.0)平板上，50°C下活化培养，然后挑起平板上的单菌落转接到纤维素刚果红平板上，置于50°C培养箱中培养，72h后测量菌落直径d和透明圈直径D，计算其比值H，即H=D/d，H值越大，值较大表示该菌株分解纤维素的能力越强。按照纤维素刚果红鉴定培养基上形成透明圈的大小初步确定其产纤维素酶活性。
[0021]通过上述操作，获得多株纤维素降解菌，其中在北京昌平区某苹果园园林废弃物堆肥高温初期采集的样品中分离的菌种，编号为FHMl的，在北京昌平区某苹果园园林废弃物堆肥高温中期采集的样品中分离的菌种，编号分别为ST1、ST2、ST3、ST4、ST5，并于2016年2月18日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC (单位地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码:100101)，FHMl、STl、ST2、ST3、ST4、ST5保藏编号分别为CGMCC N0.12138^CGMCC N0.12133、CGMCCN0.l2134、CGMCC N0.12135^CGMCC N0.12136、CGMCC N0.12137。对上述菌株进行 16S rDNA分子鉴定，FHMl菌株为波茨坦短芽孢杆菌(Brevibacillus borstelensis)，STl菌株为高温紫链霉菌(Streptomyces thermov1laceus)，ST2菌株为嗜热淀粉酶链霉菌(Streptomycesthermodiastaticus )，ST3 菌株为嗜热一氧化碳链霉菌(Streptomycesthermocarboxydus)，ST4菌株为微白黄链霉菌(Streptomyces albidof lavus)，ST5菌株为热普通链霉菌(Streptomyces thermovulgaris)。
[0022]实施例2菌株之间拮抗作用研究
将上述六株纤维素降解菌株在羧甲基纤维素培养基上两两划线但不相交，50°C，培养3d。两菌交叉处如形成无菌区，说明两菌之间产生了抑菌圈，两菌彼此拮抗，不能组合到一起，如果两菌间没有形成无菌区，则说明两菌不彼此拮抗，可以组合。从结果来看，各个菌株之间没有拮抗作用，不会互相干扰，影响菌种生长，因此可以制作为复合菌剂。
[0023]实施例3混合菌群产纤维素酶能力
将筛选得到的6株高温高效纤维素降解菌分别接种于CMC-Na的液体培养基中，并于500C，转速为150rpm/min的恒温摇床中培养，高温紫链霉菌，嗜热淀粉酶链霉菌，热普通链霉菌和波茨坦短芽孢杆菌培养12h，嗜热一氧化碳链霉菌和微白黄链霉菌培养72h，分别将各培养液的浊度0D600调至0.2，然后这6株菌菌悬液按照等量体积的比例混合均匀，即得到混合菌液。将混合菌液与各单一菌株以相同的接种量，在相同的发酵条件下进行发酵产酶培养，比较混合菌群和单一菌株的产酶能力，见图1。由图1可见，单一菌株产酶能力大小顺序为ST2>ST1>ST3>ST5>ST4>FHM1，ST2产酶能力相对最高，酶活力达60U/ml ；混合菌群产酶能力最强，产酶活力达76U/ml，是单一菌株产酶能力的1.3-3.8倍，比组成它的任何单一菌株产酶能力都强。
[0024]实施例4混合菌群对不同纤维素材料的降解能力
用5g纤维素材料(秸杆、树叶、园林修剪枝条)为唯一碳源，秸杆剪成2cm长、树叶直接加入、园林修剪枝条剪成I cm长，以10%的接种量接入复合菌剂，50 °C，150rmp摇床培养，7d后，将菌体过滤后烘干纤维素材料，采用失重法研究复合菌剂对纤维素材料的降解能力。结果表明，混合菌群对秸杆和树枝有明显的降解能力，秸杆降解率达65%，树叶降解率达54%，木肩降解率达35%。
[0025]实施例5复合菌剂的制备
(D菌株活化:取本发明微生物4°C保存斜面，5株放线菌分别接种至高氏I号固体平板培养基，I株细菌接种到LB固体平板培养基，在50°C的恒箱中培养3d实现菌株活化。
[0026]( 2)种子液制备:将(I)步骤中经斜面活化的菌种平板，5株放线菌分别转接到IL无菌ISP2液体培养基中(成分:酵母浸粉4 g/L，麦芽糖10 g/L，葡萄糖4 g/L，琼脂16g/L)，I株细菌转接到IL无菌LB液体培养基中(成分:胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，Nacl 10g/L)，pH 7.2_7.4，50°C、150rpm摇床条件下培养，高温紫链霉菌，嗜热淀粉酶链霉菌，热普通链霉菌和波茨坦短芽孢杆菌培养12h，嗜热一氧化碳链霉菌和微白黄链霉菌培养72h，获得种子液。
[0027]( 3)液体发酵复合菌剂的制备:上述种子液按6_10%( v/v)的接种量接种至已灭菌的发酵罐中，进行扩大发酵培养。在温度50°C、振荡频率120 rpm的条件下，高温紫链霉菌，嗜热淀粉酶链霉菌，热普通链霉菌和波茨坦短芽孢杆菌培养24h，嗜热一氧化碳链霉菌和微白黄链霉菌培养72h，上述菌液混合均匀，即得到液体发酵复合菌剂。
[0028]( 4)固态复合菌剂的制备:将麦麸与玉米面按照2:1质量比混合后作为菌液吸附剂，与步骤(3)中制得的菌液，按菌液与吸附剂体积质量比1:1混合，制作成固态复合菌剂，堆置1-2周，期间翻动1-2次，即获得固态复合菌剂，可用于以园林废物为主要材料的高温堆肥。
[0029]实施例6复合菌剂的堆肥效果试验
以园林废弃物为主要堆肥原料，添加动物粪便和水，使混合物料碳氮比为25-40:1、含水率50-60%，固态复合菌剂按物料重量的2.5%比例接种到堆肥物料中，进行高温堆肥，以不加复合菌剂的材料为对照，当堆体温度上升到50°C时，开始翻堆，高温期每2天翻堆一次，降温期每周翻堆一次，当温度下降到40°C后不在翻堆。堆肥过程中，通过测定堆体每天的温度变化、堆肥材料碳氮(C/N)比变化，考察添加复合菌剂对园林废弃物堆肥腐熟进度的影响。
[0030]堆肥过程中堆体温度变化如图3所示。由图3可知，接种复合菌剂的堆肥处理在堆肥2d温度即上升到50°C，之后温度继续上升，而且50°C以上的高温期持续22d，之后温度开始下降。而未接种的堆肥处理温度在堆肥第4d才上升到50°C以上，比接种的处理推迟2天到达50°C以上高温期，而且50°C以上高温期持续时间是12d，比接种的处理少了 10d，接种处理的堆体高温期的最高温度也高于未接种处理，之后堆体开始降温，到40d后，温度下降到30°C以下，并稳定下来。由此说明接种复合菌剂后能够加快堆肥进入高温期时间，以及高温期持续时间，这有助于有害微生物的杀灭以及加快堆肥的腐熟进程。堆肥过程中C/N变化如图4所示。由图4可知，随着堆肥的进行，接种复合菌剂和不接种的处理C/N比均持续降低，而接种的处理下降程度高于未接种处理，由此进一步说明，添加本菌制得的复合菌剂可以加快堆肥进程，提高园林废弃物堆肥的腐熟效果。
【主权项】
1.一种具有在高温条件下能高效降解纤维素功能的复合菌剂，所述复合菌剂包括放线菌和细菌，其中放线菌为高温紫链霉菌(Streptomyces thermov1laceus)，嗜热淀粉酶链霉菌(Streptomyces thermodiastaticus)，嗜热一氧化碳链霉菌(Streptomycesthermocarboxydus)，微白黄链霉菌(Streptomyces albidof Iavus)和热普通链霉菌(Streptomyces thermovulgaris)，保藏号分别为CGMCC N0.12133、CGMCC N0.12134、CGMCCN0.12135、CGMCC N0.12136和CGMCC N0.12137，细菌为波茨坦短芽孢杆菌(Brevibacillusborstelensis)，保藏号为CGMCC N0.12138，均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，所述复合菌剂由各菌株种子液分别等体积混合后进行发酵获得。2.—种如权利要求1所述的复合菌剂制备方法，包括如下制备步骤: (D菌株活化:取本发明微生物4°C保存斜面，5株放线菌分别接种至高氏I号固体平板培养基，I株细菌接种到LB固体平板培养基，在50°C的恒箱中培养3d实现菌株活化； (2)种子液制备:将步骤(I)中经斜面活化的菌种平板，5株放线菌分别转接到IL无菌ISP2液体培养基中，I株细菌转接到IL无菌LB液体培养基中，pH 7.2_7.4，50°C、150rpm摇床条件下培养，高温紫链霉菌，嗜热淀粉酶链霉菌，热普通链霉菌和波茨坦短芽孢杆菌培养12h，嗜热一氧化碳链霉菌和微白黄链霉菌培养72h，获得种子液； (3)液体发酵复合菌剂的制备:上述种子液按6-10%(v/v)的接种量接种至已灭菌的发酵罐中，进行扩大发酵培养，在温度50°C、振荡频率120 rpm的条件下，高温紫链霉菌，嗜热淀粉酶链霉菌，热普通链霉菌和波茨坦短芽孢杆菌培养24h，嗜热一氧化碳链霉菌和微白黄链霉菌培养72h，上述菌液混合均匀，即得到液体发酵复合菌剂。3.如权利要求1所述的复合菌剂制备方法，其特征在于:进一步地，将麦麸与玉米面按照2:1质量比混合后作为菌液吸附剂，与步骤(3)中制得的菌液，按菌液与吸附剂体积质量比1:1混合，制作成固态复合菌剂，堆置1-2周，期间翻动1-2次，即获得固态复合菌剂。4.如权利要求1所述复合菌剂在以园林废物为主要材料的高温堆肥中的应用。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于:以园林废弃物为主要堆肥原料，添加动物粪便和水，使混合物料碳氮比为25-40:1、含水率50-60%，固态复合菌剂按物料重量的2.5%比例接种到堆肥物料中，进行高温堆肥。
【专利摘要】本发明公开了一种具有在高温条件下能高效降解纤维素功能的复合菌剂，包括五种放线菌：高温紫链霉菌(<i>Streptomyces</i><i>？thermoviolaceus</i>)，嗜热淀粉酶链霉菌(<i>Streptomyces</i><i>？thermodiastaticus</i>)，嗜热一氧化碳链霉菌(<i>Streptomyces</i><i>？thermocarboxydus</i>)，微白黄链霉菌(<i>Streptomyces</i><i>？albidoflavus</i>)和热普通链霉菌(<i>Streptomyces</i><i>？thermovulgaris</i>)，及一种细菌：波茨坦短芽孢杆菌(<i>Brevibacillus</i><i>？borstelensis</i>)。本发明解决了由于纤维素的难降解限制造成园林废弃物堆肥化速度慢、周期长的问题，可在堆肥过程中使纤维素降解加速，缩短发酵周期，提高转化效率，在园林废弃物堆肥化处理及资源化利用等方面具有广阔的应用前景。CGMCC No.1213320160218
【IPC分类】C05F17/00, C12R1/465, C12R1/01, C05F11/08, C12N1/20
【公开号】CN105567612
【申请号】CN201610126120
【发明人】彭霞薇, 周金星, 冯红梅, 连鹏
【申请人】北京林业大学
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2016年3月5日