMGX(1％葡萄糖和2％木糖)，不控制pH，30℃静态发酵。对发酵肉汤的上清液进行HPLC分析，从而检测发酵情况。所有整合体都能在RMGX上生长，并发酵木糖和葡萄糖以最大产率生成乙醇(图27A，B和C)。所有整合体都能在RMX上生长，并发酵木糖以最大产率生成乙醇(图28A和B)。在两种培养基中，整合体和包含质粒对照菌株(31821/pZB5)和C25整合体(基于39676的木糖整合体)的乙醇生成图相似(图27C和28B)。和预计的一样，在RMGX培养基中，宿主菌株只能发酵葡萄糖生成乙醇(图27B)。
对四种整合体以及对照菌株，31821/pZB5(包含质粒菌株)、C25(基于39676的木糖发酵整合体)和31821-5C(宿主)进行酶分析，数据结果示于下表2。所有的整合体都表现出比31821/pZB5和C25更低的活性。
表2整合体的酶活性比活(μmol/min-mg蛋白)XI XK TAL TKT321(5)0.060.172.100.91481 0.040.232.270.742032 0.150.232.270.742122 0.040.191.560.51int2 0.020.021.190.31X9i 0.040.06ND 0.0331821/pZB50.060.552.521.78C25 0.200.813.781.9931821-5C 0.080.070.010.01ND未检测出实施例12以下实施例描述发酵单胞菌整合体的诱变过程从而提高其在木糖培养基中的生长能力。整合体int2/xy1321和x9t(Penott)Pi#8的单一克隆接种到RMG并在30℃下过夜培养。将生长的培养物接种到添加了5％葡萄糖的接合培养基(OD＝0.15～0.2)中并在30℃下培养至OD＝0.5～0.6。收集细胞，用25μg/ml的化学诱变剂1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍(MNNG或者NTG)对细胞进行处理。收集NTG处理过的细胞，在RMG中洗涤两次，重悬浮于RMGX(0.5％葡萄糖和1.5％木糖)中生长。生长的培养物在同样的培养基中亚培养两次，然后在RMX平板上划线。较大的克隆在RMX平板上再次划线。挑选最大的克隆并接种到RMX液体培养基中。生长的培养物于RMX平板再次划线分离。最后，挑选最大的克隆并使其生长于RMX中。最大的两个生长菌株分别称作8b和2/321-2。对其中一个菌株8b作进一步评价。通常情况下，在葡萄糖和木糖的混合物中，以及下面实施例所描述的醋酸盐存在的情况下，突变体具有更高的利用木糖的能力。
实施例13以下实施例描述了以运动发酵单胞菌ATCC31821-5C宿主为基础构建的几个整合体的发酵情况。菌株C25和包含质粒菌株31821/pZB作为发酵评价的对照菌株。
在工作体积为500ml的BioStat-Q发酵罐和控制pH及温度的条件下进行发酵评估。通过滴定KOH(2N)使pH控制在5.5，温度控制在30℃。发酵培养基RM包含葡萄糖和木糖的混合物(RMGX(1％∶6％)和RMGX(3.5％∶3.5％))。生长培养基的所有组分都通过无菌过滤母液分别制备，RM(10X)，葡萄糖(50％)，木糖(50％)。对发酵罐进行高压灭菌，并在无菌的条件下将生长培养基加入发酵罐中。在含有200mL培养基RMGX(2％∶2％)的250mL摇瓶中制备接种物。过夜生长后，将培养物离心并在与发酵培养基相似的10L培养基中浓缩。计算600nm下OD为0.1时开始发酵所需要的培养物的体积并接种到发酵罐中。根据需要以一定的时间间隔从发酵罐中取样。通过HPLC分析样品中糖、乙醇以及副产物的量。
在控制pH的发酵中，所有的菌株都能够发酵葡萄糖和木糖生成乙醇，其中菌株8b和2032表现出最好的发酵能力(图29和30)。整合菌株8b和2032显示出与包含质粒菌株31821/pZB5和以宿主39676为基础的整合体C25相似的能力。
实施例14以下实施例描述了发酵单胞菌整合体的稳定性。将培养物在非选择性培养基(RMG)中转移数次，使用含有10mL培养基的15mL的Falcon无菌试管作为进行测试(见图31)。这些菌株培养于RMG培养基中，经过10代以后每天依次进行转移。每过40代，将细胞接种到含有2％葡萄糖和2％木糖的摇瓶中，以检测其发酵葡萄糖和木糖生成乙醇的能力。乙醇产率和木糖利用速率作为稳定性的标志。在温度为30℃和37℃下，无须选择，所有的整合体至少在140-160代时都能保持稳定(图32和33)。而包含质粒菌株31821/pZB5在温度为30℃和37℃下，在40代内就丧失了利用木糖的能力(37℃时的数据示于图33)。
实施例15以下实施例描述了醋酸浓度对生长和AX101木糖发酵的影响以及pH的影响作用。醋酸通常存在于预处理的生物饲料的水解产物中，对发酵微生物有抑制作用。在pH5、pH5.5和pH6.0时进行发酵，添加或不添加(pH5.5)2g/L的醋酸盐从而对菌株AX101的发酵能力进行评价。使用的培养基是RMGXA(4％∶4％∶2％)，并添加所需浓度的醋酸盐。结果(图34)表明，2g/L的醋酸盐对菌株的生长、木糖的利用和乙醇的产生都有抑制作用。与较高pH(pH6.0)相比，pH较低时(pH5.0)，抑制作用更加明显。
实施例16以下实施例描述了AX发酵的添加和提取过程。设计一种测试方法，看菌株AX101对醋酸盐的逐步适应能否提高该菌株在高浓度醋酸盐的培养基中的发酵能力。首先，在pH5.5、温度为30℃时于RMGXA(4％∶4％∶2％)进行间歇发酵，在没有醋酸盐和醋酸盐为2g/L时进行比较。由于低水平2g/L的醋酸盐影响糖的利用，因此进行另一项测试，将含有RMGXA(4％∶4％∶2％)并分别添加了0.5g/L和1g/L的醋酸盐的发酵罐接种到另一个添加了2g/L醋酸盐的发酵罐，其糖浓度相同。结果表明菌株AX101在2g/L醋酸盐中的糖的利用能力并没有提高。
实施例17以下实施例描述了AX101的连续发酵。连续发酵在MultiGen发酵罐(NewBruswick Scientific，NJ，USA)中进行，工作体积为300mL，搅拌器转速300rpm。分析所取的pHs为4.5，5和5.5，采用KOH(2N)来控制。温度始终保持为30℃。间歇发酵开始时，起始OD在600nm时为0.1。在发酵过程中，每个周期取一次样，通过HPLC分析糖、乙醇和副产物的含量。当充分利用葡萄糖并且发酵罐中的木糖约为10g/L以后，开始连续发酵，添加一定糖组成的培养基，稀释速率(D)低，为0.02(1/hr)。经过4至5个稳定状态的循环后，所有的葡萄糖和80％的木糖都被利用，此时提高稀释速率(图35)。这一过程一直持续到洗出阶段，通过残留的木糖浓度升高和乙醇浓度减少显示出来。用最终乙醇生成的浓度除以最初加入到培养基中的总糖量计算出乙醇产率(Yp)。
菌株AX101能够在玉米浆培养基中发酵80g/L葡萄糖、40g/L木糖和15g/L阿拉伯糖的混合物，添加的醋酸盐只能达到6g/L，此后便观察到洗出阶段。
实施例18以下实施例描述了在高浓度醋酸盐存在的情况下能够发酵葡萄糖和木糖生成乙醇的整合体。醋酸盐是一种抑制性化合物，通常发现于预处理的生物饲料的水解产物中。
在有35mL培养基的50mL带挡板的摇瓶中进行评价，培养基包含添加了不同浓度醋酸盐的RMGX(2％∶2％)。醋酸盐添加到培养基RMGX中，用KOH颗粒将pH调解到5.8。在含有100mL培养基RMGX(2％∶2％)的125mL摇瓶中制备接种物，起始pH为5.8，温度为30℃或37℃。
过夜生长后测量600nm时的OD，600nm下OD为0.1时对每个摇瓶进行接种，并在所需的温度下于摇床中培养。在不同时间取样然后用HPLC分析糖、乙醇和副产物的含量。如图36所示，整合体8b和2032能够在不控制pH以及培养基中醋酸盐浓度为2g/L至6g/L时生长并且发酵木糖生成乙醇。在这些浓度下的醋酸盐对木糖利用的抑制作用是最小的。
如图37所示，甚至在醋酸盐浓度为16g/L和未对培养基的pH进行控制时，所有的整合体都能发酵葡萄糖和木糖生成乙醇。测量出生长培养基的最终pHs为3.5-4.5之间。前述以39676宿主为基础构建的菌株如AX101和C25却受到低浓度如2g/L的醋酸强烈的抑制作用。
实施例19以下实施例描述了在发酵单胞菌丙酮酸脱羧酶(PDC)启动子Ppdc的控制下，可以使含有大肠杆菌磷酸甘露糖异构酶基因ManA的质粒pZB701(图38)转化运动发酵单胞菌菌株39676和31821。
如图39所示，两种菌株的转化体都能够利用D-甘露糖作为唯一碳源。为了确定ManA得到表达，所有产生的中间构建体和最后构建体(包括pZB801)都用来转化manA(-)宿主，大肠杆菌GMS407。转化体接种到以甘露糖为碳源的McConkey琼脂平板上。深粉红色菌落表明甘露糖被克隆子利用。从深粉红色菌落提取的质粒pZB701用来进一步转化运动发酵单胞菌206C或者31821。在含有四环素(Tcr)的结合培养基(MMG)上筛选运动发酵单胞菌转化体然后在含有甘露糖(RMM)的培养基中检测。如图39所示，所有转化体初始都能在RMM中生长，经过在RMM中的几次转移后，其生长速率提高。
从大肠杆菌JM110制备pZB701用于运动发酵单胞菌31821的转化。这些Tcr转化体也能在RMM中生长。对RMM生长培养物的上清液进行分析，结果表明，39676和31821转化体都能产生乙醇。
含有甘露糖利用基因的质粒pZB701可以进一步转化申请人构建的基因组整合的木糖发酵和阿拉伯糖发酵菌株，例如以39676和31821宿主菌株为基础的C25，AX101，AX1，321(5)，481，8b，2032，2122。已经证实了pZB701(含有ManA基因)成功转化到运动发酵单胞菌39676和31821中，转化体发酵甘露糖生成乙醇。上述发酵单胞菌整合体可以被质粒pZB701转化从而获得能够发酵木糖、阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖生成乙醇的运动发酵胞菌菌株。预计转化的发酵单胞菌菌株能够利用生物饲料中的木糖、阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖并且能够发酵以上所有糖生成乙醇。
虽然通过实施例来描述本发明，但应该理解，在不背离本发明实质精神和范围的情况下可以作任意修改。
权利要求
1.一种利用基因修饰的发酵单胞菌整合体从戊糖生产乙醇的方法，所述方法包括制备含有编码一种以上戊糖发酵酶的序列的发酵单胞菌整合体，所述戊糖发酵酶包括木糖异构酶，木酮糖激酶，转酮酶和转醛酶；在适当的发酵条件下，将整合体发酵单胞菌加入到含有戊糖的原料中；以及发酵戊糖从而提供包括乙醇的混合物，所述编码戊糖发酵酶的序列是通过第一步整合和第二步整合结合到所述整合体发酵单胞菌中的。
2.如权利要求1所述的方法，其中第一步整合是转座，第二步整合是同源重组。
3.如权利要求2所述的方法，其中第一步整合包括含有编码一种以上戊糖发酵酶序列的第一操纵子的转座整合。
4.如权利要求3所述的方法，其中第一操纵子包括编码转醛酶和转酮酶的序列。
5.如权利要求3所述的方法，其中第一操纵子进一步包括Penotaltkt或者Pgaptaltkt。
6.如权利要求2所述的方法，其中第二步整合包括含有编码一种以上戊糖发酵酶序列的第二操纵子的同源重组。
7.如权利要求6所述的方法，其中第二操纵子进一步包括PgapxylAB。
8.如权利要求6所述的方法，其中第二操纵子包括编码木糖异构酶和木酮糖激酶的序列。
9.如权利要求1所述的方法，其中发酵单胞菌整合体是ATCC31821-5C Penotaltkt/PgapxylAB。
10.如权利要求1所述的方法，其中发酵单胞菌整合体是ATCC31821-5C Pgaptaltkt/PgapxylAB。
11.如权利要求1所述的方法，其中第一步整合包括同源重组并且第二步整合包括转座方法。
12.一种制备能够发酵含有戊糖的原料并生成乙醇的发酵单胞菌整合体的方法，所述方法包括对天然发酵单胞菌菌株实施第一步整合以结合含有编码戊糖发酵酶的序列的第一操纵子，从而提供发酵单胞菌部分整合体；对发酵单胞菌部分整合体实施第二步整合以结合第二操纵子，所述第二操纵子含有编码除第一操纵子的酶之外的一种以上的戊糖发酵酶的序列，从而提供能够发酵含有戊糖的原料并生成乙醇的发酵单胞菌整合体。
13.如权利要求12所述的方法，其中发酵单胞菌整合体含有编码至少四种戊糖发酵酶的序列，所述戊糖发酵酶包括木糖异构酶、木酮糖激酶、转酮酶和转醛酶。
14.如权利要求12所述的方法，其中第一操纵子进一步包括PgapxylAB。
15.如权利要求12所述的方法，其中第二操纵子进一步包括Penotaltkt或者Pgaptaltkt。
16.根据权利要求12的方法制备的能够发酵戊糖的发酵单胞菌整合体。
17.如权利要求12所述的方法，其中发酵单胞菌整合体是ATCC31821-5C Penotaltkt/PgapxylAB。
18.如权利要求12所述的方法，其中发酵单胞菌整合体是ATCC31821-5C Pgaptaltkt/PgapxylAB。
19.一种发酵单胞菌整合体，其能在每升培养基含有8克醋酸盐/醋酸的条件下生长。
20.一种用于戊糖发酵的生物催化剂，其含有权利要求16的发酵单胞菌整合体。
21.一种能够发酵戊糖生成乙醇的发酵单胞菌整合体，其染色体或天然质粒整合了编码一种以上戊糖发酵酶的序列，其中所述整合体至少稳定80代。
22.如权利要求21所述的发酵单胞菌整合体，进一步能在醋酸盐存在时发酵戊糖生成乙醇。
23.如权利要求22所述的发酵单胞菌整合体，进一步能在每升培养基含有8克醋酸盐/醋酸的条件下发酵戊糖。
24.如权利要求21所述的发酵单胞菌整合体，进一步包括编码甘露糖发酵酶的序列。
25.发酵单胞菌整合体Z.Mobilis 8b。
26.发酵单胞菌整合体Z.Mobilis 2032。
全文摘要
一种能够发酵戊糖生成乙醇的发酵单胞菌整合体。通过两步整合方法即同源重组和转座将编码戊糖发酵酶的操纵子整合入发酵单胞菌的基因组内。每种操纵子可以包括一种以上戊糖还原酶的编码序列。在一些实施例中，整合体包括编码木糖异构酶、木酮糖激酶、转酮酶和转醛酶的序列。发酵单胞菌整合体高度稳定，在80－160代时仍保留产生戊糖发酵酶的活性。整合体还对醋酸盐的抑制作用具有抗性，即使在每升培养基含有8克醋酸盐的条件下，整合体仍然表现出足够的生产乙醇的能力。
文档编号C12N1/21GK1665919SQ03815229
公开日2005年9月7日 申请日期2003年4月25日 优先权日2002年4月27日
发明者张敏, 周逸珍, 威廉·豪, 克里斯廷·埃迪, 肯特·埃文斯 申请人:米德韦斯特研究院