uciferase活性仅为野 生型（左腿)在胫骨前肌中的活性的10%，与SIRTUIN6+/+MSC相比，SIRTUIN6-/-MSC在体内 退行速度更快，存活并整合的细胞数目更少。
[0161] 实施例3、SIRTUIN6-/-MSC在刺激剂诱导下产生的氧化还原稳态失衡所致的细胞 表型
[0162] 一、诱导剂下制备 SIRTUIN6-/-MSC
[0163] 本实施例在培养前述源于SIRTUIN6-/-ESC产生的SIRTUIN6-/-MSC过程中，添加硫 氧还蛋白抑制剂PX-12(硫氧还蛋白是一种12KD大小的氧化还原酶，具有将双巯基转化为二 硫键的活性，参与了活性氧水平的调控、维持细胞内氧化还原稳态），可诱导产生更为明显 的氧化还原稳态失衡所致的细胞表型。具体步骤如下：
[0164] 1、分组
[0165] 在间充质干细胞培养基中分别培养SIRTUIN6-/-MSC和SIRTUIN6+/+MSC，按照是否 添加抑制剂，分成如下四组：
[0166] 第一组：SIRTUIN6-/-MSC细胞在含有硫氧还蛋白抑制剂PX-12的间充质干细胞培 养基培养3天，PX-12在间充质干细胞培养基中的浓度为ΟμΜ。
[0167] 第二组：SIRTUIN6-/-MSC细胞在含有硫氧还蛋白抑制剂PX-12的间充质干细胞培 养基培养3天，PX-12在间充质干细胞培养基中的浓度为50μΜ。
[0168] 第三组：SIRTUIN6+/+MSC细胞在含有硫氧还蛋白抑制剂PX-12的间充质干细胞培 养基培养3天，PX-12在间充质干细胞培养基中的浓度为ΟμΜ。
[0169] 第四组：SIRTUIN6+/+MSC细胞在含有硫氧还蛋白抑制剂PX-12的间充质干细胞培 养基培养3天，PX-12在间充质干细胞培养基中的浓度为50μΜ。
[0170] 2、细胞凋亡水平检测
[0171] 培养上述步骤1中的4组间充质干细胞3天后，用Annexin V/PI凋亡检测试剂盒(购 自威格拉斯公司，货号A002)分别检测步骤1中的各组细胞凋亡水平，将ΟμΜ PX-12刺激下 SIRTUIN6+/+MSC细胞凋亡比率定义为1。具体实验步骤如下：
[0172] 1)吸去培养基，PBS清洗一次，Tryple Express (Invitrogen公司，货号为 12604021)消化5-10分钟后，吹打成单细胞。
[0173] 2)收集1 X 106个细胞，用预冷的PBS清洗一次。
[0174] 3)依照试剂盒说明书，配制Annexin V染液，每个样品中加入100μΙ Annexin V染 液室温染色15分钟。
[0175] 4)再加入500μ1 PI染液，室温染色5分钟。
[0176] 5)使用流式细胞仪检测FITC和ΡΙ荧光染色。
[0177] 结果如图3Α和图3Β所示，在ΡΧ12的浓度为ΟμΜ的处理条件下，SIRTUIN6-/-MSC细胞 中凋亡细胞比率与SIRTUIN6+/+MSC细胞无明显差异(第一组和第三组细胞之间比较）；而在 ΡΧ-12的浓度为50μΜ的处理条件下，SIRTUIN6-/-MSC细胞凋亡比率为SIRTUIN6+/+MSC细胞 的2-3倍，说明在ΡΧ-12刺激下SIRTUIN6-/-MSC细胞的凋亡水平显著高于SIRTUIN6+/+MSC细 胞。
[0178] 3、活性氧水平检测
[0179] 培养上述4组间充质干细胞3天后，用H2DCFDA细胞周期染色试剂盒（购自Life technology公司，货号C6827)分别检测步骤1中的第二组和第四组细胞的活性氧水平，以未 用H2DCFDA染液孵育的间充质干细胞为空白对照(Black)。具体实验步骤如下：
[0180] 1)吸去培养基，PBS清洗一次，Tryple Express (Invitrogen公司，货号为 12604021)消化5-10分钟后，吹打成单细胞。
[0181] 2)收集1 X 106个细胞，用预冷的PBS清洗一次。
[0182] 3)依照试剂盒说明书，配制H2DCFDA染液，每个样品中加入500μ1 H2DCFDA染液，37 度染色10-30分钟。
[0183] 4)用预冷的PBS清洗一次后，再用500μ1 PBS重悬细胞。
[0184] 5)使用流式细胞仪检测FITC荧光染色。
[0185] 结果如图3C所示:在ΡΧ-12的浓度为50μΜ的处理条件下，SIRTUIN6-/-MSC细胞内的 活性氧（R0S)水平显著高于SIRTUIN6+/+MSC细胞，证明由于缺失了 SIRTUIN6,使得 SIRTUIN6-/-MSC细胞内的氧化还原平衡遭到破坏。
[0186] 4、8-氧鸟苷酸水平检测
[0187]培养上述4组间充质干细胞3天后，用8-氧鸟苷酸抗体（购自Abeam公司，货号 ab64548,小鼠源单克隆抗体)分别检测步骤1中的第二组和第四组细胞中的8-氧鸟苷酸水 平，以未用8-氧鸟苷酸抗体孵育液孵育的间充质干细胞为空白对照(Black)。具体实验步骤 如下：
[0188] 1)吸去培养基，PBS清洗一次，Tryple Express (Invitrogen公司，货号为 12604021)消化5-10分钟后，吹打成单细胞。
[0189] 2)收集1 X 106个细胞，用预冷的PBS清洗一次。
[0190] 3)配制8-氧鸟苷酸抗体孵育液(抗体按1:100用roS稀释），每个样品中加入100μΙ 8-氧鸟苷酸抗体孵育液，室温孵育30分钟。
[0191] 4)用预冷的PBS清洗一次后，配制二抗孵育液(Alexa488标记的驴抗小鼠 IgG，按1: 200用PBS稀释），每个样品中加入100μΙ二抗孵育液，室温孵育15分钟。
[0192] 5)用预冷的PBS清洗一次后，再用500μ1 PBS重悬细胞。
[0193] 6)使用流式细胞仪检测FITC荧光染色。
[0194] 结果如图3D所示，在ΡΧ-12的浓度为50μΜ的处理条件下，SIRTUIN6-/-MSC细胞内的 氧化DNA损伤标志分子8-氧鸟苷酸水平显著高于SIRTUIN6+/+MSC细胞，从另一方面证明 SIRTUIN6缺失导致SIRTUIN6-/-MSC细胞内氧化还原失衡。
【主权项】
1. 一种间充质干细胞的制备方法，包括如下步骤： (1) 取离体的人多能干细胞，突变所述人多能干细胞中的基因SIRTUIN6,使所述 SIRTUIN6丧失功能，得到所述SIRTUIN6功能丧失的人多能干细胞； (2) 对所述SIRTUIN6功能丧失的人多能干细胞进行定向诱导分化，获得所述SIRTUIN6 功能丧失的间充质干细胞。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤（1)中，所述突变人多能干细胞中的基 因SIRTUIN6为缺失所述人多能干细胞中的SIRTUIN6的第1外显子。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于:所述缺失人多能干细胞中的SIRTUIN6的第 1外显子为将所述人多能干细胞中的SIRTUIN6的第1外显子替换为筛选标记基因。4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于： 所述替换是通过同源重组的方式实现， 所述同源重组中的上游同源臂为序列表中序列3; 所述同源重组中的下游同源臂为序列表中序列4; 所述筛选标记基因为ΝΕΟ基因。5. 根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于:步骤(2)中，对所述SIRTUIN6功能 丧失的人多能干细胞进行定向诱导分化，获得所述SIRTUIN6功能丧失的间充质干细胞，是 按照包括如下步骤的方法实现的： (bl)将所述SIRTUIN6功能丧失的人多能干细胞进行拟胚体分化，获得拟胚体； (b2)将所述拟胚体接种于基质胶包被的培养板中进行培养，培养至纤维状细胞出现； 再经过1-2次传代后，分选其中CD73、CD90、CD105均为阳性的细胞类群，即为所述SIRTUIN6 功能丧失的间充质干细胞。6. 根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于:所述人多能干细胞为人胚胎干细 胞或人诱导多能干细胞； 所述人胚胎干细胞具体为人胚胎干细胞H9细胞系。7. 利用权利要求1-6中任一所述方法制备获得的间充质干细胞。8. 权利要求7所述的间充质干细胞在制备筛选和/或鉴定用于治疗和/或维持和/或减 缓动物或人衰老的临床药物和/或天然有机物和/或小分子化合物的产品中的应用。9. 权利要求7所述的间充质干细胞在作为或制备衰老细胞模型中的应用。10. 根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于：所述衰老为由氧化还原稳态失衡所 致。
【专利摘要】本发明公开了一种SIRTUIN6基因缺失人类间充质干细胞的制备方法。本发明SIRTUIN6基因缺失人类间充质干细胞的制备方法的一种间充质干细胞的制备方法，包括：(1)取体外培养的人多能干细胞，突变所述人多能干细胞中的基因SIRTUIN6，使所述SIRTUIN6丧失功能，得到所述SIRTUIN6功能丧失的人多能干细胞；(2)对所述SIRTUIN6功能丧失的人多能干细胞进行定向诱导分化，获得所述SIRTUIN6功能丧失的间充质干细胞。本发明的方法能够用于建立筛选可调控成体干细胞氧化还原稳态维持，减缓细胞衰老的备选(天然)化合物的个性化药物筛选平台，同时也为延缓自然衰老提供了更多的线索。
【IPC分类】C12N5/10, C12N15/85, C12Q1/02
【公开号】CN105441481
【申请号】CN201511008252
【发明人】刘光慧, 曲静, 潘慧泽, 管娣, 任若通
【申请人】中国科学院生物物理研究所
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2015年12月29日