酸序 列与第二核酸序列可操作地连接。例如，启动子可操作地连接到编码序列表示启动子影响 编码序列的转录或者表达。通常，可操作地连接的DNA序列是连续的，并且必要时在相同阅 读框内连接两个蛋白编码区域。如果存在内含子，可操作连接的DNA序列可能不是连续的。
[0150] 互补位:抗体的一部分，负责抗体与抗原上的抗原决定簇(表位)的结合。
[0151] 药学上可接受的载体：用于本公开的药学上可接受的载体是常规的。E.W.Martin 的雷氏药物科学（Remington's Pharmaceuti cal Sciences)第 15版（1975)，，Mack Publishing Co.，Easton,，描述了适于一种或者多种治疗化合物或者分子的药物输送的组 合物和制剂，例如一种或者多种SARS-CoV核酸分子，蛋白或者结合这些蛋白的抗体，和其他 药剂。
[0152] 通常，载体的性质将取决于所使用的特定给药方式。例如，肠胃外制剂通常包括注 射液，所述注射液包括药学上和生理上可接受的液体，例如水、生理盐水、平衡盐溶液、水性 右旋糖、甘油等作为介质。对于固体组合物(例如，粉剂，丸剂，片剂，或者胶囊形式），常规的 无毒固相载体可以包括，例如，药物级的甘露醇，乳糖，淀粉，或者硬脂酸镁。除生物中性载 体外，要给药的药物组合物可以包含少量无毒的辅助物质，例如湿润或者乳化剂，防腐剂， 和pH缓冲剂等等，例如乙酸钠或者脱水山梨醇单月桂酸酯。
[0153] 多肽:一种聚合物，其中单体是通过酰胺键连接在一起的氨基酸残基。当氨基酸是 α_氨基酸时，可以使用L-光学异构体或者D-光学异构体，对许多生物用途来说L-异构体是 优选的。此处使用的术语"多肽"或者"蛋白"旨在包括任意氨基酸分子并包括修饰的氨基酸 分子。术语"多肽"特别旨在涵盖天然存在的蛋白，以及重组或者合成产生的那些蛋白。
[0154] 保守氨基酸取代是指当进行取代时，最少干扰最初蛋白的性质，也就是说，蛋白的 结构、尤其功能是保守的，不会被这种取代显著改变。保守取代的实例如下所示。
[0155]
[0156] 保守取代通常保持(a)取代区域内多肽骨架的结构，例如，片层或者螺旋构象，（b) 分子在靶位点的电荷或者疏水性，或者(c)侧链的体积。
[0157]根据它们的侧链，通常将氨基酸分类为一种或者多种类型，包括极性，疏水性，酸 性，碱性和芳香族的。极性氨基酸的实例包括那些具有侧链功能基团例如羟基、巯基和酰胺 的氨基酸，以及酸性和碱性氨基酸。极性氨基酸包括，不限于，天门冬酰胺，半胱氨酸，谷氨 酰胺，组氨酸，硒代半胱氨酸，丝氨酸，苏氨酸，色氨酸和酪氨酸。疏水性或者非极性氨基酸 的实例包括那些具有非极性脂肪族侧链的残基的氨基酸，例如，不限于，亮氨酸，异亮氨酸， 缬氨酸，甘氨酸，丙氨酸，脯氨酸，甲硫氨酸和苯丙氨酸。碱性氨基酸残基的实例包括那些碱 性侧链的残基，例如氨基或者胍基基团。碱性氨基酸残基包括，不限于，精氨酸，同聚赖氨酸 和赖氨酸。酸性氨基酸残基的实例包括那些具有酸性侧链功能基团的残基，例如羧基。酸性 氨基酸残基包括，不限于，天冬氨酸和谷氨酸。芳香族氨基酸包括那些具有芳香族侧链基团 的氨基酸。芳香族氨基酸的实例包括，不限于，联苯基丙氨酸，组氨酸，2-萘基丙氨酸 (napthylalananine)，五氟苯丙氨酸，苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸。注意到一些氨基酸被分 到多于一个组，例如，组氨酸，色氨酸和酪氨酸被分类为极性和芳香族氨基酸。被分类到上 述各组的其他氨基酸是本领域普通技术人员已知的。
[0158] 通常预期产生蛋白性质最大变化的取代将是非保守性的，例如在以下方面的变化 (a)亲水性残基，例如，丝氨酰或者苏氨酰取代(或者被取代)疏水性残基，例如，亮氨酰，异 亮氨酰，苯丙氨酰，缬氨酰或者丙氨酰；（b)半胱氨酸或者脯氨酸取代(或者被取代)任意其 他残基；（c)具有正电性侧链的残基，例如，赖氨酰，精氨酰，或者组胺酰(histadyl)，取代 (或者被取代)负电性的残基，例如，谷氨酰或者天冬氨酰基;或者(d)具有庞大侧链的残基， 例如，苯丙氨酸，取代(或者被取代)没有侧链的残基，例如，甘氨酸。
[0159] 探针和引物:探针包括连接于可检测的标记物或者其他报告分子的分离核酸分 子。典型标记物包括放射性同位素，酶底物，辅因子，配体，化学发光或者荧光剂，半抗原和 酶。标记方法和选择适合于不同目的的标记物的指导论述于，例如Sambrook等人编著），分 子克隆：实验室手册第二版 1-3册（Molecular Cloning:A Laboratory Manual ,2nd ed·， vol.1-3),Cold Spring Harbor Laboratory Press ,Cold Spring Harbor,NY,1989和 Ausubel等人的分子生物学简编第四版（Short Protocols in Molecular Biology,4th ed.),John ffiley&Sons, Inc.,1999〇
[0160] 引物是短的核酸分子，例如6个核苷酸以上长度的DNA寡核苷酸，例如与连续互补 核苷酸或者待扩增的序列杂交的寡核苷酸。更长的DNA寡核苷酸可以是大约10,12,15，20， 25,30或者50个核苷酸以上的长度。引物可以通过核酸杂交与互补靶DNA链退火，在引物和 靶DNA链之间形成杂交，然后引物通过DNA聚合酶沿着靶DNA链延伸。引物对可以用于核酸序 列的扩增，例如，通过聚合酶链式反应(PCR)或者本领域已知的其他核酸扩增方法。扩增的 其他实例包括链替代扩增，如美国专利5,744,311所公开;无转录等温扩增，如美国专利6， 033，881所公开;修复链式反应扩增，如W0 90/01069所公开;连接酶链式反应扩增，如EP-A-320 308所公开；间隙填补连接酶链式反应扩增，如5，427，930所公开;和NASBA?无 RNA转录 扩增，如美国专利6,025,134所公开。
[0161] 制备和使用核酸探针和引物的方法描述于例如Sambrook等人(编著）的分子克隆： 实验室手册第二版 1_3册（Molecular Cloning:ALaboratory Manual ,2nd ed.，vol. 1-3)， Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY, 1989;Ausubel等人的 分子生物学简编第四版（Short Protocols in Molecular Biology，4th ed).，John Wiley& Sons, Inc.,1999;和Innis等人的PCR教程-方法和应用指导（PCR Protocols,A Guide to Methods and Applications)，Academic Press，Inc.，San Diego,CA, 1990。扩增引物对可 以来源于已知序列，例如，通过利用用于该目的的计算机程序例如Primer(Version 0 · 5，? 1991，Whitehead Institute for Biomedical Research,Cambridge,MA)。本领域普通技术 人员了解特定探针或者引物的特异性随其长度而增加。因此，为了获得更高的特异性，可以 选择探针和引物包括靶核苷酸序列的至少20，25，30，35，40，45，50或者更多个连续核苷酸。
[0162] 蛋白：一种生物分子，尤其是多肽，由基因表达并由氨基酸组成。
[0163] 纯化的：术语"纯化的"并不需要绝对的纯度;它用作一个相对术语。因此，例如，纯 化的蛋白制品是其中目标蛋白比其在细胞内自然环境中更纯的蛋白制品。通常，纯化蛋白 制品使得所述蛋白占制品总蛋白含量的至少50%。
[0164]重组核酸:一种核酸分子，其不是天然存在的或者具有一个由序列的两个本来分 离的片段人工组合制备的序列。这种人工组合通过化学合成或者，更常见的，通过核酸分离 片段的人工处理实现，例如，通过遗传工程技术，例如描述于Sambrook等人(编著）的分子克 隆：实验室手册第二版 1_3册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual ,2nd ed.，vol.l_ 3)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY, 1989。术语重组包 括只是通过天然核酸分子一部分的添加、取代或者缺失改变的核酸。
[0165]调控序列或者元件:这些术语通常是指影响或者控制基因表达的一类DNA序列。该 术语包括的是启动子，增强子，基因座控制区（LCR)，绝缘子/临界元件，沉默子，基质结合区 (MAR，还称为支架附着区），阻遏子，翻译终止子，复制起点，着丝粒，和减数分裂重组热点。 启动子是邻近基因5 '端的DNA序列，作为DNA依赖性RNA聚合酶的结合位点，从这里起始转 录。增强子是提高从启动子起始的转录水平的控制元件，通常与增强子方向或者与启动子 的距离无关。对与它们连接的基因的表达，LCRs提供组织特异的和短暂的调节。LCR功能和 它们与基因的相对位置无关，但取决于拷贝数。据认为它们作用于打开核小体结构，从而其 他因子可以结合DNA。LCR还可能影响复制时间和起点的使用。绝缘子（亦称临界元件）是通 过阻断周围染色质的作用，阻止基因转录活化(或者灭活）的DNA序列。沉默子和阻遏子是抑 制基因表达的控制元件;它们对基因的作用与它们的方向或者与基因的距离无关。MAR是结 合核支架的DNA内序列；它们能够通过将染色体分离成调控结构域影响转录。据认为MAR介 导染色体内高级的环结构。转录终止子是基因邻近区域，在此RNA聚合酶从模板释放。复制 起点是在DNA合成或者细胞分裂的复制期基因组开始DNA复制过程的区域。减数分裂重组热 点是基因组比减数分裂期间平均值更频繁重组的区域。
[0166] 复制子:体内作为DNA复制的自主、自我复制单位的任意遗传元件(例如，质粒，染 色体，病毒）。
[0167] 样品：代表整体的一部分、一块或者片段。该术语包括任意物质，包括例如从动物、 植物或者环境获得的样品。
[0168] "环境样品"包括从室内或者室外环境中无生命的物体或者储库(reservoir)中获 得的样品。环境样品包括，但不限于:土壤，水，灰尘和空气样品；大体积样品，包括建筑材 料，家具和垃圾填埋物;和其他储库样品，例如动物垃圾，收获的谷物和食品。
[0169] "生物样品"是从植物或者动物对象获得的样品。此处使用的生物样品包括可用于 检测对象病毒感染的所有样品，包括但不限于:细胞，组织和体液，例如血液;血液的衍生物 和部分(例如血清）；提取的胆汁;活组织切片或者手术去除的组织，包括例如，未固定的、冷 冻的、福尔马林固定的和/或埋入石蜡的组织;泪液;乳汁;皮肤刮擦物;表面冲洗物;尿液； 痰液;脑脊液;前列腺液;脓;骨髓抽吸物;BAL;唾液;子宫颈拭子;阴道拭子;和口咽洗涤物。
[0170] 序列同一性:两个核酸序列或者两个氨基酸序列之间的相似性，根据序列之间的 相似性表达，还称为序列同一性。序列同一性经常根据百分比同一性(或者相似性或者同源 性)来测量;百分比越高，两个序列越相似。
[0171] 用于比较的序列比对方法是本领域公知的。不同的程序和比对算法描述于:Smith 和Waterman(Adv.Appl.Math.，2:482,1981);Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol·,48:443， 1970);Pearson和Lipman(Proc.Natl.Acad·Sci·，85:2444，1988);Higgins和Sharp(Gene， 73:237-44,1988);Higgins和Sharp(CABI0S，5:151-53,1989) ;Corpet等人（Nuc .Acids Res ·，16:10881-90，1988);Huang等人（Comp .Appls · Biosci ·，8:155-65，1992);和Pearson 等人（Meth.Mol .Biol ·，24:307-31，1994) eAltschul等人（Nature Genet ·，6:119-29，1994) 提出了序列比对方法和同源性计算的详细考虑因素。
[0172] 比对工具ALIGN(Myers和Miller，CABI0S 4:11-17，1989)或者^^5了厶（卩63^〇11和 Lipman, 1988)可用于进行序列比较（Internet Program?1996，W.R.Pearson and the University of Virginia, "fasta20u63"version 2.0u63,出厂日期1996年12月hALIGN比 较彼此的完整序列，而LFASTA比较局部相似的区域。在因特网的NCSA站点上现有这些比对 工具和它们各自的教学软件。或者，为了比较大于大约30个氨基酸的氨基酸序列，可以使用 "Blast 2sequences"功能，用默认BL0SUM62矩阵设置为默认参数，（空位开放罚分11，每个 残基空位罚分1)。当比对短肽(少于约30个氨基酸)时，应使用"Blast2sequences"功能进行 比对，采用PAM30矩阵设为默认参数(开放空位9,延伸空位1罚分KBLAST序列比较系统是可 用的，例如，来自NCBI站点；还可参见Altschul等人 J.Mol.Biol.，215:403-10，1990;Gish 和 State s，Nature Genet · ,3:266-72,1993 ;Madden等人，Meth · Enzymol ·，266 :131-41， 1996;Altschul等人，Nucleic Acids Res. ,25:3389-402,1997;和Zhang和Madden,Genome Res.,7:649-56,1997.
[0173] 在一些情况下蛋白的直向同源物(等同于其他种类的蛋白）表征为具有超过75% 的序列同一性，所述序列同一性利用设置到默认参数的ALIGN，与特定蛋白的氨基酸序列进 行全长比对算出。当利用这种方法评估时，与参照序列具有更高相似性的蛋白将显示同一 性的百分比增加，例如至少80%，至少85%，至少90%，至少92%，至少95%，或者至少98% 的序列同一性。此外，可以对已公开的融合蛋白的一个或者两个结合结构域的全长比较序 列同一性。
[0174] 当显著小于完整序列进行序列同一性比较时，同源序列在10-20短窗口（short windows)上将通常具有至少80%的序列同一性，可能具有至少85%，至少90%，至少95%， 或者至少99%的序列同一性，取决于它们与参照序列的相似性。可以使用LFASTA确定这类 短窗口上的序列同一性;方法描述于NCSA站点。本领域技术人员清楚这些序列同一性范围 只提供指导;完全有可能获得超出所提供范围的非常显著的同系物。与对蛋白描述的相同， 相似的同源性概念适用于核酸。两个核酸分子紧密相关的另一种表示是两个分子在严谨条 件下彼此杂交。
[0175] 因为遗传密码的简并性，不显示高度同一性的核酸序列仍可能编码相似的氨基酸 序列。应了解利用这种简并性可以造成核酸序列的变化以产生多重核酸序列，所述多重核 酸序列各编码基本上相同的蛋白。
[0176] 特异结合剂:一种基本上只结合指定靶的试剂。因此蛋白特异结合剂基本上只结 合指定蛋白，或者蛋白内的特定区域。此处使用的蛋白特异结合剂包括基本上结合特定多 肽的抗体和其他试剂。抗体可以是对多肽特异的单克隆或者多克隆抗体，以及其免疫有效 部分（"片段"）。
[0177] 通过使用或者调节常规步骤，可以轻易地确定特异试剂基本上只结合特异多肽。 利用Western印迹步骤的合适的体外分析实例包括IFA和Ag-ELISA，在许多标准文本中有描 述，包括 Harlow 和 Lane,抗体应用：实验室手册（Using Antibodies:A Laboratory Manual)，CSHL，New York,1999。
[0178] 转化："转化"细胞是其中通过分子生物学技术已经导入核酸分子的细胞。该术语 包括可以将核酸分子导入这类细胞的所有技术，包括利用病毒载体转染，利用质粒载体转 化，和通过电穿孔导入裸DNA，脂质体转染，和粒子枪加速。
[0179] 载体:作为导入宿主细胞的核酸分子，从而产生转化的宿主细胞。载体可以包括允 许其在宿主细胞中复制的核酸序列，例如复制起点（参与启动DNA合成的DNA序列）。载体还 可以包括一种或者多种选择性标志基因和其他本领域已知的遗传元件。
[0180] 病毒:在活细胞内复制的微小感染性生物体。病毒通常基本上由一个蛋白被膜包 围的单核酸核组成，具有只在活细胞内复制的能力。"病毒复制"是通过至少一个病毒生活 周期发生的其它病毒的产生。病毒可以摧毁宿主细胞的正常功能，造成细胞表现为病毒决 定的方式。例如，病毒感染可能导致细胞产生细胞因子，或者对细胞因子应答，而未感染的 细胞通常不会这样。
[0181] 尽管与此处描述的相似或者等同的方法和材料可用于本发明的实践或者检验，但 合适的方法和材料在下面描述。所有此处提及的出版物、专利申请、专利和其他参考文献在 此完整引入作为参考。在不一致的情况下，以本说明书为准，包括术语的解释。此外，材料、 方法和实例只是说明性的，而不是为了限制。
[0182] IV.数个实施方式的概述
[0183] 此处第一个实施方式提供的是重组狂犬病病毒基因组，包括SEQ ID Ν0:1(全长 ERA序列)所示的核酸。还提供该基因组编码的分离的狂犬病病毒蛋白，包括包含下列序列 所示的氨基酸序列的特定蛋白：SEQ ID N0:2(N蛋白）；SEQ ID N0:3(P蛋白）；SEQ ID N0:4 (M蛋白）；SEQ ID N0:5(G蛋白）；或者SEQ ID N0:6(L蛋白）；和编码这类蛋白的分离核酸分 子。举例来说，这类分离的核酸分子包括下列所示的核苷酸序列：SEQ ID NO: 1的核苷酸71-1423(N蛋白）；SEQ ID N0:1 的核苷酸 1511-2407(P蛋白）；SEQ ID N0:1 的核苷酸2491-3104 (Μ蛋白）；SEQ ID N0:1的核苷酸3318-4892(G蛋白）；或者SEQ ID N0:1(L蛋白）的核苷酸 5418-11,801〇
[0184] 还提供具有SEQ ID Ν0:7所示核酸序列的重组病毒基因组，其不同于SEQ ID NO: 1，因为在G基因和psi-区之间的polyA tract上缺失一个腺苷残基。SEQ ID NO:7还编码如 SEQ ID NO:2-6所示的蛋白。
[0185] 还提供ERA病毒株衍生物的基因组，如SEQ ID N0:8-18所示。在某些实施方式中， 基因组存在于载体中，例如质粒。
[0186] 另一个描述的实施方式是使用此处描述的方法测序全长狂犬病病毒基因组的系 统。还描述了用于异源蛋白表达的病毒载体系统。
[0187] 另一个实施方式提供包括此处提供的一种或者多种核酸分子，或者一种或者多种 蛋白的组合物。任选的，这类组合物包含药学上可接受的载体，佐剂，或者其两种或更多种 的组合。
[0188] 还提供在对象中引发针对抗原表位的免疫应答的方法，包括给对象导入包括此处 描述的核苷酸、肽或者多肽的组合物，从而在对象中引发免疫应答。
[0189] 本公开的另一个方面涉及用于产生重组狂犬病病毒的载体系统。该载体系统包括 第一载体(转录载体），包含全长狂犬病病毒反基因组DNA(或者其衍生物），和一组辅助载 体，包含编码至少一种狂犬病病毒株ERA蛋白的核酸。转染宿主细胞中载体的表达引起活的 重组狂犬病病毒的产生。在某些实施方式中，反基因组DNA是ERA株(例如，SEQ ID NO: 1或者 SEQ ID N0:7)或者其衍生物，例如SEQ ID N0:8-18中的一种。在某些实施例中，载体是质 粒。
[0190]为了促进全长病毒RNA的恢复，转录载体可以包括，按5'到3'方向：锤头核酶;狂犬 病病毒反基因组cDNA;和丁型肝炎病毒核酶。选择锤头核酶的核苷酸与狂犬病病毒的反义 基因组序列互补。反基因组cDNA的转录受至少一个CMV启动子和噬菌体T7RNA聚合酶启动子 的转录调控，通常是在这两个启动子的控制下。
[0191]辅助载体通常包括包含编码狂犬病病毒N蛋白的多核苷酸序列的载体;包含编码 狂犬病病毒P蛋白的多核苷酸序列的载体;包含编码狂犬病病毒Μ蛋白的多核苷酸序列的载 体;包含编码狂犬病病毒L蛋白的多核苷酸序列的载体;和包含编码噬菌体T7RNA聚合酶的 多核苷酸序列的载体。在一个实施方式中，T7RNA聚合酶包括核定位信号(NLS)。任选的，载 体系统还包括包含编码狂犬病病毒G蛋白的多核苷酸序列的载体。
[0192] 编码狂犬病病毒P、M、L或G蛋白或者Τ7聚合酶的一种或者多种多核苷酸序列的转 录受CMV启动子和T7启动子二者的转录调控。相反，编码狂犬病病毒N蛋白的多核苷酸序列 的转录受T7启动子的转录调控，并且转录是帽-非依赖性的（cap-independent)。
[0193] 另外一种实施方式是活狂犬病疫苗，每种都包括此处提供的重组狂犬病病毒基因 组。这类重组狂犬病基因组的实例包括ERAG333(SEQIDN0 :13)所示序列;ERA2G(SEQID N0:8)所示序列；和此处ERA2G333(SEQIDN0 :10)所示序列。任选的，狂犬病疫苗是减毒的。
[0194] 还提供一种产生活狂犬病病毒(例如，用于免疫原性组合物，例如疫苗）的方法，通 过将载体系统导入宿主细胞。在载体系统转染到合适的宿主细胞中后，活的和任选减毒的 病毒被恢复。通