LP代表晚代细胞；图2F为 SIRTUIN6-/-MSC和SIRTUIN6+/+MSC的体内生存能力检测结果。
[0031] 图3为SIRTUIN6-/-MSC作为一种由氧化还原稳态失衡导致的成体干细胞衰老模 型。图3A为不同浓度的PX-12刺激下SIRTUIN6+/+MSC及SIRTUIN6-/-MSC的细胞形态图；图3B 为Annexin V/PI双染色鉴定不同浓度的PX-12刺激下SIRTUIN6-/-MSC和SIRTUIN6+/+MSC的 细胞凋亡，ns，无显著差异;*p〈0.05;图3C为检测SIRTUIN6-/-MSC和SIRTUIN6+/+MSC内被氧 化的带绿色荧光的H2DCFDA，反映了细胞内的总体活性氧水平，其中，#为空白对照，*为 SIRTUIN6+/+MSC，&为SIRTUIN6-/-MSC;图3D为检测hMSC内8-氧鸟苷酸（8-氧鸟苷酸）水平， 其中，#为空白对照，*为 SIRTUIN6+/+MSC，&为 SIRTUIN6-/-MSC。
【具体实施方式】
[0032] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0033] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0034]下述实施例中的用于流式细胞术分选MSC的荧光标记抗体及出售公司如下：
[0035] 荧光素 FITC标记的抗人细胞表面识别分子CD90抗体(555595)，BD Biosciences。
[0036] 荧光素 PE标记的抗人细胞表面识别分子CD73抗体(550257)，BD Biosciences。
[0037] 荧光素 APC标记的抗人细胞表面识别分子CD 105抗体（ 17-1057-42 )，BD Biosciences。
[0038] 荧光素 APC标记同型对照抗体（555751)，BD Biosciences。
[0039] 荧光素 PE标记同型对照抗体(555749)，BD Biosciences。
[0040] 荧光素 FITC标记同型对照抗体(555742)，BD Biosciences。
[00411下述实施例中的人胚胎干细胞H9细胞系，WiCe 11公司产品（货号:WA09 (H9) -DL-7)。
[0042]下述实施例中的细胞培养基配方如下：
[0043] (1)CDF12培养基配方：
[0044] DMEM/F12 培养基（Invitrogen，11320-033);
[0045] 0· ImM非必需氨基酸（Invitrogen，11140-050);
[0046] ImM GlutaMAX?二肽（Invitrogen，35050-061);
[0047] 20% (体积百分含量)Knockout血清替代物（Invitrogen，N10828_028);
[0048] 1 % (lg/l〇〇ml)青霉素/链霉素（Invitrogen，15070-063);
[0049] 55μΜβ_疏基乙醇（Invitrogen，21985_023);
[0050] 10ng/ml人FGF2(Joint Protein Central)。
[0051] (2)间充质干细胞(MSC)培养基配方：
[0052] MEM 培养基（Invitrogen，12571071);
[0053] 10% (体积百分含量)胎牛血清（Invitrogen，10091148);
[0054] 1 % (lg/l〇〇ml)青霉素/链霉素（Invitrogen，15070-063);
[0055] 10ng/ml重组人成纤维细胞生长因子(JPC，bFGF);
[0056] 5ng/ml TGFP(Humanzyme，HZl131)〇
[0057] 下述实施例中的SA-beta-Gal染色方法：
[0058] 1 )6孔板中以合适密度种入细胞；
[0059] 2)细胞密度达到60~80%时，PBS清洗两次细胞；
[0060] 3)2%多聚甲醛+0.2%异戊醛固定，不超过5分钟；
[0061 ] 4)PBS 清洗2次；
[0062] 5)加入染色液，37度避光过夜孵育。染色液配方如下:柠檬酸/磷酸钠缓冲液40mM、 K4[Fe(CN)6].6H20 5mM、K3[Fe(CN)6] 5mM、NaCl 150mM、MgCl2 2mM、X-gal lmg/ml。
[0063] 6) PBS 清洗2次；
[0064] 7)Hoechst 33258(Invitrogen，货号：H3569)室温避光孵育5分钟；
[0065] 8) PBS 清洗一次；
[0066] 9)显微镜下观察。
[0067] 下述实施例中的pCR2 · 1-neo载体由美国Salk研究所Juan Car los Izpi sua Belmonte教授馈赠，并由第一发明人保存在中国科学院生物物理研究所，其核苷酸序列如 序列表中序列1所示，公众可从中国科学院生物物理研究所获得。
[0068] 下述实施例中的SIRTUIN6左、右TALEN表达载体均购自Addgene公司，商品名和货 号分别为 TAL2454(Plasmid#36843)和 TAL2455(Plasmid#36844)。
[0069] 下述实施例中的用过表达荧光素酶Luciferase的病毒载体由美国Salk研究所 Juan Carlos Izpisua Belmonte教授馈赠，并由第一发明人保存在中国科学院生物物理研 究所，其核苷酸序列如序列表中序列2所示，公众可从中国科学院生物物理研究所获得。
[0070] 实施例1、SIRTUIN6-/-ESC的获得及鉴定
[0071] 本发明涉及在人类胚胎干细胞(hESCs)中靶向失活人类SIRTUIN6基因（基因组序 列为GenBank:NC_000019.10的第4174109-4182599位，updated on 12-Mar-2015;cDNA序列 SGenBank:NM_001193285，updatedonPRI15-MAR-2015)〇
[0072] 本发明首先设计并通过分子克隆方法获得跨人类基因组中SIRTUIN6基因第1号外 显子的基因片段，其中包含设计的突变位点和用于阳性克隆筛选的Neo抗性基因（图1A)，然 后将其构建进入pCR2.1-neo载体上，获得SIRTUIN6同源臂载体(其全长序列如序列表中序 列5所示）。用SIRTUIN6同源臂载体和SIRTUIN6左、右TALEN表达载体共同电转化人多能干细 胞，使人多能干细胞的SIRTUIN6丧失功能，获得SIRTUIN6功能丧失的多能干细胞系，BP SIRTUIN6第1外显子缺失的人多能干细胞。其中，用TALEN表达载体和SIRTUIN6同源臂载体 电转化所述人多能干细胞后，还包括用G418进行克隆筛选的步骤;在克隆筛选之后还包括 对挑选的克隆用基因组PCR的方法对其同源重组的情况进行确认的步骤。具体方法如下：
[0073] 一、SIRTUIN6 缺失 hESC 的获得 [0074] 1、SIRTUIN6同源臂载体的构建
[0075] SIRTUIN6同源臂载体的构建的具体流程如图1A所示，具体步骤如下：
[0076] (1)人基因组提取
[0077] 以基因组提取试剂盒（StarSpin Animal DNA Kit,GenStar公司，货号Dili)提取 人细胞中基因组DNA，得到人基因组DNA。具体步骤如下：
[0078] 1)获得单细胞悬液，PBS清洗一次，弃上清；
[0079] 2)先后加入200μ1 GTL、20yl蛋白酶Κ、200μ1 Buffer GL，每次均以漩涡振荡器充 分混合均勾；
[0080] 3)将步骤2所得混合液加入到吸附柱中，套入收集管内；
[0081 ] 4) 10，000转离心1分钟后，弃去收集管内废液；
[0082] 5)加500μ1 Buffer GW1清洗吸附柱，10,000转离心1分钟后，弃去收集管内废液；
[0083] 6)加500μ1 Buffer GW2清洗吸附柱，10,000转离心1分钟后，弃去收集管内废液；
[0084] 7) 12,000转离心2分钟，弃去废液，室温晾干；
[0085] 8)加 50-100μ 1去离子水洗脱吸附柱中基因组DNA。
[0086] (2)SIRTUIN6左、右同源重组臂的PCR
[0087] 以步骤（1)获得的人基因组DNA为模板，采用引物对SIRTUIN6Left Arm Primer F 和SIRTUIN6Left Arm Primer R进行PCR扩增，得到上游同源臂；以步骤（1)获得的人基因组 DNA为模板，采用引物对SIRTUIN6Right Arm Primer F和SIRTUIN6Right Arm Primer R进 行PCR扩增，得到下游同源臂。引物序列如下：SIRTUIN6Left Arm Primer F:
[0088] ATAGGGCCCCCGGTGCCCATTCACTCACTACCTACCCTT；SIRTUIN6Left Arm Primer R： CCGCTCGAGAGTTCTCCAGTCACCTCTAAAATGCGGGACA；SIRTUIN6Right Arm Primer F： CGCGGATCCGCCAACACGCCCAACTCTGTGGTCACCCT；SIRTUIN6Right Arm Primer R： CGGGGTACCCCTCCC