括编码噬菌体T7 RNA聚合酶(T7)的质粒，其可以通过添加核定 位信号(NLS)进行修饰，以增加转染细胞的细胞核中T7聚合酶的表达。T7 RNA聚合酶表达质 粒被构建为"自身基因"，其在转染到细胞中之后转录全长的病毒反基因组cRNA用于核蛋白 包装。
[0082] 反向遗传系统可用于设计和制备用于狂犬病病毒治疗(接触前和/或后）的免疫原 性组合物，和用于制备表达外源开放阅读框(0RF)的狂犬病病毒ERA载体。例如，额外转录单 位可以被设计、检测并在Psi-区和/或磷蛋白（P)_基质(M)蛋白基因间区域处整合到ERA基 因组中。基本上任何感兴趣的0RF都可以在ERA载体的环境中表达，包括编码病毒抗原和其 他病原体的0RF，例如其他狂犬病病毒属的抗原，以及用于表达其他治疗感兴趣的蛋白。
[0083] 因此，此处公开的方法和组合物可用于设计和制备狂犬病病毒免疫原性组合物， 包括适合作为疫苗的组合物，所述疫苗用于狂犬病病毒接触前和/或后的治疗。
[0084] II.缩写
[0085] ADE 抗体依赖性增强
[0086] Ag-ELISA 抗原-捕获 ELISA
[0087] DNA 脱氧核糖核酸
[0088] ERA 狂犬病病毒株 Evelyn-Rokitnicki-Abelseth
[0089] ELISA 酶联免疫吸附分析
[0090] G 糖蛋白
[0091] i.c. 脑内
[0092] IFA 间接免疫-荧光分析
[0093] i.m. 肌内
[0094] L RNA依赖性RNA聚合酶
[0095] Μ 基质蛋白
[0096] mAb 单克隆抗体
[0097] N 核蛋白
[0098] 0RF 开放阅读框
[0099] P 磷蛋白
[0100] PCR 聚合酶链式反应
[0101] RACE cDNA末端5'快速扩增
[0102] RNA 核糖核酸
[0103] RNP 核糖核蛋白
[0104] RT-PCR 逆转录-聚合酶链式反应
[0105] RV 狂犬病病毒
[0106] transl 额外转录单位1
[0107] trans2 额外转录单位2
[0108] III.术语
[0109] 除非另有解释，所有此处使用的技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通 技术人员通常所理解的相同。类似地，除非另作注解，技术术语根据常规用法使用。分子生 物学常见术语的定义可以参见Benjamin Lewin,基因 V(Genes V)，0xford University Press出版，1994(ISBN 0-19-854287-9) ;Kendrew等人（编著），分子生物学全编（The Encyclopedia of Molecular Biology)，Blackwell Science Ltd.出版，1994(ISBN 〇-632-02182-9);和Robert A.Meyers(编著），分子生物学和生物技术:综合参考(Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference),VCH Publishers,Inc. 出版，1995(ISBN 1-56081-569-8)。
[0110] 单数术语"a"、"an"和"the"包括复数指代，除非上下文另有明确指示。类似地，单 词"或"意在包括"和"，除非上下文另有明确指示。因此"包括A或者B"意思是包括A，或者B， 或者A和B。还应了解，对于核酸或者多肽给出的所有碱基大小或者氨基酸大小，和分子量或 者分子质量值，都是近似的，提供来说明。
[0111] 为了有助于浏览本发明的不同实施方式，提供下列专用术语的解释：
[0112] 佐剂:非特异性增强针对抗原的免疫应答的物质。Singh等人综述了在人类中使用 的疫苗佐剂的发展(Nat .Biotechnol. 17:1075-1081，1999)，在其出版时公开了铝盐和MF59 微乳剂是仅有的被批准用于人的疫苗佐剂。
[0113]扩增:核酸分子的扩增(例如，DNA或者RNA分子)是指一种实验技术的使用，该技术 增加样品中核酸分子的拷贝数。一个扩增的实例是聚合酶链式反应(PCR)，其中在允许引物 与样品中核酸模版杂交的条件下，样品接触寡核苷酸引物对。引物在合适的条件下延伸，从 模板解离，再退火，延伸，再解离以扩增核酸的拷贝数。扩增产物可以利用电泳、限制性核酸 内切酶切割模式、寡核苷酸杂交或者连接、和/或核酸测序这类技术进行表征。
[0114]扩增方法的其他实例包括链置换扩增，如美国专利5，744，311所公开;无转录等温 扩增，如美国专利6，033，881所公开;修复链式反应扩增，如W0 90/01069所公开;连接酶链 式反应扩增，如EP-A-320，308所公开；间隙填补连接酶链式反应扩增，如美国专利5，427， 930所公开;和NASBA?无 RNA转录扩增，如美国专利6，025，134所公开。扩增方法可以改变，包 括例如通过其他的步骤或者将扩增与另一个方案联合。
[0115] 动物:活的多细胞脊椎生物体，包括例如哺乳动物和鸟类的范畴。术语哺乳动物包 括人和非人哺乳动物。类似地，术语"对象"包括人类和兽类对象，例如，人，非人灵长类，狗， 猫，马，和牛。
[0116] 抗体:一种蛋白（或者蛋白复合物），包括基本上由免疫球蛋白基因或者免疫球蛋 白基因片段编码的一种或者多种多肽。识别的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、3、 ￡和以恒定 区基因，以及众多的免疫球蛋白可变区基因。轻链被分为κ或者λ。重链被分为γ、μ、α、δ或者 ε，分别依次定义免疫球蛋白类型，IgG，IgM，IgA，IgD和IgE。
[0117] 基本的免疫球蛋白（抗体)结构单位通常是四聚体。每个四聚体由多肽链的两个相 同对组成，每个对具有一个"轻"（大约25kDa)链和一个"重"（大约50-70kDa)链。每条链的N-末端确定一个大约100到110或者更多氨基酸的可变区，主要负责抗原识别。术语"可变轻 链"（I)和"可变重链"（Vh)分别指代这些轻链和重链。
[0118]此处使用的术语"抗体"包括完整的免疫球蛋白以及许多明确表征的片段。例如， 结合革巴蛋白（或者在蛋白或者融合蛋白内的表位）的Fabs，Fvs和单链Fvs(SCFvs)也是所述 蛋白（或者表位）的特异结合剂。这些抗体片段如下所示：（l)Fab，通过用木瓜蛋白酶消化整 个抗体产生的包含抗体分子的单价抗原结合片段的片段，产生完整的轻链和一种重链的一 部分；（2)Fab'，通过用胃蛋白酶处理整个抗体然后还原获得的抗体分子片段，产生完整的 轻链和一部分重链;每个抗体分子得到两个Fab '片段；（3) (Fab '）2，通过用胃蛋白酶处理整 个抗体而没有后续的还原得到的抗体片段；（4)F(ab'）2,通过两个二硫键连接在一起的两 个Fab'片段的二聚体；（5)Fv，包含轻链可变区和重链可变区、表达为两条链的遗传工程片 段;和(6)单链抗体，一种包含轻链可变区和重链可变区的遗传工程分子，通过合适的多肽 接头连接为基因融合的单链分子。制备这些片段的方法是常规的（参见，例如，Harlow和 Lane,抗体应用：实验室手册（Using Antibodies:A Laboratory Manual)，CSHL,New York, 1999)〇
[0119] 本公开方法和组合物中使用的抗体可以是单克隆或者多克隆的。仅仅举例来说， 单克隆抗体可以根据Kohler和Mi lstein(Nature256:495-97，1975)的传统方法或者其衍生 方法从鼠类杂交瘤制备。单克隆抗体制备的详细步骤描述于Harlow和Lane,抗体应用:实验 室手册（Using Antibodies:A Laboratory Manual)，CSHL,New York, 1999。
[0120] 抗体结合亲合力：单一抗体结合位点和配体(例如，抗原或者表位)之间结合的强 度。抗体结合位点X对配体Y的亲合力表示为解离常数(Kd )，这是占据溶液中存在的一半X结 合位点所需的Y浓度。较小(Kd)表明X和Y之间较强或者较高的亲合力相互作用，并且占据位 点需要的配体浓度较低。通常，抗体结合亲合力受到互补位识别的表位中一个或多个氨基 酸的改变、修饰和/或取代的影响。
[0121] 在一个实例中，在Ag-ELISA分析中通过终点滴定测量抗体结合亲合力。如果与未 改变的表位相比，针对修饰/取代表位的特异抗体的终点滴度相差至少4倍，例如至少10倍， 至少100倍或者更大，则通过修饰和/或取代互补位识别的表位中的一个或者多个氨基酸， 抗体结合亲合力显著降低(或者可测量地降低）。
[0122] 抗原：能够刺激动物抗体产生或者T细胞应答的化合物、组合物或者物质，包括注 射或吸收到动物中的组合物。抗原与特异性体液或者细胞免疫的产物反应，包括那些被异 源免疫原诱导的产物。在一个实施方式中，抗原是病毒抗原。
[0123] 减毒：在活病毒的情况下，例如狂犬病病毒，如果病毒感染细胞或者对象的能力 和/或其致病的能力降低(例如，消除），则该病毒被减毒。通常，在给具有免疫能力的对象施 用后，减毒病毒至少保留一些引发免疫应答的能力。在一些情况下，减毒病毒能够引发保护 性免疫应答而不引起任何感染的征象或者症状。
[0124] 结合或者稳定结合:如果足量的寡核苷酸形成碱基对或者与其靶核酸杂交，则寡 核苷酸与靶核酸结合或者稳定结合，以允许对所述结合的检测。通过靶:寡核苷酸复合物的 物理或者功能特性可以检测结合。靶和寡核苷酸之间的结合可以利用本领域技术人员已知 的任何方法进行检测，包括功能或者物理结合分析。通过检测结合是否对生物合成过程例 如基因表达、DNA复制、转录、翻译等等有可观察到的影响，可以对结合进行功能检测。
[0125] 检测DNA或者RNA互补链结合的物理方法是本领域公知的，这类方法包括DNase I 或者化学足迹法，凝胶迀移和亲合力切割分析，Northern印迹，Southern印迹，点印迹，和光 吸收检测方法。例如，一种广泛使用的方法，因为它如此简单并且稳定，包括当温度缓慢升 高时，在220到300nm处观察溶液光吸收的变化，所述溶液包含寡核苷酸(或者类似物)和靶 核酸。如果寡核苷酸或者类似物与其靶结合，当寡核苷酸(或者类似物)和靶解离或者熔解 时，在特征温度处的吸收突然增加。
[0126] 寡聚物和其靶核酸之间的结合经常表征为温度(Tm)，在该温度下，50%的寡聚物 从其靶熔解。相对于具有较低!^的复合物，较高的1"表示更强或者更稳定的复合物。
[0127] cDNA(互补DNA):-段DNA，缺失内部、非编码段（内含子)和确定转录的调控序列。 在实验室中通过从细胞提取的信使RNA逆转录，合成cDNA。
[0128] 电泳：电泳是在电场影响下，带电荷的溶质或者颗粒在液体介质中的迀移。电泳分 离被广泛用于高分子分析。特别重要的是蛋白和核酸序列的鉴定。这类分离可基于大小或 者电荷的差异。核苷酸序列带有相同的电荷，因此根据大小差异进行分离。电泳可以在无支 持的液体介质中进行(例如，毛细管电泳），但更常见的是液体介质穿行过固相支持介质。最 广泛使用的支持介质是凝胶，例如，聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶。
[0129] 筛分凝胶(例如，琼脂糖)阻碍分子的流动。凝胶孔径决定能够自由流过凝胶的分 子大小。当分子大小增加时，穿过凝胶的时间值也增加。结果，小分子比大分子更快地通过 凝胶，因此在给定时间段内比更大的分子从加样区前进得更远。这类凝胶用于核苷酸序列 基于大小的分离。
[0130] 线性DNA片段迀移通过琼脂糖凝胶，其迀移率与它们分子量的loglO成反比。通过 利用具有不同琼脂糖浓度的凝胶，能够分辨不同大小的DNA片段。较高浓度的琼脂糖有利于 小DNA的分离，而低琼脂糖浓度能够分辨更大的DNA。
[0131] 表位:抗原决定簇。这些是特定化学基团，例如分子上的连续或者非连续的肽序 列，所述基团是抗原性的，即引发特异性免疫应答。基于抗体的三维结构和匹配(或者同源） 的表位三维结构，抗体结合特定抗原表位。
[0132] "取代表位"包括在表位中的至少一种结构取代，例如一个氨基酸取代另一个。
[0133] 杂交:寡核苷酸和它们的类似物通过互补碱基之间的氢键合杂交，包括Watson-Crick，Hoogsteen或者反向Hoogsteen氢键合。通常，核酸由含氮碱基组成，所述含氮碱基是 嘧啶(胞嘧啶(C)，尿嘧啶(U)，和胸腺嘧啶（T))或者嘌呤(腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G))。这些含 氮碱基在嘧啶和嘌呤之间形成氢键，嘧啶与嘌呤的成键称为"碱基配对"。更具体地，A与T或 者U形成氢键，G与C形成键。"互补"是指在不同的核酸序列或者相同核酸序列的两个不同区 域之间发生的碱基配对。
[0134] "可特异杂交"和"特异互补"是表明互补性的足够程度使得在寡核苷酸(或者其类 似物)和DNA或者RNA靶之间发生稳定和特异结合的术语。寡核苷酸或者寡核苷酸类似物无 需与其靶序列100 %互补以便可特异杂交。当寡核苷酸或者类似物与靶DNA或者RNA分子的 结合干扰靶DNA或者RNA的正常功能时，寡核苷酸或者类似物是可特异杂交的，在需要特异 结合的情况下，例如在体内分析或者系统中的生理条件下，存在足够程度的互补性以避免 寡核苷酸或者类似物与非靶序列的非特异结合。这类结合称为特异杂交。
[0135] 根据所选杂交方法和组合物的性质和杂交核酸序列的长度，杂交条件导致的特定 严谨程度是不同的。通常，杂交温度和杂交缓冲液的离子强度(尤其是Na+和/或Mg ++浓度)将 决定杂交的严谨性，尽管洗涤时间也影响严谨性。关于达到特定严谨程度所需的杂交条件 的计算论述于Sambrook等人（编著），分子克隆：实验室手册第二版1-3册（Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd ed.，vol · 1-3)，9和 11 章节，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor,NY, 1989，；和Ausubel等人分子生物学简编第四 版（Short Protocols in Molecular Biology,4th ed.)，John Wiley&Sons，Inc.，1999〇
[0136] 对于本公开来说，"严谨条件"包括如下条件，即在该条件下杂交只在杂交分子和 靶序列之间的错配小于25%的情况下发生。为了更精确的定义，"严谨条件"可以分解为特 定水平的严谨性。因此，此处使用的"适度严谨"条件是指序列错配大于 25%的分子不会杂 交的条件；"中等严谨"条件是指错配大于15%的分子不会杂交的条件，而"高度严谨"条件 是指错配大于10%的序列不会杂交的条件。"非常高度的严谨"条件是指错配大于6%的序 列不会杂交的条件。
[0137] "特异杂交"是指当所述序列存在于复杂混合物(例如，总细胞DNA或者RNA)中时， 分子只与或者基本上只与特定核苷酸序列结合、形成双链或者杂交。特异杂交也可能在不 同严谨条件下发生。
[0138] 免疫刺激组合物:此处使用的术语是指用于刺激或者引发脊椎动物特异性免疫应 答(或者免疫原性应答)的组合物。免疫刺激组合物可以是蛋白抗原或者用于表达蛋白抗原 的质粒载体。在一些实施方式中，免疫原性应答是保护性的或者提供保护性免疫，从而它使 脊椎动物能够更好抵抗来自免疫刺激组合物针对的生物体的感染或者疾病进展。
[0139] 不希望受到特定理论的约束，认为免疫刺激组合物诱导的免疫原性应答可能起于 抗体的产生，所述抗体对免疫刺激组合物提供的一种或者多种表位特异。或者，该应答可能 包括基于T-辅助细胞或者细胞毒性细胞的应答，所述应答针对免疫刺激组合物提供的一种 或者多种表位。所有这3种应答可能源于幼稚或者记忆细胞。这类免疫刺激组合物的一个特 定实例是疫苗。
[0140] 在一些实施方式中，免疫刺激组合物的"有效量"或者"免疫-刺激量"是当施用于 对象时足够引起可检测的免疫应答的量。这类应答可能包括，例如，对免疫刺激组合物提供 的一种或者多种表位特异的抗体的产生。或者，该应答可能包括基于T-辅助细胞或者CTL的 应答，所述应答针对免疫刺激组合物提供的一种或者多种表位。所有这3种应答可能源于幼 稚或者记忆细胞。在其他实施方式中，免疫刺激组合物的"保护有效量"是当施用于对象时 足够赋予对象保护性免疫的量。
[0141] 抑制或者治疗疾病：例如在处于患病风险的对象中抑制疾病或者病症的完全发 展。疾病的一个特定实例是狂犬病。"治疗"是指疾病或病理状态开始发展后，改善其征象或 者症状或者病理病症的治疗介入。就疾病、病理状况或者症状而言，此处使用的术语"改善" 是指任意可观察到的治疗的有益作用。有益作用可以证明，例如，通过在易感对象中疾病临 床症状的延迟发作，疾病的一些或者全部临床症状的严重程度减轻，疾病的进展减慢，疾病 的复发次数减少，对象的整体健康或者康复改善，或者通过本领域公知的对特定疾病特异 的其他参数。
[0142] 分离的："分离的"或者"纯化的"生物组分(例如核酸，肽，蛋白，蛋白复合物，或者 颗粒)已经从组分天然存在的生物体细胞中的其他生物学组分中，即其他染色体和染色体 外DNA和RNA和蛋白中，被基本上分离、分离产生或者纯化。因此"分离的"或者"纯化的"核 酸、肽和蛋白包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白。该术语还包含在宿主细胞中利用 重组表达制备的核酸、肽和蛋白，以及化学合成的核酸或者蛋白。术语"分离的"或者"纯化 的"并不需要绝对的纯度;它只是用来作为一个相对术语。因此，例如，分离的生物学组分是 其中生物学组分比在细胞内其自然环境或者其他生产容器中的生物学组分更富集的生物 学组分。优选的，制品被纯化使生物学组分代表制品的全部生物学组分含量的至少50%，例 如至少70%，至少90%，至少95%或者更多。
[0143] 标记:一种可检测的化合物或者组合物，其与另一个分子直接或者间接结合以促 进该分子的检测。标记的特定、非限制实例包括荧光标签，酶连接物，和放射性同位素。
[0144] 核酸分子:核苷酸的多聚形式，包括RNA、cDNA、基因组DNA和上述的合成形成和混 合聚合物的有义和反义链。核苷酸是指核糖核苷酸、脱氧核苷酸或者任一种类型核苷酸的 修饰形式。此处使用的术语"核酸分子"与"核酸"和"多核苷酸"同义。核酸分子通常至少长 10个碱基，除非另作说明。该术语包括DNA的单链和双链形式。多核苷酸可以包括连接在一 起天然存在的或者修饰的核苷酸的任一种或者两者，通过天然存在和/或非天然存在的核 苷酸连接进行连接。
[0145]寡核苷酸:一种核酸分子，通常包括300个碱基或者以下的长度。尤其是，该术语经 常是指单链脱氧核糖核苷酸，但它也可以指单链或者双链核糖核苷酸，RNA:DNA杂交和双链 DNA。术语"寡核苷酸"还包括寡聚核苷(oligonucleosides)(也就是说，去除磷酸盐的寡核 苷酸)和任何其他的有机碱基聚合物。
[0146] 一些实例中，寡核苷酸长度为大约10到大约90个碱基，例如，长度为12，13，14，15， 16,17,18,19或20个碱基。其它寡核苷酸长度为大约25,大约30,大约35,大约40,大约45,大 约50，大约55，大约60个碱基，大约65个碱基，大约70个碱基，大约75个碱基或者大约80个碱 基。寡核苷酸可以是单链的，例如，用作探针或引物，或者可以是双链的，例如，用于突变体 基因的构建。寡核苷酸可以是有义或反义寡核苷酸。寡核苷酸可以按照上述关于核酸分子 的论述来修饰。寡核苷酸能够从现有的核酸来源(例如，基因组或cDNA)获得，但是也能够是 合成的(例如，通过实验室或者体外寡核苷酸合成来生产）。
[0147]开放阅读框(0RF):编码氨基酸的一系列核苷酸三联体(密码子），没有任何内部终 止密码子。这些序列通常可翻译为肽/多肽/蛋白/多蛋白。
[0148]本领域已识别下列密码子(显示为RNA)可以互换地用于编码各特定氨基酸或者终 止:丙氨酸(Ala 或者 A)GCU，GCG，GCA，或者 GCG;精氨酸(Arg 或者 R) CGU，CGC，CGA，CGG，AGA，或 者AGG;天门冬酰胺(Asn或者N)AAU或者AAC;天冬氨酸(Asp或者D)GAU或者GAC;半胱氨酸 (Cys或者C)UGU或者UGC;谷氨酸(Glu或者E )GAA或者GAG;谷氨酰胺(Gin或者Q) CAA或者CAG; 甘氨酸(Gly或者6)661]，66(：，664，或者666;组氨酸(把8或者!〇041]或者04(：;异亮氨酸(11 6或 者I )AUU，AUC，或者AUA;亮氨酸（Leu或者L)UUA，UUG，CUU，CUC，CUA，或者CUG;赖氨酸（Lys或 者K)AAA或者AAG;甲硫氨酸(Met或者M)AUG;苯丙氨酸(Phe或者F)UUU或者UUC;脯氨酸(Pro 或者 P) CCU，CCC，CCA，或者 CCG;丝氨酸（Ser 或者 S )UCU，UCC，UCA，UCG，AGU，或者 AGC;终止密 码子UAA(赭石）或者UAG(琥珀）或者UGA(蛋白石）；苏氨酸（Thr或者!')4〇]，〇：^04，或者 ACG;酪氨酸(Tyr或者Y)UAU或者UAC;色氨酸(Trp或者W)UGG;和缬氨酸(Val或者V)GUU，GUC， GUA，或者GUG。在每种情况下对于DNA的相应密码子用T取代U。
[0149] 可操作地连接：当第一核酸序列置于与第二核酸序列的功能关系时，第一核