一种sirtuin6基因缺失人类间充质干细胞的制备方法
【技术领域】
[0001 ]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种SIRTUIN6基因缺失人类间充质干细胞的 制备方法。
【背景技术】
[0002] 人口老龄化是世界尤其是中国面临的日益严峻的社会问题。毋庸置疑，衰老及其 相关疾病已成为国内外科研领域急需突破的热点问题。模式生物的局限性使其无法在理论 和实践层面上应用于人类衰老的基础研究及临床转化，因此新的人类衰老研究模型亟待产 生。成体干细胞的衰老及耗竭被认为是引发个体组织器官衰老以及衰老相关退行性疾病的 重要因素。干细胞是指具有自我更新和分化能力的一类特殊细胞类型，为新的终末分化细 胞提供重要来源。人类组织器官由少量成体干细胞及大量体细胞组成，成体干细胞能够对 组织器官机体的损伤进行修复或再生，有效保持了组织器官及机体的稳态和健康。在衰老 细胞中，干细胞出现功能性衰老或耗竭，干细胞稳态失衡，例如，随着年龄增大，造血干细胞 (Hemopoietic stem cell，HSC)倾向于向髓系细胞分化，向骨髓的迀徙和归巢能力均出现 缺陷，分化能力和效率受到影响，同时老年群体机体免疫力低下，多发粒系增生性疾病。在 帕金森氏症(PD)患者脑内的海马区，神经干细胞在体外出现渐进性多能性消失。间充质干 细胞的耗竭会导致成骨能力变差，骨折后修复困难。成黑素细胞(Melanoblast)的衰老是老 年人头发变白的重要原因。成体干细胞功能衰退影响了骨骼与肌肉的功能。以上多种证据 证实干细胞自我更新和分化潜能的紊乱，是组织器官丧失修复及再生能力的主要因素。
[0003] SIRTUIN是一类NAD+依赖性的、具有高度保守催化酶活性的蛋白家族。哺乳动物中 存在七种SIRTUIN蛋白，分别为SIRTUIN 1-7，各自具有不同的细胞亚定位及功能，其中 SIRTUIN 1-2广泛分布在细胞中，SIRTUIN 3-5主要存在于线粒体，SIRTUIN6-7则仅存在于 细胞核中。SIRTUIN6已经被证明与哺乳动物的衰老相关。在细胞水平，SIRTUIN6缺失导致葡 萄糖及脂代谢、DNA损伤修复、端粒稳定性、基因组稳定性等紊乱而影响细胞稳态，被证明与 细胞衰老、代谢或肿瘤发生相关。在机体水平，SIRTUIN6缺失的小鼠表现出渐进性组织、器 官及机体的过早衰老。在出生后2周内，SIRTUIN6缺失的小鼠与野生型小鼠无显著区别，在 出生后2-4周内，SIRTUIN6缺失的小鼠表现出、脾脏、淋巴系统、脂肪产生、骨骼及脑等内胚 层和神经外胚层的退行性衰退，且于一个月内死亡，暗示了SIRTUIN6与内胚层稳态及衰老 的重要相关性。在SIRTUIN6敲除小鼠的模型中，中胚层来源的组织如:血液、脾脏、骨骼、月旨 肪等会出现异常表型，但目前少有SIRTUIN6在人类组织细胞，尤其是多能干细胞及其衍生 细胞中功能的相关报道，同时间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)又是中胚层中 一种重要的成体干细胞，不仅作为造血细胞提供骨架和营养，还能够分化为脂肪、软骨、成 骨等细胞类型对以上组织的损伤进行修复。
【发明内容】
[0004] 本发明的一个目的是提供一种间充质干细胞的制备方法。
[0005] 本发明提供的间充质干细胞的制备方法包括如下步骤：
[0006] (1)取离体的人多能干细胞，突变所述人多能干细胞中的基因 SIRTUIN6,使所述 SIRTUIN6丧失功能，得到所述SIRTUIN6功能丧失的人多能干细胞；
[0007] (2)对所述SIRTUIN6功能丧失的人多能干细胞进行定向诱导分化，获得所述 SIRTUIN6功能丧失的间充质干细胞。
[0008] 上述方法中，步骤（1)中，所述突变人多能干细胞中的基因 SIRTUIN6为缺失所述人 多能干细胞中的SIRTUIN6的第1外显子。
[0009] 上述方法中，所述缺失人多能干细胞中的SIRTUIN6的第1外显子为将所述人多能 干细胞中的SIRTUIN6的第1外显子替换为筛选标记基因。
[0010] 上述方法中，所述替换是通过同源重组的方式实现，所述同源重组中的上游同源 臂为序列表中序列3;所述同源重组中的下游同源臂为序列表中序列4;
[0011] 所述筛选标记基因为ΝΕ0基因。
[0012]上述方法中，步骤⑴中，缺失所述人多能干细胞中的所述SIRTUIN6的第1外显子 是按照包括如下步骤的方法实现的：
[0013] (al)将序列表中序列3的上游同源臂和序列4所示的下游同源臂构建到含有筛选 基因的表达载体上，获得重组载体;所述筛选基因位于所述上游同源臂和所述下游同源臂 之间；
[0014] (a2)用所述重组载体、SIRTUIN6左、右TALEN表达载体共转染人多能干细胞，使所 述重组载体上的筛选基因替换人多能干细胞中的所述SIRTUIN6的第1外显子，从而获得所 述SIRTUIN6的第1外显子缺失的人多能干细胞。
[0015] 上述方法中，步骤(2)中，对所述SIRTUIN6功能丧失的人多能干细胞进行定向诱导 分化，获得所述SIRTUIN6功能丧失的间充质干细胞，是按照包括如下步骤的方法实现的：
[0016] (bl)将所述SIRTUIN6功能丧失的人多能干细胞进行拟胚体分化，获得拟胚体；
[0017] (b2)将所述拟胚体接种于基质胶包被的培养板中进行培养，培养至纤维状细胞出 现；再经过1-2次传代后，分选其中CD73、CD90、CD105均为阳性的细胞类群，即为所述 SIRTUIN6功能丧失的间充质干细胞。
[0018] 上述方法中，所述拟胚体分化为将所述SIRTUIN6功能丧失的人多能干细胞用 Tryple Express(Invitrogen公司，货号为12604021 )37°C消化20_30min，待细胞形成球体 后，用间充质干细胞培养基重悬，加到低粘附培养板(Corning公司，货号3471)中，37°C，5% C02条件培养1-3天后，即形成拟胚体；
[0019] 所述(b2)中培养的温度为37°C，培养的时间为10-14天。
[0020] 上述方法中，所述人多能干细胞为人胚胎干细胞或人诱导多能干细胞；
[0021 ]所述人胚胎干细胞具体为人胚胎干细胞H9细胞系。
[0022]本发明的另一个目的是提供一种利用上述方法制备获得的间充质干细胞。
[0023] 本发明的还有一个目的是提供上述间充质干细胞的新用途。
[0024] 本发明提供了上述间充质干细胞在制备筛选和/或鉴定用于治疗和/或维持和/或 减缓动物或人衰老的临床药物和/或天然有机物和/或小分子化合物的产品中的应用；
[0025] 所述衰老为由氧化还原稳态失衡所致。
[0026] 本发明还提供了上述间充质干细胞在作为或制备衰老细胞模型中的应用；
[0027]所述衰老为由氧化还原稳态失衡所致。
[0028]本发明将利用TALEN介导的基因组靶向修饰技术制备了 SIRTUIN6基因缺失的人类 成体干细胞及其衍生细胞，能够产生细胞氧化还原稳态失衡和加速衰老的表型，利用这些 细胞研究了SIRTUIN6在人类细胞衰老的重要作用，并探索了相关的衰老干预技术，并且在 培养皿中建立SIRTUIN6功能缺失引起的氧化还原稳态失衡所致的细胞衰老研究模型。本发 明探索了 SIRTUIN6在调控人类间充质干细胞(hMSC)及其衍生细胞衰老中的重要作用，不仅 有利于认识正常衰老过程，揭示延缓衰老或治疗衰老相关疾病的重要靶点，为衰老从基础 研究向临床转化提供重要的理论基础，且本发明所含技术能够用于建立筛选可调控成体干 细胞氧化还原稳态维持，减缓细胞衰老的备选(天然)化合物的个性化药物筛选平台，同时 也为延缓自然衰老提供了更多的线索。
【附图说明】
[0029] 图1为SIRTUIN6-/-ESC的构建流程和鉴定。图1A为人胚胎干细胞SIRTUIN6第一外 显子基因打靶策略图；图1B为SIRTUIN6-/-ESC与SIRTUIN6+/+ESC(WT)的PCR检测结果，其中 S6-61和S6-75为SIRTUIN6-/-ESC，WT为野生型人胚胎干细胞H9细胞系；图1C为细胞免疫荧 光检测SIRTUIN6-/-ESC与SIRTUIN6+/+ESC中多能干细胞标志基因0CT4(绿色）、S0X2(黄 色）、NAN0G(红色）的表达；图1D为细胞免疫荧光检测SIRTUIN6+/+ESC及SIRTUIN6-/-ESC中 SIRTUIN6蛋白表达及细胞内定位，其中，Phase为明场观察细胞形态，标尺长度：20mm;图1E 为Western blotting检测SIRTUIN6+/+ESC及SIRTUIN6-/-ESC中SIRTUIN6蛋白表达水平。其 中，SIRTUIN6+/+ESC为野生型人胚胎干细胞H9细胞系
[0030] 图2为SIRTUIN6-/-ESC衍生的SIRTUIN6-/-MSC具有加速衰老的表型。其中，图2A为 SIRTUIN6+/+ESC 和 SIRTUIN6-/-ESC 衍生的 SIRTUIN6-/-MSC 的细胞形态（Phase 为明场观察 细胞形态)及阳性表面标志蛋白⑶105、⑶73、CD90流式细胞术鉴定；图2B为细胞免疫荧光方 法鉴定SIRTUIN6+/+MSC和SIRTUIN6-/-MSC中SIRTUIN6蛋白的表达与细胞亚定位；图2C为 Western blotting鉴定SIRTUIN6+/+MSC和SIRTUIN6-/-MSC中SIRTUIN6的蛋白表达量；图2D 为SIRTUIN6-/-MSC和SIRTUIN6+/+MSC的生长能力曲线；图2E为SIRTUIN6-/-MSC和SIRTUIN6 +/+MSC的衰老相关SA-beta-Gal染色结果，其中EP代表早代细胞，