酶催化高浓度3-羟基丙腈水解制备3-羟基丙酸的新方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物催化制备生物可降解材料单体和绿色化学领域，涉及利用腈水解 酶基因工程菌、培养物、或者加工制品催化高浓度3-羟基丙腈水解制备3-羟基丙酸的方法。
【背景技术】
[0002] 3-羟基丙酸(3-HP)是近年来兴起的一种重要化学中间体，它具有羟基和羧基两种 官能团，是很多光学活性物质的前体，2004年美国能源部将3-HP列为当今世界12种最具开 发潜力的化工产品之一。3-HP可应用于生产1，3_丙二醇、丙二酸、丙烯酸及特种聚酯材料 等;它本身是一种无耐药性的植物性细胞毒素，具有选择性的杀线虫能力。由于其良好的玻 璃化转化温度及较高的熔点（大于170°C)，聚3-羟基丙酸极有可能替代部分传统的聚合物 材料。此外，聚3-羟基丙酸具有很高的生物相容性及生物降解性，使其在外科手术及药物缓 释材料领域具备更大的应用潜力。
[0003] 目前文献报道的合成3-HP的方法主要有化学法与生物法两种。化学法主要包括3-羟基丙腈强碱水解法、丙烯酸水合法、1，3_丙二醛或3-羟基丙醛氧化法，由于存在产品不易 分离纯化，生产成本较高，环境污染严重等不利因素，限制了其大规模的应用。生物法和化 学法相比，由于具有成本低、操作简单、条件温和、副产物少、绿色环保等优点，备受人们的 青睐。生物法根据底物的不同主要分为两种类型:一种是以Cargill公司为代表的以葡萄糖 为底物的生物转化路线，该路线生成3-HP的产量已经达到25 g/L(W0200242418 A2，2004 年）；另一种是由Suthers等(US6852517 B1，2001年)所开发的以甘油为底物的转化路线， 该路线的最高产物浓度为71.9 g/L，时空产量为1.8 g L-l h-1 (Biotechnology and Bioengineering 2015，112，356-364)。虽然生物法具有很多优势，是未来的发展方向，但 是目前仍然存在着底物浓度与时空产量低等问题难以解决。
【发明内容】
[0004] 本发明中提供了一种产腈水解酶的基因工程菌，以及利用该酶或菌体制备3-羟基 丙酸的新方法(如化学方程式1)。
[0005] 化学方程式1合成路线 本发明中所述的产腈水解酶的基因工程菌，具体的构建方法是：对来源于土壤的 NIT190(AAR97489 (Alal90His))基因进行密码子优化后全合成相对应序列，并在基因两端 加上Nde I和BamH I酶切位点，并将合成的基因构建到相应表达载体中，然后表达载体转 化入受体菌，即分别得到所述的产腈水解酶的基因工程菌NIT190;并对基因工程菌进行发 酵培养，实现了腈水解酶的高效异源表达。
[0006] 本发明中所述产腈水解酶的基因工程菌所用到的载体系列包括:pET系列质粒、 pTXBl系列、pGEX系列、pETduet系列、pTYB系列。
[0007] 本发明中所述的产腈水解酶的基因工程菌，其特征在于所述的能高效表达外源基 因的宿主菌为下列之一:BL21系列、Rosetta系列、Origami系列、Tuner系列。
[0008] 在本发明中，由质粒转化宿主得到的转化体可以基于已知信息生长并产生本发明 所述的腈水解酶。任何一种人工的或天然的含有合适碳源、氮源、无机和其他营养物质的介 质，只要能满足宿主菌体的生长并且能够表达出目的蛋白均可使用。培养方法和培养条件 没有明确的限制，可以根据培养方法和类型等的不同而进行适当的选择，只要能满足宿主 生长并能产生相应活性的腈水解酶即可。
[0009] 用于制备3-羟基丙酸的腈水解酶可以是上述腈水解酶基因工程重组菌的培养物， 也可以是通过将培养基离心后得到的菌体细胞或其加工制品。其中加工制品指的是菌体得 到的提取物、破碎液、或者对提取物腈水解酶进行的分离和/或纯化得到的分离产品，或者 通过固定化提取物或者加工制品的固定化制品。
[0010] 本发明还涉及全细胞或固定化细胞转化合成3-羟基丙酸的方法，所述方法为： 将所述产腈水解酶的基因工程菌经种子培养基培养，按一定比例接种到发酵培养基， 培养一定时间后，加入诱导剂IPTG或乳糖或二者混合物诱导培养一定时间，离心收集菌体， 加入pH值为6.0~10.0的缓冲液，底物71~355 g/L，20~60 °C，200 rpm下转化2~24小 时，反应完全后经离心、酸化、萃取、脱溶后得到3-羟基丙酸。
[0011] 也可以通过常规固定化细胞的方法将收集的菌体细胞固定化。然后将3-羟基丙酸 的缓冲液溶液，在适当温度下反应，然后将上清液酸化、萃取、脱溶后得到3-羟基丙酸。
[0012] 反应中适用的介质可以是水或含有不同缓冲液的水介质，其所用的缓冲液可以是 水中加入一种或几种适当磷酸盐、Tris盐酸盐等。
[0013] 本发明所述的pH值优选能够保持在腈水解酶可以表达其活性的pH范围内，优选pH 值为6.0~10.0。反应温度优选保持在腈水解酶可以表达其活性的温度范围内，优选25~37 〇C。
[0014] 本发明所述的底物浓度没有限制，通常底物为71~497 g/L，考虑到反应效果，底 物浓度选大于等于213 g/L。同时为了提高生产效率，可以在反应时批次添加底物。反应产 物也可以在反应结束后分离或通过原位分离的方法不断的将产物移走。
[0015] 本发明所述的催化剂是静息细胞时，其用量为1~1〇〇 g/L;当使用的催化剂是固 定化细胞时，其用量为5~500 g/L;当催化剂是细胞提取物时，其用量为5~100 mg/L。
【附图说明】
[0016] 图1产物3-羟基丙酸的高效液相色谱图 图2产物3-羟基丙酸的1HNMR图 图3产物3-羟基丙酸的13CNMR图 图4静息细胞及其固定化后的批次反应图：静息细胞（)，海藻酸钙固定化细胞 (·)，GA/PEI交联细胞株在Tris-HCl (100 mmol L-l，pH 8.0)中反应（ΑΧΑ/ΡΕΙ交联 细胞株在纯水中反应（▼)
【具体实施方式】
[0017]以下通过具体的实施例来进一步说明，其目的在于更好的理解
【发明内容】
，但是这 些实施例不构成对本发明的限制。
[0018] 实施例1:高表达基因工程菌的获得 全基因合成由上海旭冠公司完成。
[0019] 根据腈水解酶NIT190(AAR97489 (Alal90His))，并对其进行密码子优化，以期使 该基因能够在大肠杆菌表达宿主中进行表达，序列见附表。并在基因两端加上Nde I和 BamH頂每切位点，构建到pET-32a( + )载体中，得到基因工程菌NIT190。
[0020] 将制备得到的重组载体用常规方法转化入大肠杆菌BL21、Rosetta或Origami以构 建重组腈水解酶以可溶形式存在于菌体内的基因工程菌，筛选出组建成功的基因工程菌， 其中以大肠杆菌BL21为宿主菌的重组菌目的蛋白表达相对较好。以目的蛋白表达量不低于 20%的工程菌，作为生产用工程菌菌种，并以甘油菌或牛奶冻干菌种形式保存。
[0021] 实施实例2基因工程菌的培养和静息细胞的制备 挑取平板上单菌落接种至4 ml含相应抗生素的发酵培养基中，培养6-8 h左右作为种 子液，按照1%的接种量接种至含800 ml的发酵培养基中，在37°C，200 rpm的摇床上培养至 0D_=0.8~1.2左右，加入终浓度为0.1 mM的IPTG进行诱导14 h以上，以8000 rpm离心培 养液收集菌体。
[0022]实施实例3利用静息细胞NIT190催化3-羟基丙腈单次水解 取0.2 g NIT190的