ACCTGCCTTGTCAAAGCCCTAGCC。
[0089] 上述PCR反应体系如下：20ng~lOOng基因组DNA、0.5yl正向引物（10μΜ)、0·5μ1反 向引物（1〇μΜ)、1μ1 dNTP、10yl 2XPrimerSTAR GC buffer、0.25yl PrimerSTAR polymerase、。· 25μ1 补齐至 20μ1。
[0090] 上述PCR反应程序：第一步：98°C lmin，l个循环；第二步：98°C 10s，68°C 0.5-3min，35个循环；72°C 7min，l个循环。
[0091] 分别将获得的上游同源臂和下游同源臂分别克隆至pEASY-Blunt载体(全式金公 司，货号CB101-01)中进行测序，测序结果表明：SIRTUIN6上游同源臂的核苷酸序列如序列3 所示;SIRTUIN6下游同源臂的核苷酸序列如序列4所示。
[0092] (3)SIRTUIN6同源臂载体的获得
[0093] 将步骤（2)获得的SIRTUIN6上游同源臂插入到pCR2.1-neo载体(含有neo基因）的 Apal和Xho頂每切位点间，且将步骤(2)获得的SIRTUIN6下游同源臂插入到pCR2.1-neo载体 的BamHI和ΚρηΙ酶切位点间，且保持pCR2.1-neo载体的其他序列不变，得到SIRTUIN6同源臂 载体。并对其进行测序。
[0094] 测序结果表明：SIRTUIN6同源臂载体的核苷酸序列为序列5,其中，SIRTUIN6上游 同源臂的序列如序列5的第5847-7789核苷酸所示，neo基因如序列5的第8789-9313位核苷 酸所示，SIRTUIN6下游同源臂的序列如序列5的第9497-10729位核苷酸所示。将上述测序正 确的质粒进行中提，获得高质量质粒进行下述SIRTUIN6打靶。
[0095] 2、SIRTUIN6 缺失 hESC 的获得
[0096] 基于TALEN的基因打靶技术特异性敲除hESC细胞中的SIRTUIN6,具体为敲除人基 因组中转录SIRTUIN6cDNA的第一个外显子。具体步骤如下：
[0097] (1)野生型人胚胎干细胞H9细胞系的培养
[0098] a.将人胚胎干细胞H9接种至预先培养了经过丝裂霉素（美国Sigma公司产品，货 号:M0503)灭活的小鼠胚胎成纤维细胞(美国Invitrogen公司产品，货号：S1520-100)的培 养板中，使用人类胚胎干细胞培养基(CDF12培养基)与小鼠胚胎成纤维细胞共同培养；
[0099] b.将H9细胞接种至预先用细胞外基质（qualified-Matrigel，美国BD Biosciences产品，货号：354277)包被的培养板中，使用mTeSR培养基（美国StemCell Technologies产品）培养。
[0100] (2)准备处于对数期增殖的hESC，PBS清洗一次，Tryple Express(Invitrogen公 司，货号为12604021)消化5-10分钟后，轻轻吹打成单细胞；
[0101] (3)准备 1 ·5 X 106个H9 hESC单细胞，依据Cologne_CoA_cGMP Solution P3Primary Cell 4D_Nucleofector Kit(Lonza公司，货号V4XPG-3024)说明书配置hESC细 胞悬液，将SIRTUIN6同源臂载体和SIRTUIN6左、右TALEN表达载体加入hESC细胞悬液中，使 用4D电转仪(Lonza公司，货号4D_Nucleofector? System)进行电转，得到电转后的hESC。
[0102] (4)将电转后的hESC加入含MEF的培养板中。24小时后换新鲜CDF12培养基。
[0103] (5) 7-10天后，待培养板中长出新的克隆，依据克隆数目及大小向hESC培养体系中 加入G418(遗传霉素），筛选neo阳性的hESC克隆，即为SIRTUIN6缺失hESC记作SIRTUIN6-/-ESC。选取neo阳性的hESC克隆S6-61和S6-75进行鉴定。
[0104] 二、SIRTUIN6 缺失 hESC 的鉴定
[0105] 通过基因组PCR、western blotting、细胞免疫荧光等手段检测SIRTUIN6缺失hESC 中exon是否被替换、neo片段插入基因组位置是否正确、SIRTUIN6在mRNA及蛋白水平是否缺 失和干细胞特性，以鉴定SIRTUIN6缺失hESC是否被正确打靶。
[0106] 1、PCR 鉴定
[0107] 提取SIRTUIN6+/+ESC(即为野生型人胚胎干细胞H9细胞系）、SIRTUIN6-/-ESC克隆 S6-61和S6-75的基因组DNA，以获得的基因组DNA为模板，分别采用引物对(P1+P2)、引物对 (P3+P4)、引物对(P5+P6)、引物对(P7+P7)进行PCR扩增，鉴定第一外显子是否被neo基因替 换。引物对(P1+P2)检测基因组中是否存在第一个外显子(外显子扩增产物382bp)、引物对 (P3+P4)检测neo是否替换第一外显子（SIRTUIN6上游同源臂、第一外显子及SIRTUIN6下游 同源臂的扩增产物3649bp;SIRTUIN6上游同源臂、neo及SIRTUIN6下游同源臂的扩增产物 5053bp)、引物对(P5+P6)检测SIRTUIN6上游同源臂是否插入到基因组（SIRTUIN6上游同源 臂扩增产物2921bp)，引物对（P7+P8)检测SIRTUIN6下游同源臂是否插入到基因组 (SIRTUIN6下游同源臂扩增产物1564bp)，同时以GAPDH为内参，其扩增引物序列如下：
[0108] PI:5 '-AAGGCCTCCTGGGACTCAGCAGAAAGCTC-3 '；
[0109] P2:5 '-CCCCAAAGGCCTACCCGCTTCCATTGCTCA-3 '；
[0110] P3:5 '-CTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATC-3 '；
[0111] P4:5 '-AGGTACGCCATCCCCAGCTACCCTGA-3 '；
[0112] P5:5 '-AGATAATGTTGCTGTCATGG-3 '；
[0113] P6:5 '-TTAAGCTGTAGCACTTGGTC-3 '；
[0114] P7:5 '-CCAACATCCCAGCTTGCTT-3 '；
[0115] P8:5 '-GAGCAGGCCCATGTTACCTGA-3 '；
[0116] GAPDH-F:5 '-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3 '；
[0117] GAPDH-R:5 '-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3 '。
[0118] PCR鉴定结果如图1B所示，结果显示S6-61和S6-75中的SIRTUIN6第一外显子均已 被neo基因替换。
[0119] 2、免疫荧光检测干细胞特性
[0120] 以SIRTUIN6+/+ESC(野生型人胚胎干细胞H9细胞系）和SIRTUIN6-/-ESC(S6-61克 隆）作为供试细胞，采用免疫荧光技术对人胚胎干细胞的干性维持情况相关的分子标记物 0ct4，Sox2和Nanog进行检测。具体步骤如下：
[0121] 将培养于盖玻片上的供试细胞用4%的多聚甲醛室温固定30分钟，PBS漂洗(3次，5 分钟/次）后，使用含有0.4% (体积百分含量)Triton X-100的roS室温孵育30分钟，继而换 用 10% (体积百分含量）驴血清（Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc ·货号：017-000-121)室温封闭1小时。之后换用添加一抗的封闭液于4摄氏度孵育过夜。PBS漂洗(3次，5 分钟/次）后，然后加入对应二抗(Alexa555标记的驴抗兔抗体，Invitrogen公司，货号为A-31572)，室温孵育1小时。PBS漂洗(3次，5分钟/次)后，用工作浓度为2g/ml的Hoechst 33258 (Invitrogen，货号:H3569)室温孵育15分钟，最后封片和观察。
[0122] 结果如图 1C 所示，与 SIRTUIN6+/+ESC 相似，SIRTUIN6-/-ESC 能够表达 0ct4，Sox2 和 Nanog三种分子标记物。说明SIRTUIN6缺失不影响干细胞干性基因的表达。
[0123] 3、免疫荧光验证经过改造的人胚胎干细胞缺失SIRTUIN6
[0124] 以SIRTUIN6+/+ESC(野生型人胚胎干细胞H9细胞系）和SIRTUIN6-/-ESC作为供试 细胞，采用免疫荧光技术对人胚胎干细胞中SIRTUIN6蛋白的表达进行检测。具体步骤如下：
[0125] 将培养于盖玻片上的供试细胞用4%的多聚甲醛室温固定30分钟，PBS漂洗(3次，5 分钟/次）后，使用含有0.4% (体积百分含量)Triton X-100的roS室温孵育30分钟，继而换 用 10% (体积百分含量）驴血清（Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc ·货号：017-000-121)室温封闭1小时。之后换用添加一抗(anti-SIRTUIN6,兔源，抗SIRTUIN6蛋白N端的 抗体来源abeam公司(ab200))的封闭液于4摄氏度孵育过夜。PBS漂洗(3次，5分钟/次)后，然 后加入对应二抗(Alexa555标记的驴抗兔抗体，Invitrogen公司，货号为A-31572)，室温孵 育1小时。PBS漂洗(3次，5分钟/次）后，用工作浓度为2g/ml的Hoechst 33258(Invitrogen， 货号:H35