胞系被命名为BHK-G，用于生长ERA-G病毒。
[0290] 实施例5:狂犬病病毒Evelyn-Rokitnicki-Abelseth(ERA)株的限定修饰
[0291] 除了上述的亲代ERA病毒株外，利用此处公开的反向遗传系统开发了衍生病毒株。 产生了数个示范性的修饰病毒，即ERA-(完整psi-区的缺失），ERAgreenl (绿色荧光蛋白基 因插入ERA病毒基因组psi区），ERAgreen2(绿色荧光蛋白基因插入磷蛋白和基质蛋白的基 因间区域），ERA2g(在psi-区包括糖蛋白的额外拷贝），ERAg3(在糖蛋白氨基酸333位具有突 变），ERA2g3(在psi-区Aa333具有突变糖蛋白的额外拷贝），ERA-G(去除糖蛋白），ERAgm(基 因组中Μ和G基因互换），和ERAgmg(重排ERAgm构建体中G的两个拷贝）。这些衍生物示意性图 解于图3。通过优化所述的生长条件，在组织培养瓶和生物反应器中，所有的拯救病毒都可 以达到10 9到101()ffu/ml的病毒滴度。
[0292 ]反向遗传系统中的基因缺失和定点突变 [0293] 狂犬病病毒ERA基因组Psi区的缺失
[0294]狂犬病病毒ERA基因组的完整Psi-区如下被删除：利用pTMF作为模板，用引物(5 Δ Φ:CCCTCTGCAGTTTGGTACCGTCGAGAAAAAAACATTAGATCAGAAG;SEQ ID N0:51，下划线为Pstl和 Kpnl识别位点；和Le3-Blp引物），通过PCR扩增3' Δ φ片段，并克隆到pCR-Bluntll-TOPO载体 (Invitrogen，Carlsbad，CA)，用于ρΡ Δ 5Φ质粒的构建。利用相同的模板，用引物（SnaB5 : ATGAACTTTCTACGTAAGATAGTG ； SEQ ID NO : 52，下划线为SnaBl识别位点；和3 Δ φ : CAAACTGCAGAGGGGTGTTAGTTTTTTTCAAAAAGAACCCCCCAAG; SEQ ID NO: 53，下划线为Pst 1 识别 位点），通过PCR扩增5 ' Δ φ片段，连续克隆到上述ΡΡ Δ 5Φ质粒，完成ρΡ Δ φ质粒的构建。通过 SnaBl和Pstl限制性酶消化ρΡΔφ质粒回收的片段，取代pSKF构建体中的对应物以制备pSKF Δ φ质粒。通过用Nhel和Notl消化pSKF Δ φ质粒得到的包含ERA基因组cDNA的全DNA片段，被 重新克隆到pcDNA3.1/Neo( + )质粒，完成pTMF Δ φ的构建。为了验证缺失Psi的拯救株，命名 为ERA-，在用ERA-感染BSR细胞总RNA的RT-PCR中，使用覆盖Psi-区的引物。只有从rERA病毒 扩增出对应于Psi区的400bp片段，而非ERA。序列数据证实Psi-区的完全缺失。
[0295] 狂犬病病毒ERA基因组中糖蛋白基因的缺失:
[0296] 利用pSKF作为模板，用引物（SnaB5引物，和3 Δ g:CAAACTGCAGAGGGGTGTTAGITmTT CACATCCAAGAGGATC;SEQ ID NO: 54)通过PCR扩增5'g Δ φ片段。在SnaBl和Pstl限制性酶消化 后，该回收的片段被克隆，以取代其在pSKFATt构建体中的对应物。利用相同模板，用引物(5 Δ g:CCTCTGCAGTTTGGTACCTTGAAAAAAACCTGGGTTCAATAG;SEQ ID 勵：55，和1^3-81?引物）通 过PCR扩增3'gAil)片段，并被连续克隆到修饰的pSKFAih以取代其对应物。最终片段，通过 SnaBl和Blpl限制性酶从不含G基因的pSKFAit上切割回收，被重新克隆到pcDNA3.1/Neo( + ) 质粒，以形成pTMF △ g构建体用于病毒恢复。
[0297] 糖蛋白基因定点突变:
[0298] 按照先前描述的(Wu等人J.Virol .76:4153-4161,2002)进行定点突变，在糖蛋白 的333位氨基酸处引入从AGA到GAG的3个核苷酸改变。诱变反应中的引物是M5G引物： CTCACTACAAGTCAGTCGAGACTTGGAATGAGATC(SEQ ID N0:56，黑体为3个突变的核苷酸）和M3G 引物:GACTGACTTTGAGTGAGCATCGGCTTCCATCAAGG(SEQ ID N0:57)。对于恢复株(ERAg3)，在利 用引物5G和3G进行RT-PCR后，通过测序证实氨基酸333位(aa333)AGA到GAG的3个核苷酸变 化。通过DNA测序确认后，突变的G被克隆回pTMF质粒，以制备pTMFg3构建体用于病毒恢复。 该突变的G基因编码的糖蛋白如SEQ ID N0:58所示。
[0299] 外源0RF整合入ERA狂犬病病毒基因组
[0300]为了在RV中表达外源0RF，制备含Pstl和Kpnl识别位点的额外转录单位，分别整合 在Psi或者P-Μ基因的基因间区域。简单来说，为了在Psi-区制备额外的转录单位，遵循相同 的步骤，除了5 ' Δ φ片段扩增步骤，3 Δ φ引物变为3 Δ i^cis: CCAAACTGCAGCGAAAGGAGGGGTGTTA gtttttttcatgatgaaccccccaaggggagg( SEq ID N〇:59)。不含作卜区、但具有额外转录单位 的最终构建体被命名为PMTF △ ikisXFP，ERA G，或者氨基酸残基333位突变的G分别被克隆 到该翻译单位中，以形成pMTFgfpl，pMTF2g，pMTFg3，pMTF2g3构建体，用于病毒拯救。
[0301]为了将额外转录单位整合到P-Μ基因间区域，利用pMTF作为模板，用引物cis55扩 增cisp5片段：GACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCTGTTAAG( SEQ ID N0: 60)，cis53 : CCAAACTGCAGCGAAAGGAGGGGTGTTAGTTTTTTTCATGTTGACTTTAGGACATCTCGG(SEQ ID N0:61)，并 被克隆以取代其在pMTF质粒中的对应物。利用引物cis35: CCTTTCGCTGCAGTTTGGTACCGTCGAG AAAAAAACAGGCAACACCACTGATAAAATGAAC(SEQ ID N0 : 62 )和cis33: CCTCCCCTTCAAGAGGGCCCCTGGAATCAG(SEQ ID N0:63)，以相似的方法扩增和克隆cisp3片段。 在cisp5和cisp3片段组装到一起后，最终构建体被命名为pMTFcisp，用于接受ORF。包含GFP 基因的重组构建体被命名为pTMFgfp2，用于病毒恢复。
[0302]为了产生ERA衍生物，命名为ERAgm，其中糖蛋白编码序列与基质蛋白编码序列的 顺序相反，按如上所述删除糖蛋白基因。然后将G基因（按上面公开的进行扩增)插入P和Μ基 因之间，按照N-P-G-M-L的顺序获得狂犬病病毒基因组。类似地，使用相同策略产生ERAg3m 衍生物，其中糖蛋白通过取代由上述定点突变产生的G基因，在333位氨基酸残基具有3个核 苷酸突变(从AGA到GAG)。为了产生ERAgmg构建体，将糖蛋白基因的额外拷贝插入P和Μ基因 之间，按照NK-M-G-L的顺序制备狂犬病病毒基因组。
[0303] 额外转录单位被修饰和整合入ERA基因组的两个不同区域，即psi-区和P-Μ基因间 区域。当异源0RF被整合入这些转录单位时，分别称为trans 1和trans 2,导致有效产生编 码的产物。
[0304] 转录单位的序列是：CTAACACCCCTCCTTTCGCTGCAGTTTGGTACCGTCGAGAAAAAAA (SEQ ID N0:64,下划线是Pstl和Kpnl)。
[0305] 实施例6:亲代和衍生病毒的恢复
[0306]本实施例描述利用此处公开的反向遗传系统对亲代ERA病毒和示范性衍生物的恢 复。按照制造商推荐的方案，BSR细胞在6孔板中接近80%融合时，用3yg/孔的病毒全长转录 质粒pTMF(分别是pTMF Δ φ，pTMFg3，pTMF2g，pTMF2g3，pTMFgfp 1，pTMFgf p2，pTMF Δ g，pTMFgm 或者pTMFgmg)和5种辅助质粒：pTN(lyg/孔），pMP(0·5yg/孔），pML(0·5yg/孔），pMG(0·5yg/ 孔）和pNLST7(lyg/孔），通过TransIT-LTl试剂(1化118，1&1(1丨8〇11，11)进行转染。转染后4天， 每孔添加 lml新鲜BSR细胞悬液(大约5乂105细胞）。细胞在37°(3,5%〇)2中孵育3天。收集细胞 上清用于病毒滴定。
[0307] 为了滴定恢复的病毒，LAB-TEK 8孔板(NaperVille，IL)中的单层BSR细胞用10倍 系列稀释的病毒上清感染，在37°C、0.5%C02中孵育48小时。室温下细胞在80%冷丙酮中固 定1小时，在37°C用FITC标记的抗狂犬病病毒N单克隆抗体染色30分钟。用PBS洗板3次后，利 用直接焚光显微镜计数染色灶。在万维网（world wide web)cdc.gov/ncidod/dvrd/ rabies/professional/publications/DFA_diagnosis/DFA_protocol .htm可以找到直接RV 荧光分析(DFA)的详情。
[0308]如表3所示，除ERA-G外的所有病毒都从培养的BSR细胞中高滴度地恢复。令人惊讶 的是，G基因与Μ基因的重排和转换没有妨碍重组衍生ERA病毒的恢复。先前认为RV基因组中 G基因的重排是不可行的，因为G蛋白的过表达造成细胞死亡（Faber等人，J. Virol. 76 : 3374-3381,2002)。但是，这些结果证明，在ERA株中重排是可能的。因此，有可能不仅对于G 基因，而且对于其他基因来说，RV基因改组也是可能的。
[0309]按照与其他病毒构建体拯救相同的步骤进行质粒转染后，ERA-G(不含G)病毒被恢 复，但在第一轮转染后，病毒灶是非常有限的，并限制于局部区域。即使在37°C、5%C02中孵 育1周后，拯救的病毒也不能进一步传播到邻近的正常BSR细胞（图4A)。利用上述转染上清 感染的正常BSR细胞在DFA试验中呈现单细胞染色，这表明恢复的病毒不能传播。为了扩增 ERA-G病毒，按照实施例4所述，建立组成性表达ERA G的BHK细胞系（命名为BHK-G)。通过间 接荧光分析筛选，对表达G的BHK细胞库进行筛选，并维持用于ERA-G病毒的扩增（图4B)。借 助BHK-G细胞系，ERA-G病毒生长到10 7ffu/ml。从感染ERA-G病毒的BHK-G细胞提取总RNA，利 用G基因探针进行Northern印迹分析（图4C)。病毒基因组RNA中不存在G基因，但是检测到G mRNA，其来自感染的支持性BHK-G细胞。在纯化的ERA-G病毒基因组RNA中，利用G探针没有检 测到杂交信号，表明ERA基因组中G基因的缺失。
[0310] 实施例7:在生物反应器中拯救的ERA病毒和其衍生物生长到高滴度
[0311] 在口服疫苗开发中，通常需要高病毒滴度以便在给药后引发可靠的免疫。本实施 例证明，ERA病毒和衍生物可以在适合商品化规模放大的体积的生物反应器中生长到高滴 度。所有10种拯救的ERA病毒在生物反应器CELLine AD1000(IBS Integra Bioscience， Chur，瑞士）中扩增到滴度从107至l」101()ffu/ml。简单来说，如上所述，用示范性的反基因组转 录载体和辅助载体转染BSR细胞。在十分之一生物反应器容积中，以10 6细胞/ml浓度，每细 胞1个病毒粒子的感染复数接种细胞。37°C、5%C02条件下，转染细胞在添加10%胎牛血清 的DMEM中生长。每3到5天收集上清，收集2到3次。与其他病毒相比，缺陷型ERA-G生长较差， 对于ERA-G来说只有10 8f f u/ml (表3和图5)。
[0312] 表3.全长质粒构建体和对应的拯救病毒
[0313]
[0314」买施例8:狂犬病病毐中来目额外翻译早位的外源蛍臼的表达 [0315]本实施例证明了来自异源0RF的重组蛋白的表达，所述0RF插入狂犬病病毒载体。 在本实施例中，ERA病毒载体被用作原型狂犬病病毒载体。为了构建ERA病毒作为接受0RF的 载体，N和P基因之间的保守RV转录单位被修饰，并在两个不同位置导入ERA基因组：1)在psi 区（trans 1)，和2)在P-Μ基因间区域(trans 2)。将转录单位设计成具有两个独特的限制性 酶识别位点，以便异源多核苷酸序列的导入：（ITTTTTTGATTGTGGGGAGGAAAGCGACGTCAAACCA TGGCAGCTCTTTTTTT:SEQ ID N0:65,下划线为Pstl和Kpnl位点）。
[0316]在第一个实施例中，为了病毒恢复，GFP基因被克隆入该单位，因为当转染的BSR细 胞仍在孵育时，可以直接在UV显微镜下观察GFP表达。利用470+20nm的激发滤波器，通过荧 光显微镜检查直接可见GFP蛋白的表达。ERAgreen2 (在RV基因组中P基因后插入的GFP基因-trans 2)-感染的细胞在质粒转染3天后，显示清晰的绿色灶，而ERAgreenl (在"传统" Ψ区G 基因后插入的GFP基因 -trans 1)直到转染后5天才显示明显的绿色灶（图6)。导入的转录单 位在RV基因组两个位置都是有功能的，尽管当GFP从trans 2表达时，表达和积聚显然更快。 因此，这些结果还表明，通过选择其中克隆ORF的转录单位，可以调节异源ORF的表达水平。
[0317] 在其他实施例中，1)ERA G的额外拷贝；或者2)在333位具有氨基酸取代的ERA G的 额外拷贝，被整合到ERA病毒基因组中。成功拯救的病毒分别被命名为ERA2g和ERA2g3。因为 定量病毒G的表达是不现实的，所以利用G探针通过Northern印迹来证实ERA2g和ERA2g3-感 染的细胞中G表达水平的相对增加。简单来说，利用D i g D N A标记试剂盒（R 〇 c h e， Indianapolis，IN)标记ERA G基因探针，用Dig核酸检测试剂盒（Roche，Indianapolis，IN) 进行成像，通过密度分光光度法测量（图7)。利用5G和3G引物通过RT-PCR还证实了恢复病毒 中串联连接的G基因。观察到表示单一G拷贝的主要条带位于1.5kb。此外，在大约3. Okb处观 察到第二条较弱的条带，指示串联排列的两个G。
[0318] 这些结果证明，转录单位导入ERA基因组可用于从导入的0RF表达各种异源蛋白。 此外，通过0RF插入的位置，调节异源0RF编码蛋白的表达。因此，ERA病毒是一个用于重组蛋 白表达的可广泛适用的载体。
[0319] 实施例9:针对工程化病毒的体内免疫应答
[0320]本实施例证实接种工程化ERA病毒和示范性衍生物的体内影响。所有动物管理和 实验步骤均遵循⑶C实验动物管理和使用指导(CDC Institutional Animal Care and Use Guidelines)。80只3周龄小鼠被分成8组，每组10只，肌内（i.m)使用恢复病毒（每只小鼠 10 6f f u病毒）。10只健康小鼠留作未感染的模拟对照。对于ERA和ERAg3构建体，对另一组10 只3周龄小鼠进行相同剂量病毒的额外脑内（i.c)注射。在2日龄乳鼠中，只进行相同剂量的 ERAg3和ERA-G病毒脑内接种。每天检查动物的患病情况。所有动物利用⑶2中毒安乐死，取 出大脑用于狂犬病病毒诊断。感染后10天，通过眶后途径取血，获得血清用于中和抗体分 析，然后进行标准快速焚光灶抑制试验（RFFIT)(Smith等人，Bulletin of the World Health Organization.48:535-541,1973)。感染后1个月，存活的动物用致死量的狂犬病街 病毒(狗/山狗唾液腺匀浆)攻击(Orciari等人，Vaccine. 19:4511-4518,2001)。
[0321] 抗狂犬病病毒G的小鼠单克隆抗体（Mab 52311 )保存在CDC(Hamir等人，Vet 1^(3.136,295-296，1995)^11'0偶联抗，单克隆抗体购自〇61^〇(3(^(!1(^81^111，？4)<^78祖聚 合酶单克隆抗体来自Novagen(Madison，WI)。山羊抗-小鼠 IgG-FITC偶联物购自3丨8111&-Aldrich(St.Louis，M0)。抗狂犬病病毒G单克隆抗体(Mabl-909)保存在CDC，山羊抗人IgG-FITC偶联物购自 Sigma-Aldrich(St · Louis，M0)。
[0322] 在肌内接种8种不同病毒构建体的3周龄小鼠中，50%接种ERA(rERA)或者ERA-的 小鼠，和20%接种ERAgreenl的小鼠在接种后19天显示轻度神经征象。其他组都未显示提示 狂犬病病毒感染的任何征象（图8A)。在攻击前收集血清用于中和抗体滴定。ERA2g(5.60IU) 和ERA2g3(5.61IU)比单拷贝的G病毒构建体引发更高的滴度（图8E)。接种后1个月存活的小 鼠接受致命的狗/山狗街病毒(〇. 〇5ml，保存在CDC用于标准动物攻击试验)的攻击。在ERA和 ERA-组中，40到62%的小鼠分别显示轻度狂犬病征象，然后处以安乐死。所有其他组都存 活，没有狂犬病的任何征象（图8B)。在i.c组中，3周龄小鼠在接种ERAg3后存活，但在注射 ERA后死亡（图SChERA-G构建体不杀死2日龄乳鼠，但是ERAg3具有足以杀死所有感染乳鼠 的毒力（图8D)。示例性的抗体滴度显示于表4。
[0323] 表4:狂犬病特异抗体的制备
[0324]
[0325]这些数据证明，所有基于ERA的病毒都能够在接种后引发免疫应答。与预期一致， 亲代ERA病毒是有毒力的，在感染动物中造成显著的发病和死亡。相反，各种示范性衍生物 当在攻击前接种小鼠时，引发保护性免疫应答。
[0326] 除了如上所述的接触前评价外，还检测了在用毒性狂犬病病毒感染后，ERA病毒衍 生物引发保护性免疫应答的能力。简单来说，仓鼠组用3种不同狂犬病病毒株中的一种感染 (每组η = 9)，并且接受重组疫苗(ERA-g333)或者狂犬病免疫球蛋白加灭活的商业狂犬病疫 苗。如图9A-C所示，大约80-100%的对照动物死亡，而大约60-100%的接种动物存活。这些 结果证明，衍生的狂犬病病毒的接触后给药基本上可以防护不同的狂犬病病毒株。
[0327] 鉴于本发明公开的原理可以应用到许多可能的实施方式，应当认识到，举例说明 的实施方式只是本发明优选的实施例，不应被用于限制本发明的范围。而是，本发明的范围 由所附权利要求确定。因此要求所有在这些权利要求的范围和精神内的都作为我们的发 明。
【主权项】
1 · 一种载体系统，包括： 包括ERA株全长反基因组cDNA衍生物的第一载体，其中所述衍生物的序列如SEQID NO: 16所示;和， 包括编码狂犬病病毒N蛋白的多核苷酸序列的载体，包括编码狂犬病病毒P蛋白的多核 苷酸序列的载体，包括编码狂犬病病毒L蛋白的多核苷酸序列的载体，包括编码噬菌体 T7RNA聚合酶的多核苷酸序列的载体，以及包括编码狂犬病病毒G蛋白的多核苷酸序列的载 体， 其中转染的宿主细胞中多个载体的表达引起重组狂犬病病毒的产生。2. 权利要求1的载体系统，其中第一载体按5 '到3 '方向包括:锤头核酶;狂犬病病毒反 基因组cDNA;和丁型肝炎病毒核酶，其中锤头核酶的10个核苷酸与狂犬病病毒的反义基因 组序列互补。3. 权利要求2的载体系统，其中反基因组cDNA的转录受CMV启动子和噬菌体T7RNA聚合 酶启动子中至少一种的转录调控。4. 权利要求1的载体系统，其中编码狂犬病病毒P、M、L或者G蛋白或者T7聚合酶的一种 或者多种多核苷酸序列的转录受CMV启动子和T7启动子两者的转录调控。5. -种重组病毒基因组，其由SEQIDN0:16所示的核酸组成。6. 权利要求5的重组病毒基因组，其被包括在载体中。7. -种重组病毒，其包括权利要求5所述的基因组。8. -种制备活狂犬病病毒疫苗的方法，其包括将权利要求1-4中任一项的载体系统导 入分离的宿主细胞，并恢复活的重组狂犬病病毒。9. 权利要求8的方法生产的活狂犬病病毒疫苗在制备用于接种对象抗狂犬病的药物中 的应用。10. 权利要求9的应用，其中对象是人。11. 权利要求9的应用，其中对象是非人动物。12. 权利要求9的应用，其中药物能经口服给药。13. 权利要求12的应用，其中药物能通过设计成接种野生动物群体的食物-诱饵口服给 药。14. 一种药物组合物，其包括权利要求8的方法生产的活狂犬病病毒疫苗和药学上可接 受的载体或者赋形剂。
【专利摘要】本发明涉及狂犬病病毒组合物和方法。具体地，本发明公开了狂犬病病毒株Evelyn-Rokitnicki-Abelseth(ERA)的全长序列。提供一种用于产生重组ERA病毒和其衍生物的反向遗传系统，以及包括ERA和/或ERA衍生病毒株、核酸和/或蛋白的组合物。在一些情况下，组合物是可用于狂犬病病毒接触前或者接触后治疗的免疫原性组合物。
【IPC分类】C12N15/31, A61P31/14, C12N7/01, C12N15/86, A61K39/205
【公开号】CN105441483
【申请号】CN201510811024
【发明人】查尔斯·E·卢普里希, 吴贤福
【申请人】美国政府健康及人类服务部，疾病控制和预防中心
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2006年10月13日