M 2026)购自德国DSM公司， 大肠杆菌E. coli BL21 (DE3)购自Transgen公司，表达载体pACYO)uet-tac为实施例1方法制 备。
[0064] (2)甘油脱水酶基因（dhaB123)(dhaBl Gene ID:7947197;dhaB2 Gene ID: 7947198;dhaB3 Gene ID:7947200)和甘油脱水酶激活因子基因（gdrA)(gdrA Gene ID: 6936977)的克隆是以K. peneumoniae DSM2026为模板，通过常规PCR方法扩增获得。（扩增甘 油脱水酶基因及甘油脱水酶激活因子基因的引物序列为：
[0065] dhaBl-4-F-EcoRl：CCGGAATTCATGAAAAGATCAAAACGA TTTGCAGTACT，
[0066] dhaBl-4-R-Hind III：GTTAAGCTTGATCTCCCACTGACCAAA GCTGG)
[0067] 扩增的产物再经过Clean-up试剂盒回收目的基因片段。
[0068] (3)将质粒pACYCDuet-tac和回收后的目的基因片段用EcoRI和HindllI酶切，回收 酶切产物，再进行连接，酶切后的PACY⑶uet-tac质粒与目的基因片段按照摩尔比1:1的比 例，16°C连接12小时以上，连接产物转化入BL21(DE3)感受态细胞中，然后涂布于含50mg/L 氯霉素的LB固体培养基平板上，PCR筛选阳性克隆。从阳性克隆中提取重组质粒进行测序验 证。验证结果显示甘油脱水酶基因及甘油脱水酶激活因子基因与质粒pACY⑶uet-tac连接 正确，获得重组载体
[0069] pACYCDue t-tac-dhaB123-gdrA 〇
[0070] 2、巴西固氮螺菌中的α-酮戊二酸半醛脱氢酶的克隆与表达
[0071]菌株及质粒：表达载体pCDFDuet-tac为本实施例1方法制备，大肠杆菌E . col i BL21 (DE3)购自 Transgen 公司。
[0072]本发明所使用的α-酮戊二酸半醛脱氢酶（KGSADH)来自巴西固氮螺菌 A.brasilense(kgsadh Gene ID:95102055)，将该酶编码的序列进行分析后。对该基因进行 了化学合成，得到质粒pET-28(b)_kgsadh。以pET-28(b)_kgsadh质粒为模板通过多次定点 突变获得120位谷氨酸突变为天冬氨酸及219位脯氨酸突变为丙氨酸的pET-28 (b)_ TUkgsadh质粒。扩增引物为:El 20D-F:
[0073] AATGGTTCGCCGATGACGGCCGCCGTGTAT，E120D-R:
[0074] ATACACGGCGGCGTCATCGGCGAACCATT，P219A-F:
[0075] CTTCCTACCTGATCGCGCACCCTGTAATCCG，P219A-R:
[0076] CGGATTAVAGGGTGCGCGATCAGGTAGGAAG〇
[0077] 突变的α-酮戊二酸半醛脱氢酶的克隆是以PET-28(b)-TUkgsadh为模板通过PCR扩 增获得目的基因，扩增引物为:K-NdeI-F:
[0078] GGAATTCCATATGGCTAACGTGACTTATAC，K-XhoI-R：
[0079] CCGCTCGAGTTACACTGCCATAACAG。再利用Clean-up试剂盒回收目的片段
[0080] TUkgsadh〇
[0081 ] 将质粒pCDn)uet-tac和回收后的TUkgsadh目的基因用Ndel和Xhol酶切，回收酶切 产物，再进行连接，pCDFDuet-tac质粒与TUkgsadh目的基因片段按照摩尔比1:3的比例进行 连接，16°C连接12小时以上，连接产物转化入BL21(DE3)感受态细胞中，然后涂布于含有 50mg/L硫酸链霉素的LB固体培养基平板上，PCR筛选阳性克隆。从阳性克隆中提取重组质粒 进行测序验证。验证结果显示突变的α_酮戊二酸半醛脱氢酶突变体基因与pCDHXiet-tac质 粒连接正确，获得重组载体卩〇)卩〇1161：-七已(3-
[0082] TUkgsadh〇
[0083] 3、酿酒酵母S.cerevisiae中甘油三磷酸脱氢酶的克隆与表达
[0084] 菌株及质粒：重组质粒pCDFDuet-tac-TUkgsadh为步骤2方法构建，大肠杆菌 E.coli BL21(DE3)购自Transgen公司购买。
[0085]本发明所使用的甘油三磷酸脱氢酶来自酿酒酵母(gpdl Gene ID:851539)，将该 酶编码的序列进行分析后。对该基因进行了化学合成，得到质粒pET-28(b)-gpdl。以pET-28 (b)-gpdl质粒为模板通过PCR扩增获得目的基因 gpdl，扩增引物为：
[0086] GPDl-F-NcoI:CATGCCATGGATGTCTGCTGCTGCTGACCGT，
[0087] GPD1 -R-EcoRI: CCGGAATTCTTAGCAGCCGGATCTCAGTG。再利用C1 ean-up试剂盒回收目 的基因片段。
[0088] 将质粒pCDrouet-tac-TUkgsadh和回收后的目的基因片段用Ncol和EcoRI双酶切， 回收酶切产物，再进行连接，质粒pCDFDuet-tac-TUkgsadh与目的基因片段按照摩尔比1: 3 的比例进行连接，16 °C连接12小时以上，连接产物转化入BL21 (DE3)感受态细胞中中，然后 涂布于含有50mg/L硫酸链霉素的LB固体培养基平板上，PCR筛选阳性克隆。从阳性克隆中提 取重组质粒进行测序验证。验证结果显示甘油三磷酸脱氢酶基因与pCDFDuet-tac-TUkgsadh连接正确，获得重组载体
[0089] pCDFDuet-tac-gpdl-TUkgsadh〇
[0090] 4、yqhD基因的敲除
[0091 ]菌株及质粒：单敲除菌E · coli K12_yqhD: : kan菌株、E · coli W3110、质粒pKD46、 pCP20购自耶鲁大学CGSC菌种库。
[0092]以单敲除菌E.coli K12-yqhD::kan菌株的乙醛还原酶/醇脱氢酶基因替代基因的 上下游约150个碱基片段为模板设计引物，PCR扩增打靶片段，再利用胶回收试剂盒收回目 的基因片段。
[0093]扩增引物序列为：
[0094] yD-K-F：CCAGCAAGCGGCAAATCTCTTCACG
[0095] yD-K-R：CTTCCTCATTACTTGCTTGCCAGAC
[0096] 利用胶回收试剂盒回收的目的片段进一步用乙醇纯化，以质粒pKD46为媒介与 E. coli W3110野生菌进行同源重组敲除yqhD基因，通过扩增引物验证敲除yqhD的E. coli W3110工程菌，SP为E.coli W3110_AyqhD。
[0097] 5、重组菌株的构建
[0098] 在E.coli W3110_AyqhD菌株中过量表达外源性甘油脱水酶基因（dhaB123)、甘油 脱水酶再激活因子基因（gdrA)和α-酮戊二酸半醛脱氢酶突变体基因（TUkgsadh)，获得重组 菌E·coli W3110_ Δ yqhD(pACYCDuet-tac-dhaB123-gdrA/pCDFDuet-tac-gpdl_TUkgsadh)， 实现以甘油为碳源生产3-HP。
[0099] 本领域技术人员应该理解，上述大肠杆菌(E.coli W3110)基因的缺失各个步骤按 照标准的分子克隆技术进行；上述过表达的两种基因共同克隆表达到大肠杆菌(E.coli W3110)中，各个步骤均按照标准的分子克隆技术进行;其中的α-酮戊二酸半醛脱氢酶的定 点突变均按照标准的分子克隆技术进行。
[0100] 将Ε · CO 1 i W3110_ Δ yqhD接种于50ml的LB液体培养基中，37°C培养至0D6QQ约为0 · 4 时转入50ml的离心管中，冰浴20min，使培养物冷却至0 °C。4°(：，4000g离心10min，弃上清，再 用预冷的〇. lmol/L CaCl2水溶液重悬沉淀，冰浴SOmirufC，4000g，10min离心，弃上清。再 加入2mL预冷的0 · lmol/L CaCl2(含有15%甘油）重悬沉淀，分装，-80°C保存，得到感受态细 胞。
[0101 ]重组质粒 pACYCDuet-tac_dhaB123-gdrA 和重组质粒 pCDFDuet-tac-TUkgsadh，重 组质粒口40￥0〇11