狂犬病病毒组合物和方法
【专利说明】
[0001 ] 本申请是国际申请日2006年10月13日、国际申请号PCT/US2006/040134于2008年4 月14日进入中国国家阶段、申请号200680038314.4、发明名称"狂犬病病毒组合物和方法" 的申请的分案申请。
[0002] 相关申请的参考
[0003] 本申请要求享有2005年10月14日提交的美国临时申请60/727,038的优先权，在此 完整引入作为参考。
[0004] 政府支持的声明
[0005] 本发明由美国政府机构，疾病控制和预防中心（Centers for Disease Control and Prevention)做出。因此，美国政府在本发明中享有确定的权利。
技术领域
[0006] 本公开涉及病毒学领域。更具体地，本公开涉及可用于保护哺乳动物免受狂犬病 病毒感染的组合物和用于生产免疫原性组合物的方法。
[0007] 发明背景
[0008] 狂犬病仍然是感染人类和动物的最可怕的传染性疾病之一，尽管在其预防和控制 方面已取得显著的科学进展。在世界不同地区，狂犬病表现为不同的问题。在美国，狂犬病 储存宿主存在于许多野生动物种类中，包括浣熊、臭鼬、狐狸和蝙蝠（Rupprecht等人， Emerg. Infect.Dis. 1(4): 107-114,1995)。在横跨美国的广大地理区域发现了狂犬病传染 在这些陆生哺乳动物中的爆发。例如，浣熊狂犬病影响从佛罗里达州到緬因州超过1百万平 方公里的区域。尽管发达国家仍然存在野生动物狂犬病，但利用野生动物的口服免疫在控 制和消除野生动物狂犬病方面已经取得进展。
[0009] 尽管如此，狂犬病仍然是对公共卫生的一种主要威胁，每年持续造成50，000至60， 000人死亡(世界卫生组织，2003年4月）。人类主要是通过被患有狂犬病的家养或者野生动 物咬伤而感染狂犬病病毒。在发展中国家，狗导致大约94%的人类狂犬病死亡。在非洲、亚 洲和南美洲的大多数国家狗，狂犬病仍然是动物流行性的，并且在这些国家中，狗导致该疾 病引起的大部分人类死亡。因此，控制家养和野生动物中的狂犬病病毒感染不仅降低这些 动物的死亡率而且降低人类接触的风险。
[0010] 狂犬病病毒通过被感染动物的咬伤或者抓伤造成的破裂皮肤传送。接触狂犬病病 毒导致其渗透入外周、无髓鞘的神经末梢，继而通过逆向轴突运输传播，复制只在神经元中 发生，并最后到达中枢神经系统（CNShCNS的感染造成细胞机能障碍和死亡(Ruppr eCht& Dietzschold，Lab Invest. 57:603，1987)。因为狂犬病病毒直接从细胞传播到细胞，它基本 上逃脱了免疫识别（Clark&Prabhakar，Rabies，In:01son等人，eds.，Comparative Pathology of Viral Disease,2:165,Boca Raton，FL，CRC Press，1985)〇
[0011] 狂犬病病毒(RV)是一种弹状病毒-一种具有阴性有义极性的非节段RNA病毒。在弹 状病毒科(Rhabdoviridae)家族中，狂犬病病毒是狂犬病毒(Lyssavirus)属的原型。RV由两 个主要结构成分构成:核衣壳或者核糖核蛋白（RNP)，和围绕RNP核的双层膜形式的被膜。所 有弹状病毒的感染性成分是RNP核，由负链RNA基因组组成，所述负链RNA基因组被核蛋白 (N)结合RNA依赖性RNA聚合酶(L)和磷蛋白（P)包装。环绕RNP的膜包含两种蛋白：跨膜糖蛋 白（G)和基质(M)蛋白，位于膜内部位置。因此，病毒基因组编码这5种蛋白：RNP中的3种蛋白 (N，L和P)，基质蛋白（M)，和糖蛋白（G)。
[0012] 不同狂犬病病毒株致病性的分子决定簇还没有被完全阐明。RV致病性归因于多基 因事件(Yamada等人，Microbio 1. Immunol. 50:25-32，2006)。例如，RV基因组中的一些位置 如果突变，则影响病毒转录或者复制，减轻毒性。N基因磷酸化位点的丝氨酸残基389处(Wu 等人，J. Virol. 76:4153-4161,2002)或者L基因高度保守的C模体的⑶N核心序列（Schnell 和Conzelmann，Virol · 214:522-530，1995)的突变，显著降低RV转录和复制。
[0013] G蛋白，还称为刺突蛋白，参与RV的细胞粘附和膜融合。已经鉴定G蛋白330到340位 的氨基酸区域(称为抗原部位III)对RV某些株的毒性重要。数个研究支持以下观点，即固定 RV株的致病性由糖蛋白氨基酸残基333处存在的精氨酸或者赖氨酸决定(Dietzschold等 人，Proc. Natl .Acad. Sci. USA 80 :70-74,1983; Tuffereau 等人，Virol · 172:206-212， 1989)〇
[0014] 这种现象似乎至少适用于固定的狂犬病病毒例如(^3 31^，？￥，340-819和!??-Flury株（Anilionis等人，Nature 294:275-278,1981 ;Morimoto等人，Virol · 173:465-477， 1989)。例如，具有不同于糖蛋白333位Arg的氨基酸的狂犬病疫苗病毒描述于，例如，W0 00/ 32755(描述RV突变体，其中与亲代病毒相比，G蛋白Arg333密码子的所有3种核苷酸都被改 变，因此333位Arg被另一种氨基酸取代）；欧洲专利350398(描述无毒力的RV突变体SAG1，来 自RV的Bern SAD株，其中糖蛋白333位的Arg已经被替换为Ser);和欧洲专利申请583998(描 述减毒的RV突变体，SAG2，其中G蛋白333位的Arg被Glu替换）。
[0015] 其他株，例如RC-HL株，在G的333位具有精氨酸残基，但在成年小鼠中不造成致命 感染（Ito等人，Microl. Immunol .38 :479-482,1994; Ito等人，J. Virol .75: 912卜9128， 2001)。因此，整个G可能有助于RV的毒性，尽管决定簇或者区域之前还没有被鉴定。G基因编 码诱导病毒中和抗体的唯一蛋白。已知RV糖蛋白的至少3种状态:负责受体结合的天然状态 (N);膜融合过程初始步骤必需的活性疏水状态(A)(Gaudin，J.Cell Biol. 150:601-612, 2000)，和融合无活性构象（Ι)Χ的正确折叠和成熟在免疫识别中起着重要作用。ERA G胞外 结构域中3个潜在糖基化位置分别存在于Asn37，Asn247和Asn 319残基（Wojczyk等人， Glycobiology. 8:121-130，1998) X的非糖基化不仅影响构象，而且抑制蛋白在细胞表面的 呈递。因此，阐明导致狂犬病病毒致病性的分子决定簇提出了一个复杂的问题。
[0016] 发明概述
[0017] 此处公开了对应于狂犬病病毒Evelyn-Rokitnicki-Abelseth(ERA)固定疫苗的病 毒株的完整序列，以及对其和狂犬病病毒属其他株进行测序的方法。
[0018]还描述了狂犬病病毒的反向遗传系统，尤其是利用狂犬病病毒株ERA作为不范。 T7RNA聚合酶的使用促进病毒复原，所述T7RNA聚合酶在N末端包含一个八氨基酸核定位信 号(NLS)。除未代ERA病毒株外，还描述了数种其他衍生病毒，包括ERA-(缺失psi-区域）， ERAgreenl (在psi-区域插入绿色焚光蛋白基因），ERAgreen2(在磷蛋白和基质蛋白基因间 区域插入绿色荧光蛋白），ERA2g(在psi-区域包含糖蛋白的额外拷贝），ERAg3(在糖蛋白氨 基酸333处有突变），ERA2g3(在psi-区域氨基酸333处具有改变的糖蛋白的额外拷贝），ERA- G(其中已经删除糖蛋白），ERAgm(M和G基因在基因组中互换），和ERAgmg(重排的ERAgm构建 体中G的两个拷贝）。额外转录单位被整合入ERA病毒基因组用于开放阅读框(ORF)的有效表 达。通过优化此处描述的繁殖条件，在生物反应器或者固定的组织烧瓶中恢复病毒的滴度 达到超过10 9ffu/mL。
[0019] 还公开了一种组成性表达ERA糖蛋白的改造细胞系。该细胞系，命名为BSR-G，用于 重组的，包括减毒和/或复制缺陷的，狂犬病病毒的制备。
[0020] 根据下列详细说明，本发明的上述以及其他目的、特征和优点将更显而易见。
[0021 ] 附图简述
[0022 ]图1A. ERA转录质粒的示意图。锤头核酶和反基因组ERA基因组的位置如图解所示。 按5'到3'方向显示N，P，M G和L蛋白的相对位置。
[0023] 图1B.构建全长ERA狂犬病病毒基因组cDNA质粒pTMF的示意图。RT-PCR产物F1、F2 片段，和限制性酶识别位点(Nhel ,ΚρηΙ，Blpl，Pst和Notl)(未按比例绘制）。左边的条显示 RdRz-锤头核酶，右边的条显示HDVRz-丁型肝炎病毒核酶。符号?表示Kpnl或者Pstl位点被 删除，丨垂直箭头表示Nhel或者Notl位点仍是完整的。
[0024]图2.通过pNLST7质粒的NLST7RNA聚合酶自身基因作用设想机理的示意图。DNA转 染试剂复合物通过胞吞作用摄入细胞。从溶酶体和内体释放的大部分DNA保留在细胞的细 胞质中。有限量的质粒转移到细胞核：1)通过CMV立即早期启动子，NLST7基因通过细胞RNA 聚合酶Π 转录;2)成熟的NLST7mRNA从细胞核转运到细胞质用于NLST7RNA聚合酶合成;3)新 合成的NLST7RNA聚合酶转移到细胞核，而痕量NLST7保留在细胞质中；4)NLST7RNA聚合酶通 过PT7启动子起始转录。通过转录后修饰，产生额外的NLST7mRNA用于蛋白合成，从而提高病 毒恢复效率。
[0025]图3. 10种衍生ERA病毒基因组的示意图。各基因的大小不是按比例绘制。符号 标明在Aa333残基处G的突变，Ψ是Psi-区域。
[0026]图4A.转染细胞中回收的ERA-G病毒，在BHK-G细胞系中传播和生长的分析。在A中， 甚至在以用于病毒恢复的质粒转染后的7天后，ERA-G病毒病灶仍被抑制。在B中，在正常BSR 细胞中传代后，恢复的ERA-G病毒不传播。只有个别细胞被DFA染色。在C中，ERA-G病毒在组 成型BHK-G细胞系中生长良好。
[0027]图4B.BHK-G细胞系中G表达的分析。通过间接荧光染色法，ERA狂犬病病毒G在稳定 的细胞系BHK-G的细胞质中表达。
[0028] 图4C.利用G探针，通过Northern印迹对ERA-G病毒感染细胞中G mRNA的分析。第2 道显示在ERA-G病毒感染的BHK-G细胞中检测到G基因 mRNA，而未检测到病毒基因组RNA。第1 道是ERA-狂犬病病毒感染的BHK-G细胞的总RNA对照，其中G mRNA和病毒基因组RNA均被检 测到。
[0029] 图5.单步病毒生长曲线所有恢复狂犬病病毒ERA株生长到109或者101()ffu/mL，但 ERA-G 只达到 107ffu/mL。
[0030] 图6.ERAgreenl/ERAgreen2狂犬病病毒感染的BSR细胞中的绿色病灶Transl是在 Psi和L基因间区域整合的翻译单位。Trans2是在P和Μ基因间区域的翻译单位。ERAgreen2和 ERAgreenl均在病毒感染的BSR细胞中稳定表达GFP蛋白，而病毒感染后ERAgreen2绿色病灶 的出现比在ERAgreenl中早48小时。
[0031 ]图7.在双G，和G、M重排的ERA-狂犬病病毒中G mRNA表达的分析。在利用G探针的 Northern印迹中，与ERA-病毒感染的细胞(第2道)相比，对ERA2g(第1道）、ERAgm(第3道)和 ERA2g3(第4道）中G mRNA光密度的测量显示增强的mRNA水平。利用ERA-病毒作为100%，计 算比例。
[0032]图8A.通过体内接种重组ERA和衍生物诱导的发病率。三周龄小鼠肌内接种8种恢 复病毒。在接种后10天，在ERA、ERA-和ERAgreenl组中，50%、50%和20%的小鼠分别显示狂 犬病的相应临床症状，但没有死亡。其他组中没有观察到不良征象。
[0033]图8B.接种重组ERA和衍生物的小鼠中攻击后的存活率。从图8A中所示的试验中存 活的小鼠用Texas犬/山狗狂犬病病毒进行肌内攻击。在攻击后5天，在ERA和ERA-组中，40和 62%的小鼠分别显示狂犬病征象并被处安乐死。在所有其他组中，没有观察到狂犬病征象。 [0034]图8C.脑内接种重组ERA和ERAg3病毒后的存活。三周龄小鼠分别脑内接种ERA和 ERAg3病毒株。ERA组中所有小鼠在接种后15天死亡，而在ERAg3组中，所有小鼠都存活，没有 临床症状。
[0035]图8D.乳鼠脑内接种后的存活。两日龄的乳鼠分别脑内接种ERAg3和ERA-G病毒构 建体。ERAg3组中所有小鼠死亡，而ERA-G组中没有小鼠死亡。
[0036]图8E.接种重组ERA和衍生病毒的小鼠的中和抗体滴度。利用RFFIT测定小鼠中和 抗体滴度，在病毒接种组中范围从每ml 1.36到5.61 IU。
[0037]图9A.感染Albania蝙蝠狂犬病病毒后的存活。仓鼠接种活的Albania蝙蝠狂犬病病 毒，然后用ERAg3病毒或者狂犬病免疫球蛋白和商品化供应的灭活RV疫苗进行接触后处理。 在超过3个月期间进行存活评定。
[0038]图9B.感染Thai Street犬狂犬病病毒后的存活。仓鼠接种活的Albania蝙蝠狂犬病 病毒，然后用ERAg3病毒或者狂犬病免疫球蛋白和商品化供应的灭活RV疫苗进行接触后处 理。在超过3个月期间进行存活评定。
[0039] 图9C.感染Texas山狗狂犬病病毒后的存活率。仓鼠接种活的Albania蝙蝠狂犬病病 毒，然后用ERAg3病毒或者狂犬病免疫球蛋白和商品化供应的灭活RV疫苗进行接触后处理。 在超过3个月期间进行存活评定。
[0040] 序列表
[0041 ]如37C. F. R. 1.822所定义，利用核苷酸碱基的标准字母缩写和氨基酸3字母编码， 显示所附序列表中所列的核酸和氨基酸序列。每个核酸序列只显示一条链，但应当理解为 通过任意参考所显示的链，还包括互补链，除非上下文明确表示只意在一条链。适当的话应 理解，通过用尿嘧啶取代硫胺残基，表示为DNA的序列可以转换为RNA。
[0042] SEQ ID NO: 1 .ERA CDC野生型病毒，11,931 个核苷酸 [0043] 1-58核苷酸，前导区
[0044] 71-1420核苷酸，N基因
[0045] 1514-2404核苷酸，P 基因
[0046] 2496-3101 核苷酸，M 基因
[0047] 3317-4888 核苷酸，G 基因
[0048] 4964-5362 核苷酸，Psi-区域
[0049] 5417-11797 核苷酸，L 基因
[0050] 11862-11931 核苷酸，Trailer 区
[0051] SEQ ID N0:2.ERACDC:71到1420:450aa，N蛋白·
[0052] SEQ ID 恥：3』1^〇)(：:1514到2404:297&&，？蛋白·
[0053] SEQ ID N0:4.ERACDC:2496到3101:202aa，M蛋白·
[0054] SEQ ID N0:5.ERACDC:3317到4888:524aa，G蛋白·
[0055] SEQ ID N0:6.ERACDC:5417to 11797:2127aa，L蛋白·
[0056] SEQ ID N0:7.通过反向遗传系统恢复的重组ERA(rERA)有11,930个核苷酸。在重 组ERA反向遗传系统中，野生型ERA株中G基因和psi-区之间的特异性poly (As) tract被突变 为poly (A7) tract，作为序列标记物。因此，rERA比野生型ERA少一个核苷酸。所有其他序列 ?目息都是完全相同的。
[0057] SEQ ID N0:8.ERAg3株（11,930个核苷酸），G蛋白中的氨基酸（333Aa)已经改变;相 应的核酸在4370到4372位。
[0058] SEQ ID N0:9.ERA-(11，577个核苷酸），无 psi(假-基因）区；额外转录单位已经导 入核苷酸4950到5008位。
[0059] SEQ ID ^):10』1^-26(13，150个核苷酸），该株具有6基因的两个拷贝；第二个拷 贝在4988到6559位插入。
[0060] SEQ ID勵：11上1^8代611(12,266个核苷酸），该株在4993到5673位包含6??的编码 序列;细胞或者组织感染后在紫外光下显示绿色。
[0061] SEQ ID从)：12上1^-6(10,288个核苷酸），该株不含6基因。
[0062] SEQ ID勵:13上1^-283(13，150个核苷酸）；该株具有6基因的两个拷贝（其中第二 个在4988到6559位），两个均是在氨基酸333被取代（对应于所示序列中核苷酸位置4370-4372和6041-6043)。
[0063] SEQ ID如：14上1^1七（11，976个核苷酸，？基因后2469到2521位处具有一个额外 的转录单位）。
[0064] SEQ ID如：15』1^1卜6??(12,662个核苷酸，在？基因后2505到3185位插入6卩?基 因）。
[0065] SEQ ID N0:16.ERAgm(ll，914个核苷酸)G和Μ基因的位置分别与G在2505-4076位 和Μ在4122-4727位互换。
[0066] SEQ ID勵：17上1^83111(11，914个核苷酸)6和]\1基因的位置分别与6在2505-4076位 和Μ在4122-4727位互换。G基因在氨基酸333位突变。
[0067] SEQ ID Ν0:18.ERAgmg( 13,556个核苷酸），该株在2505-4076位和4943-6514位具 有G基因的两个拷贝，在4122-4727位侧翼带有Μ基因。
[0068] SEQ ID Ν0:19.锤头核酶的前10个核苷酸对应于狂犬病病毒ERA基因组的5'端。 [0069] SEQ ID从):20.核苷酸序列编码3￥401'抗原核定位信号(13)。
[0070] SEQ ID NO :21-23.人工Kozak序列。
[0071] SEQ ID NO:24-57.合成寡核苷酸。
[0072] SEQ ID N0:58.在氨基酸333位突变的G蛋白的氨基酸序列(从Arg到Glu)。
[0073] SEQ ID NO :59-65.合成寡核苷酸。
[0074] 具体内容
[0075] I.介绍
[0076] 病毒性人畜共患病很难预防。一种主要范例是通过口服免疫控制野生动物狂犬 病。所有当前得到许可的口服狂犬病疫苗基于一个共同来源<^￥6 1711-1?〇1^1：11；^1^-Abelseth(ERA)的固定狂犬病病毒(RV)来源于Street-Alabama-Dufferin(SAD)株，1935 年 首先从阿拉巴马(USA)的一条疯狗中分离。在小鼠脑、幼仓鼠肾(BHK)细胞和鸡胚中进行SAD RV的多次传代后，获得ERA株。ERA在BHK细胞中的重复克隆最终获得B-19克隆，其被命名为 SAD-B19,用于疫苗研究。通过反向遗传恢复的第一个RV株是SAD-B19。尽管SAD-B19和ERA RV来自相同来源，但是在不同动物的口服疫苗研究中观察到不同的结果。例如，ERA在臭鼬 或者浣熊中口服不诱导明显的中和抗体，而SAD-B19诱导。为了阐明这两种RV株之间的潜在 差异，需要一种用于ERA RV株的反向遗传系统。
[0077]反向遗传学提出了一种按照指定路线修饰RNA病毒的可行途径。一种用于狂犬病 病毒原始株的反向遗传系统在1994年成功建立(Schnell等人，The EMBO J. 13,4195-4203， 1994)。在十年间，已经对该系统作出改进，导致病毒恢复的效率增加。这种增加的效率有助 于阐明病毒致病性、蛋白-蛋白以及蛋白-RNA相互作用。
[0078] 在狂犬病病毒基因组内，已经认为一些区域包含重要的信号，例如病毒远端启动 子区，核蛋白包装，RNA依赖性RNA聚合酶L转录起始位点，多腺苷酸化和终止位点。这些信号 对于确保病毒的有效恢复和设计额外的转录单位是非常重要的，所述额外转录单位用于将 外源的开放阅读框(0RF)接纳到狂犬病病毒基因组中。
[0079] 本公开提供一种有效的反向遗传系统，并描述其产生ERA株病毒的变异体的用途。 此处描述的修饰获得适合用于接纳0RF表达和疫苗开发的候选株。
[0080] 反向遗传系统由一组质粒组成。第一种质粒包括ERA病毒cRNA。为了在转录的病毒 cDNA中产生可靠的病毒反基因组末端，ERA基因组在cDNA3'端侧翼为锤头核酶，5'端侧翼为 丁型肝炎病毒核酶。反基因组盒与细菌噬菌体T7转录起始信号融合，这还任选在巨细胞病 毒(CMV)立即早期启动子的控制下。
[0081] 该系统还包括大量辅助质粒，所述辅助质粒编码参与病毒包装的蛋白。例如，该系 统通常包括编码病毒核蛋白（N)、磷蛋白（P)、RNA依赖性聚合酶(L)、和任选的病毒糖蛋白 (G)的辅助质粒。该系统还包