过这类方法产生的活狂犬病疫苗的制备和给药也是本文所预期的。
[0195] 还公开了一种接种对象抗狂犬病的方法，该方法包括向对象施用有效量的根据提 供的说明所述的活狂犬病疫苗，使对象的细胞感染狂犬病疫苗，其中在对象中产生抗-狂犬 病免疫应答。在一个实施方式中，对象是人。在另一个实施方式中，对象是非人动物。例如， 在有些情况下非人动物是猫，狗，大鼠，小鼠，蝙蝠，狐狸，浣熊，松鼠，负鼠，山狗或者狼。
[0196] 在某些实施方式中，狂犬病疫苗肠道给药。例如，在一些情况下肠道给药包括口服 给药。口服给药包括例如通过为接种野生动物群接种而设计的食物诱饵进行给药。
[0197] 还提供包括所述活狂犬病疫苗(例如，减毒的活狂犬病疫苗)和药学上可接受的载 体或者赋形剂的药物组合物。
[0198] V.测序完整狂犬病病毒属基因组的方法
[0199] 为了便利全长ERA基因组的测序，开发了一种对全长负链RNA病毒进行测序的方 法。该方法适合于狂犬病病毒属的测序，例如狂犬病病毒，以及其他负链RNA病毒。狂犬病病 毒是单负链RNA病毒，具有大约12kb的基因组，范围在11，918(澳大利亚蝙蝠狂犬病病毒属） 和ll，940(Mokola病毒)个碱基之间。GENBANK中提供的狂犬病病毒核酸序列主要集中于编 码下述蛋白的序列一核衣壳蛋白（N)，糖蛋白（G)，磷蛋白（P)和基质蛋白（M)基因，它们接近 基因组的3'端。现有的种系发生分析主要基于N和G基因。但是，对于关系较远的狂犬病病毒 株，RNA依赖性RNA聚合酶(L)基因是用于种系发生分析的最合适候选者。令人遗憾地，公共 基因数据库中很少提供L基因序列。此外，据认为狂犬病病毒末端的前导区和trailer区对 病毒转录和复制（的调节)非常重要。这些可能是例如用于核蛋白包装的保守区域或者L/P 蛋白的结合位点。在前导-N，N-P，P-Μ，M-G，假-基因区和G-L中的基因间区域还作为病毒转 录启始的信号。因此，不仅编码区域，而且病毒基因组内的非编码区域，都可以用于种系发 生分析或者进化研究。利用此处提供的全基因组测序方法，这些序列都可以更容易地进行 分析。
[0200]该方法包括单步逆转录和二步克隆进合适的载体。该方法在载体中产生容易测序 的基因组，无需进行易出错的反复RT-PCR反应。利用在狂犬病基因组末端发现的反向重复 (和其他狂犬病病毒属的基因组），已经设计出通用引物，并在此处描述用于此处所述的快 速全基因组测序步骤。
[0201 ]狂犬病病毒的前导和trailer区包含用于病毒转录和复制的信号。基于对GenBank 提供的基因组序列的分析，在狂犬病病毒或者狂犬病相关病毒包括Mokola病毒中，末端11 个核苷酸是严格保守的。此处提供的测序方法原理基于末端11个互补核苷酸。因为这两种 11个核苷酸的序列是互补的，它们不能用于后续PCR反应。应了解，具有反向重复的其他病 毒利用对应于所述重复的引物能够类似地进行扩增。该11个反基因组有义核苷酸被设计为 用于纯化的ERA基因组的逆转录引物，其完整性通过大小比较和Northern印迹进行验证。利 用1?^，6氺基因探针和11个核苷酸作为寡核苷酸探针，其只结合基因组1?财而不是病毒 mRNA，通过Northern印迹确认全基因组cDNA。
[0202]利用精心设计的保守末端序列对应引物，完全可以在一个反应中逆转录狂犬病病 毒全基因组，条件是病毒基因组制备物的质量要高。
[0203] ERA序列与SAD序列密切相关，SAD序列是其衍生物。这并不奇怪，因为在1970年代 ERA从CDC送到瑞士，在其被寄到德国前，在那里研究人员对它进行改造以便在细胞中生长， 在德国它进一步衍生，并且衍生物在1990年左右被完全测序。迄今为止，根据血清交叉保护 和遗传研究，已经将狂犬病和狂犬病相关病毒分为7种不同类型:典型狂犬病病毒1型(包括 ERA)，2型（Lagos蝙蝠），3型(Mokola)，4型(Duvenhage)，5型（欧洲蝙蝠狂犬病病毒属[EBL] 1)，6型(EBL II)和7型(澳大利亚蝙蝠病毒）。序列分析在下列领域起着重要作用：系统发生 学、进化研究、基因功能预测研究和其他相关领域，包括定位病毒转录和复制调控区域，因 此生物信息学趋向于潜在的治疗药物。
[0204] 本领域普通技术人员已经知道，随着逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术的发 展，现在在一个反应中多达12kb以上的RNA逆转录为cDNA是相对容易的。在优化条件下，PCR 可以在一个反应中扩增大于30kb的靶。
[0205] 利用此处提供的产生全长病毒基因组序列的方法，尤其是狂犬病基因组序列，分 析不同病毒株现在已成为现实。利用得到的全长基因组还能够有效设计减毒病毒，例如用 于免疫刺激组合物和疫苗的免疫作用或者生产。
[0206] 不存在"通用"狂犬病病毒基因组，但这些基因组是相关的。在不同类型中相似性 从60%到100%。一些区域，例如L基因，似乎更保守，而其他区域，例如不编码多肽的psi区， 是更可变化的。不仅狂犬病和狂犬病相关病毒漂变，而且任意RNA病毒也将随时间变化。病 毒如何改变和出现仍是未解决的问题。因此，全基因组序列分析对于进化、致病性和基因功 能研究是重要的。
[0207] 就涉及全基因组测序而言，此处描述的该系统是用于狂犬病病毒的第一个。相信 其适合其他RNA病毒，尤其在狂犬病病毒属中。目前，对于狂犬病病毒种系发生研究，科学家 只利用N，P或者G基因，它们在被感染的细胞或者组织中是最丰富的。已知对于关系较远的 株的比较，包括大半基因组的L基因可能是一个理想的候选位点，应该被使用。令人遗憾地， 由于只有非常有限的资料可以利用，这类进化比较是不可能的，更不用说全基因组序列了。 还是对于病毒转录和复制研究来说，据推测位于基因组3'和5'末端的前导和trailer区起 着重要作用。基因间区域还是病毒反式和顺式研究的信号。所有这些数据是相当有限的，因 为它们不包括在mRNA内。只有全基因组序列可以提供这个水平的必要信息。全基因组测序 不仅可用于疫苗开发，它还适用于基本的病毒转录和复制研究。它还可应用于开发siRNA和 基因治疗。
[0208] VL· ERA基因组测序
[0209] 利用此处描述的方法，已经产生ERA狂犬病病毒基因组的唯一序列。该序列显示于 SEQ ID N0:1。在基因组下列位置编码ERA狂犬病病毒的5种蛋白（SEQIDN0:2-6):N，71-1423 ;P, 1511-2407 ;M, 2491-3104 ;G, 3318-4892;和 L, 5418-11801JRA 和 SAD-B19 之间的同 源性分别是：N 99.56%，P 98.65%，M 96.53%，G 99.05%和L 99.20% dERA和SAD-B19之 间的一个特定差异是G和假基因之间的基因间区域，SAD-B19G转录终止/多腺苷酸化信号被 破坏。
[0210] ERA狂犬病病毒全基因组序列是利用反向遗传学进行疫苗开发和致病性研究的先 决条件。
[0211] VII.用于产生病毒的优化系统
[0212] 实施例6和7提供了用于产生ERA病毒的一组优化条件，其中滴度高达每mll01()ffu。 在生物反应器中，恢复的病毒可以生长到~1〇 9到l〇1()ffu/ml。这种高生产水平对于口服疫 苗开发是最为重要的，这样可以在合理时间段内利用合理的资源分配产生足够的疫苗材 料。
[0213] 对于亲代和重组ERA株来说，提供的生长条件可以稳定产生这种高病毒滴度。这些 生产数据对于潜在的狂犬病口服疫苗开发非常重要。
[0214] VIII.用于产生G-病毒的BSR-G细胞系
[0215] 尽管先前已经从BHK细胞拯救了缺失G蛋白的RV株，但用缺失G蛋白的ERA株病毒仍 然是不可能的。在小鼠脑内或者肌内接种ERA-G后，没有小鼠死亡或者显示任何狂犬病症 状。
[0216] 只有补充糖蛋白，ERA-G(不含糖蛋白）才能在细胞中生长。另外，突变的病毒不能 传播。为了帮助ERA-G生长，建立了BSR-G细胞系，其组成性表达ERA糖蛋白。在下面的实施例 中描述该细胞系的产生。该细胞系用于RV株的恢复，例如在缺乏G下难以恢复的ERA-G，以及 用于优化其他株的恢复。
[0217] IX.用于工程化狂犬病病毒疫苗和异源蛋白表达的反向遗传系统
[0218] 直接通过分子生物学方法不易操纵RNA。传统的RNA病毒疫苗来自天然减毒的分离 物，其难以控制并造成不可预测的结果。反向遗传技术使操纵RNA病毒成为DNA成为可能，其 可以根据精心设计被突变、切除或者重建。每个基因功能都可以仔细、独立和一致地研究， 这有利于疫苗开发。反向遗传学涉及将RNA病毒基因组逆转录成cDNA，并且克隆入载体，例 如质粒。在转染宿主细胞后，载体被转录成RNA，被结构蛋白质包装，所述结构蛋白质还可以 由质粒提供。包装的RNA形成核糖核蛋白复合物，这导致可以被恢复的病毒颗粒。
[0219] 尽管已经公开了用于狂犬病病毒(RV)反向遗传学的3个系统（Schnell等人，The EMBO J. 13,4195-4203,1994; Inoue等人，J. Virol .Method.107,229-236,2003; Ito等人， Microbiol. Immunol.47,613-617,2003)，但这些系统不易适应其他株。目前，即使当病毒株 之间是紧密相关的，也没有狂犬病病毒株借助不同病毒株的辅助质粒而恢复。因此，对于任 意特异病毒株突变或者疫苗开发来说，必须开发一种特定处理系统。
[0220] ERA株是用于狂犬病口服疫苗开发的合适候选物，但其残余致病性是明显的。在 1970年代间，对ERA RV进行了广泛的疫苗开发(Black和Lawson，Can.J.Comp.Med.44:169-176，1980;Charlton，和Casey，Can.J.Vet.Res.20:l68-172,1978;Lawson，和Crawley， Can· J· Vet ·Res · 36:339-344，1972) iRA和SAD-B19均起源于SAD。在初期口服疫苗试验中， SAD-B19在垸熊和臭融中均是有效的，而ERA不是。此外，在动物试验中证实，ERA杀死脑内 (i.c.)给药的两周龄小鼠。这些观察引起这两种RV株之间关系和微细改变的潜在影响的疑 问。根据全病毒基因组序列比较，ERA和SAD-B19共享极高的核苷酸同一性和氨基酸同源性。 为了阐明狂犬病病毒这些尚度相关株的免疫原性和致病性的遗传基础，开发出一种针对 ERA的有效反向遗传系统，其不同于先前报道的针对狂犬病病毒的反向遗传系统。
[0221] 此处公开的狂犬病反向遗传系统可用于各种目的，包括：（1)以指定方式减毒ERA 病毒用于疫苗开发；（2)产生ERA病毒载体用于表达异源0RF(例如，在治疗组合物的情况下， 例如疫苗和基因治疗）；（3)确定ERA RV发病机理的遗传基础;和(4)确定ERA和SAD病毒之间 遗传差异的生物学影响。
[0222] 反向遗传系统具有下列特征中的一些或者全部，利用示范性ERA株反基因组cDNA， 示意性图示于图1A。
[0223] 该系统基于一个全长转录质粒外加多个辅助质粒(例如，5个辅助质粒）。辅助质粒 编码N、P、L蛋白，和任选的G蛋白，以及T7聚合酶。尽管G蛋白不是病毒拯救必需的，但当包括 在转染中时，它改善病毒恢复效率或者病毒出芽。
[0224] 转录涉及细胞RNA依赖性RNA聚合酶II，其是哺乳动物细胞中现有的，和T7RNA聚合 酶，其由PNLST7质粒提供。这两种聚合酶使病毒恢复率又高又稳定。
[0225] 在转录质粒中，锤头和丁型肝炎病毒核酶在狂犬病病毒（例如，ERA株)反基因组 cDNA的侧翼，通过转录能够产生可靠的反基因组vRNA的5'和3'末端。将锤头序列的前10个 核苷酸设计成与反义基因组序列的前10个核苷酸互补。例如，对于ERA反基因 cDNA来说，锤 头序列的前10个核苷酸是:TGTTAAGCGT(SEQ ID N0:19)。
[0226] 已经建立两种修饰的T7RNA聚合酶构建体，它们比先前应用的野生型T7RNA聚合酶 更有效地支持病毒恢复。一种T7RNA聚合酶已经从第一个ATG突变到AT。第二种T7RNA聚合酶 具有源自SV40病毒大T抗原的八氨基酸核定位信号(NLS)，融合在亲代T7的第一个ATG后： ATG CCA AAA AAG AAG AGA AAG GTA GAA(SEQ ID NOJOhNLS有下划线。NLS的添加导致 T7RNA聚合酶主要存在于细胞核中。按照NLS修饰质粒的转染机理，DNA/转染剂复合物与细 胞表面结合。通过胞吞作用，复合物被摄入内体/溶酶体，DNA被释放入胞浆。在没有NLS的情 况下，大多数转染的质粒保留在胞浆中，只有小百分比释放的DNA到达细胞核，在那里其转 录成RNA。在蛋白合成后，NLST7RNA聚合酶被转运回细胞核，细胞核中的辅助质粒(含T7/CMV 启动子)将通过NLST7和细胞聚合酶II转录。因此，更多辅助质粒的mRNA和全长pTMF的cRNA 或者其衍生物被合成，引起高效的病毒恢复。
[0227] 在NLST7通过CMV启动子的初始表达后，NLST7聚合酶结合pT7进行NLST7基因的转 录。通过在细胞核中转录物的修饰，更多NLST7mRNA被合成，引起NLST7聚合酶的更多表达。 NLST7聚合酶以及全长反基因组转录单位的pT7受NLST7聚合酶的控制，其充当"自身基因"。 NLST7RNA聚合酶的自身基因机理图示于图2。在T7RNA聚合酶在细胞核中表达后，转染的Τ7 构建体继续转录全长RNA模板用于Ν蛋白包装和/或L蛋白结合，增强病毒恢复效率。
[0228] Τ7聚合酶，和所有其他质粒，除了编码Ν蛋白的质粒ρΤΝ外，都处于CMV和Τ7转录调 控元件二者的控制之下。编码Ν蛋白的核酸受Τ7启动子控制，并基于IRES (Internal Ribosome Entry Site，内部核糖体进入位点）按照帽-非依赖性的方式被翻译。如果所有质 粒在CMV启动子（19)的控制下克隆，则细胞RNA聚合酶II独自就可以辅助RV的恢复。在此处 公开的ERA反向遗传系统中，只有ρΤΝ受T7启动子控制并以帽-非依赖性的方式翻译。所有其 他构建体受CMV和T7转录调控元件二者的控制。通常，在RV中，N合成是丰富的，N、P和L之间 的比例是大约50:25:1。为了在RV反向遗传中模拟野生型病毒转录和组装，N表达应该是最 高的。借助于NLST7聚合酶和IRES翻译模式，质粒转染后N蛋白被有效表达。这减少了与宿主 细胞中持家基因对转录的竞争，因为哺乳动物细胞中不存在T7转录起始信号，并导致T7转 录效率的增加。
[0229] 为了增强病毒蛋白的产生，可以构建辅助质粒以掺入Kozak序列，为了每种蛋白编 码序列的翻译效率，所述Kozak序列已经优化。示范性的优化Kozak序列显示于表2。
[0230] 表2:优化的Kozak序列.
[0231]
[0232] CMV/T7表示CMV启动子在pT7启动子之前。HdRz代表锤头核酶，而HDVRz是丁型肝炎 病毒核酶。pTMF是全长转录质粒，？了1?]\^、?]\?、?]^和?13了7是辅助质粒。
[0233] 在ERA反向遗传系统中转染5天后，拯救的病毒可靠和可重复地(repatably)生长 到107ffu/ml，无需进一步扩增。
[0234] X.衍生病毒
[0235]狂犬病病毒致病性的完整机理还没有被完全表征，使得合理的疫苗设计成问题。 例如，RV糖蛋白看来在狂犬病病毒的致病性和免疫原性中起作用。突变(例如在糖蛋白的 333位)产生在成年小鼠中不造成致命感染的病毒（Ito等人，Microl. Immunol .38,479-482， 1994 ;Ito等人，J. Virol. 75,9121-9128,2001)。但是，已经显示RV糖蛋白的过表达引起凋亡 和抗病毒免疫应答的增强(Faber等人，J. Virol. 76,3374-3381，2002)。因此具有修饰（例 如，去除，氨基酸取代)的G蛋白的ERA病毒株可以是用于疫苗开发的特定毒株。
[0236] 利用此处公开的反向遗传系统，可以设计出具有有利性质的重组狂犬病病毒。在 亲代ERA株以外，此处公开的示范性重组病毒还包括，无 Psi-区的ERA(ERA-)，ERAgreenl (在 Psi-区插入的绿色荧光基因），ERAgreen2(在P-Μ基因间区域克隆的绿色荧光基因），ERA2g (在Psi-区包含G的额外拷贝），ERAg3(G在333位氨基酸处突变），ERA2g3(在Psi-区包含突变 G的额外拷贝），ERAgm(在基因组中Μ和G基因互换），和ERAgmg (在重排的ERAgm构建体中G的 两个拷贝）。这些示范性株示意性图解于图3。
[0237] 具有去除和/或突变的糖蛋白的修饰株特别适合用作免疫原性组合物，用于狂犬 病病毒的接触前和后的治疗，因为这类病毒不能在细胞之间传播和造成疾病。此外，修饰的 病毒例如ERA2g3,其因为编码突变糖蛋白的序列的加倍而过表达G蛋白，被预测增强凋亡并 引发增强的抗病毒免疫应答。
[0238] 例如，小鼠脑内和肌内接种G缺失(ERA-G)后，没有观察到不良事件。此外，ERA-G保 护小鼠免受RV街毒株的致命攻击。因此，ERA-G看起来是用于疫苗开发的ERA的更安全的株。 此外，ERA G氨基酸333位的精氨酸突变为谷氨酸(从核苷酸AGA到GAG，和在ERAg3和ERA2g3 株中一样），产生一种减毒病毒。减毒作用通过动物接种试验得到证实。因为RV G的过表达 引起凋亡和抗病毒免疫应答的增强，减毒病毒例如具有多拷贝G的ERA2g3作为疫苗候选物 特别有利。
[0239] 此处描述的用于狂犬病疫苗开发的系统不限于G基因的修饰，而是可类似地应用 于每种病毒蛋白。为了促进修饰不同蛋白组分的系统化方法，根据此处提供的序列数据，通 过反向遗传学可以解决致病性的详细定位。
[0240]此处描述的反向遗传系统还使狂犬病病毒载体系统能够用于外源(异源）的基因 表达。所述的非限制性实施方式是基于ERA病毒。在整合到ERA RV基因组后，此处显示的额 外转录单位是在两个不同位置起作用的。在一个实施方式中，额外转录单位整合到psi区的 位置(trans 1)中。在另一个实施方式中，额外转录单位被插入RV P-Μ基因间区域。
[0241 ] 在单链负性RNA病毒中，基因组3 '末端序列主要作为转录启动子，而基因组5 '末端 序列作为复制启动子(Conzelmann和Schnel 1，J.Virol.68:713-719，1994; Finke等人， J. Virol. 71:7281-7288,1997)。因此，trans2占据了导致比transl更强转录的位置，所述转 录驱动0RF表达。因此，此处公开的载体可用于调节异源0RF的表达到所需水平，只需通过选 择0RF插入载体的位置。例如，当需要蛋白的高水平表达时，trans 2通常是异源0RF插入的 理想位置。类似地，如果需要更适中水平的表达，异源0RF可以插入trans 1。无需过度实验， 本领域技术人员就能确定对于每个0RF和特定应用来说的最适表达水平。
[0242]因此，此处提供的病毒载体是用于外源基因插入和表达的优异构建体，正如此处 根据绿色荧光蛋白基因的表达所证实的那样。尽管所公开的载体的功用和效果是针对GFP 进行证实的，但是应注意到该载体同样适用于表达感兴趣的任何基因或者0RF。
[0243]如所述，此处提供的基于狂犬病的异源表达系统可用于表达任何外源（异源）蛋 白。尤其预期，举例来说，这类异源基因来自于另一种病原生物，例如其他致病性病毒，例如 SARS病毒，Nipah病毒，等等。此外，公开的载体可以用于输送其他治疗基因，包括例如，编码 具有治疗价值的蛋白或者功能RNA分子，例如siRNAs。
[0244] XI.药物和免疫刺激组合物及其用途
[0245] 药物组合物包括减毒的或者固定的拯救病毒，包括至少一个病毒表位的病毒核酸 序列或者病毒多肽也包括在本公开中。这些药物组合物包括治疗有效量的一种或者多种活 性化合物，例如减毒或者固定病毒，包含至少一个病毒表位的病毒多肽，或者一种或者多种 编码这些多肽的核酸分子，与药学上可接受的载体结合。预期在某些实施方式中，包括多个 病毒表位的病毒核酸序列或者病毒多肽将用于制备本公开的药物组合物。
[0246] 此处公开的是适合用作免疫刺激组合物的物质，所述组合物用于病毒感染的抑制 或者治疗(接触前或者接触后），例如，狂犬病病毒感染。
[0247] 在一个实施方式中，免疫刺激组合物包含减毒的或者固定的拯救(重组)病毒。在 另一个实施方式中，组合物包含分离的或者重组的病毒多肽，所述多肽包括至少一种病毒 表位(例如狂犬病病毒G蛋白）。在另一个实施方式中，免疫刺激组合物包含一种核酸载体， 所述载体包括至少一种此处描述的病毒核酸分子，或者包括编码至少一种病毒表位的核酸 序列。在一个特定的、非限制性实施例中，编码至少一种病毒表位的核酸序列在一个翻译单 位中表达，例如那些描述于公开的PCT申请PCT/US99/12298和PCT/US02/10764(两篇均在此 完整引入）。
[0248] 免疫刺激病毒、病毒多肽、编码这类多肽的构建体或者载体，与药学上可接受的载 体或者赋形剂组合，用于作为免疫刺激组合物施用于人或者动物对象。
[0249] 免疫原性制剂可以方便地作为单位剂型，并利用常规药物技术制备。这类技术包 括将活性成分和药物载体或者赋形剂结合的步骤。通常，通过将活性成分与液体载体均匀