一种园林废弃物降复合解菌剂制备及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于环境生物技术领域，具体涉及一种园林废弃物高温降解纤维素的复合菌剂的制作备及其应用。
【背景技术】
[0002]园林废弃物指园林植物自然凋落或人工修剪所产生的枯枝、落叶、草肩、残花、树木与灌木剪枝及其它植物残体等，主要成分为难降解的纤维素和半纤维素。近年来，我国园林废弃物每年8%_10%的速度递增，给城市绿色化进程带来了巨大阻力，目前我国处理园林废弃物的方式主要为焚烧和填满，这两种处理方式不仅浪费了可再生资源还造成了严重的环境污染。利用生物堆肥降解园林废弃物是目前最为绿色环保、无害的方法。
[0003]园林废弃物中含有大量的木质素、纤维素等难降解的物质，导致堆肥效率低、周期长，大大限制了园林废弃物的再利用价值。仅靠自身堆肥发酵，是一个长期且较难实现的(Bernabe G.A.， Kobelnik M., Almeida S.， et al.Thermal behav1r of ligninand cellulose from waste composting process.Journal of Thermal Analysis andCalorimetry，2013,111(1): 589-595.)。堆肥中园林废弃物的降解是在微生物代谢过程中产生的一系列酶的共同作用下完成的。所以接种外源降解纤维素的菌株或菌剂在堆肥进程中显得尤为重要。纤维素降解菌能完全水解纤维素，自然界中，纤维素主要是被微生物降解，主要是细菌、真菌和放线菌。真菌主要在中温条件下，酶活最大，如木霉、青霉属、曲霉属、根霉属等。细菌和放线菌的研究和应用均较少。堆肥过程中纤维素降解主要发生在高温期，而真菌主要在中温条件下，酶活最大，随着堆肥过程温度的上升，真菌活菌数量及其产生的酶活性大大降低，这就限制了产纤维素酶霉菌在堆肥中的利用。耐高温纤维素降解菌的筛选和应用是解决上述问题的有效措施。很多纤维素降解菌都是针对玉米秸杆、稻草、麦秸等农业废弃物，很少有专门针对园林废弃物纤维素材料的降解菌的筛选和利用研究。中国专利申请“一株高温纤维素降解菌及其应用”(专利申请号:201410018582.6)公布了一株从园林废弃物高温期堆肥样品中分离的高温纤维素降解菌地芽孢杆菌，纤维素酶活性仅为7.8 U/ml，该菌为细菌。关于从园林废弃物堆肥中分离耐高温纤维素降解放线菌的报道较少。
[0004]有观点认为单一菌株与混合菌剂相比，纤维素酶活低很多。因为纤维素酶是一系列酶系共同作用的结果(Martinez AT , SPeranza M, Ruiz-Duenas F J , et al.B1degradat1n of Iignocellulosics: microbial, chemical, and enzymaticaspects of the fungal attack of lignin[J].1nt Microb1l，2005，8(3):195-204.)0史玉英(史玉英，沈其荣.纤维素分解菌群的分离和筛选[J].南京农业大学学报.1996，19(3):59 -62.)等最早把筛选到的纤维素降解菌混合培养，并对单一菌株和混合菌株的酶活进行了比较，结果混合菌株纤维素酶或比任何一个单一菌株都要高;崔宗均等(崔宗均，李美丹，朴哲，等.一组高效稳定纤维素分解菌复合系MCl的筛选及功能[J].环境科学，2002，23(3): 36 -39.)在前人研究的基础上首次把酸碱菌株进行混合，得到pH在适宜范围内的混合菌株。上述学者的研究表明，几种高效纤维素降解菌株混合培养所产生的纤维素酶活力要比单一菌株酶活高。
[0005]基于此，本发明通过对园林废弃物堆肥高温期样品进行富集培养，筛选出一系列高温微生物，主要是高温放线菌和耐高温细菌，并将其混合制作成腐熟剂，接种于以园林废弃物为主要材料的堆肥中，有助于弥补堆肥高温期土著菌纤维素降解能力的不足，从而加快园林废弃物堆肥腐熟进程。
【发明内容】
[0006]本发明所要解决的技术问题是:提供一种能加速堆肥处理园林废弃物降解过程的功能复合菌剂，解决园林废弃物由于纤维素的难降解性造成堆肥周期长的问题，可在堆肥过程中使纤维素降解加速，缩短发酵周期，提高转化效率。
[0007]本发明提供的技术方案是:一种具有在高温条件下能高效降解纤维素功能的复合菌剂，所述复合菌剂包括放线菌和细菌，其中放线菌为高温紫链霉菌(Streptomycesthermov1laceus)，嗜热淀粉酶链霉菌(Streptomyces thermodiastaticus)，嗜热一氧化碳链霉菌(Streptomyces thermocarboxydus)，微白黄链霉菌(Streptomycesalbidof Iavus)和热普通链霉菌(Streptomyces thermovulgaris)，保藏号分别为CGMCCN0.12133^CGMCC N0.12134、CGMCC N0.12135、CGMCC N0.12136和CGMCC N0.12137，细菌为波茨坦短芽孢杆菌(Brevibacillus borstelensis)，保藏号为CGMCC N0.12138，均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，所述复合菌剂由各菌株种子液分别等体积混合后进行发酵获得。
[0008]本发明所述复合菌剂中高温紫链霉菌(Streptomyces thermov1laceus)，嗜热淀粉酶链霉菌(Streptomyces thermodiastaticus)，嗜热一氧化碳链霉菌(Streptomycesthermocarboxydus)，微白黄链霉菌(Streptomyces albidof Iavus)，热普通链霉菌(Streptomyces thermovulgaris)和波茨坦短芽抱杆菌(BrevibaciIIus borstelensis)分别编号为31'1、3了2、3了3、3了4、3了5、？腫1，均已于2016年2月18日为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC所保藏(保藏地址是:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，邮政编码:100101)，其保藏号分别为CGMCC N0.12133^CGMCC N0.12134、CGMCC.12135 No、CGMCC N0.12136^CGMCC N0.12137^CGMCC N0.12138，经检测均存活。
[0009]本发明还提供所述复合菌剂的制备方法，其步骤如下:
(D菌株活化:取本发明微生物4°C保存斜面，5株放线菌分别接种至高氏I号固体平板培养基，I株细菌接种到LB固体平板培养基，在50°C的恒箱中培养3d实现菌株活化；
(2)种子液制备:将步骤(I)中经斜面活化的菌种平板，5株放线菌分别转接到IL无菌ISP2液体培养基中(成分:酵母浸粉4 g/L，麦芽糖10 g/L，葡萄糖4 g/L，琼脂16 g/L)，l株细菌转接到IL无菌LB液体培养基中(成分:胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，Nacl10g/L)，pH 7.2-7.4，50 °C、150rpm摇床条件下培养，高温紫链霉菌，嗜热淀粉酶链霉菌，热普通链霉菌和波茨坦短芽孢杆菌培养12h，嗜热一氧化碳链霉菌和微白黄链霉菌培养72h，获得种子液；
(3)液体发酵复合菌剂的制备:上述种子液按6-10%(v/v)的接种量接种至已灭菌的发酵罐中，进行扩大发酵培养，在温度50°C、振荡频率120 rpm的条件下，高温紫链霉菌，嗜热淀粉酶链霉菌，热普通链霉菌和波茨坦短芽孢杆菌培养24h，嗜热一氧化碳链霉菌和微白黄链霉菌培养72h，上述菌液混合均匀，即得到液体发酵复合菌剂。
[0010]进一步地，本发明还提供固态复合菌剂的制备方法:将麦麸与玉米面按照2:1质量比混合后作为菌液吸附剂，与步骤(3)中制得的菌液，按菌液与吸附剂体积质量比I: I混合，制作成固态复合菌剂，堆置1-2周，期间翻动1-2次，即获得固态复合菌剂，可用于以园林废物为主要材料的高温堆肥。
[0011]本发明具有以下有益效果:
本发明涉及菌种是从园林废弃物与动物粪便混合材料高温堆肥期样品中分离而来的一系列高温放线菌和细菌，具有耐高温、高效降解纤维素特性的混合菌剂，对园林废弃物的降解有更好的适应性。本发明中高温紫链霉菌，嗜热淀粉酶链霉菌，嗜热一氧化碳链霉菌，微白黄链霉菌，热普通链霉菌和波茨坦短芽孢杆菌菌株间没有拮抗作用且具有良好的协同作用，这种协同作用可有效的加速堆肥化的进程。本发明菌剂中的微生物种群间具有良好的协同作用，不仅对高温条件下园林废弃物具有高效稳定的降解能力，而且对不同环境的适应能力强，菌剂可加速园林废弃物的堆肥化进程，提高发酵效率，缩短堆肥时间，降低处理成本。
[0012]将本发明所述复合菌剂应用于园林废弃物高温堆肥体系中，该混合菌群能在40-70°C高温内大量产纤维素酶酶，活性可达76 U/ml。本发明制得的复合菌剂接种于以园林废弃物为主要材料的堆肥中，与不接种的对照相比，能够提高堆肥进入高温期的时间、延长高温期持续时间已经高温期温度，降低堆肥C/N比，从而加快堆肥腐熟进程。
[0013]本发明解决了由于纤维素的难降解限制造成园林废弃物堆肥化速度慢、周期长的问题，可以在堆肥过程中使纤维素降解加速，缩短发酵周期，提高转化效率，而且对不同环境的适应能力强，以期能达到有效提高园林废弃物的堆肥效率，从而为园林废弃物变废为宝，城市绿色化的进程中提供依据，在园林废弃物堆肥化处理及资源化利用等方面具有广阔的应用前景。
【附图说明】
[0014]图1混合菌群与单一菌株产酶活性比较。
[0015]图26株菌株系统发育树。
[0016]图3堆肥过程中堆体温度变化。
[0017]图4堆肥过程中碳氮比(C/N比)变化。
【具体实施方式】
[0018]下面通过【具体实施方式】的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。
[0019]实施例1高温纤维素降解菌种的筛选和鉴定
从北京昌平区某苹果园园林废弃物堆肥高温初期、高温中期、高温后期材料、北京延庆平原造林地区园林绿化废弃物堆积物中采集样品；称取上述新鲜样品1g放于装有10粒玻璃珠、并盛有90 ml无菌水的锥形瓶中，置于30°C 150 rpm的摇床中摇30 min，使样品充分散开，50°C下静置富集培养24h。用无菌吸管吸取I ml上清液加入到含有9ml无菌水的试管中，此即为10—1样品稀释液，再从10—1样品中取Iml加入到9ml无菌水中，此即为10—2样品稀释液，以此类推，得到10—3、10—4、10—5、10—6样品稀释液，然后用移液器吸取100 μ?的10—3、10—4、10—5、10—6样品稀释液于纤维素刚果红培养基上(培养基组成为:K2HPO4 0.5g，微晶纤维素1.88g，MgS04 0.25g，明胶2.0g，刚果红0.5g，琼脂16g，蒸馈水1000ml，pH7.0)，用涂布器把稀释液均匀涂布于整个平板，并置于50°C培养箱中培养3天。挑选在纤维素刚果红平板上有明显透明圈的菌落，进行编号，再进行反复划线分离纯化获得纯种菌株，将分离后的菌种接到斜面上，4°C保存进行后续实验。
[0020]将保藏于4°C的纯菌株转接到CMC-Na培养基(培养基成分:CMC_Na 15.0g,NH4NO3l.0g，酵母膏 1.0g，MgS04.7H20 0.5g, KH2PO4 l.0g，蒸馏水 1000ml，琼脂 16g，pH 7