一种脱叶链霉菌a1013y及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种脱叶链霉菌Α1013Υ及其应用，属于微生物分离、培养技术领域。
【背景技术】
[0002] 色素分为人工合成色素和天然色素，两者均已应用到食品、医药、化工等生产领 域，但随着人们对合成色素的认识越来越深入，它其中可能含有的有毒、有害成分，及其在 生产中可能产生的污染物已经引起了各国众多领域的高度重视。因此，在合成色素使用量 逐渐减少的同时，天然色素的生产制备及应用受到越来越多的关注。
[0003] 天然色素主要来源于植物、动物和微生物，由于以植物和动物为原料的色素的制 备，受季节、温度、时间和空间等因素的限制较多，且成本较高，相比之下，微生物种类多样， 生长周期短，生长条件便于控制，易实现工厂化生产，因此以微生物制取色素就有了得天独 厚的优势。
[0004] 蓝色素作为三种基色之一，可以和红、黄系色素相互调配成多种颜色，有很强的应 用性。目前所报道的天然产蓝色素微生物主要是链霉菌，有文章中提到的链霉菌 (Streptomyces sp.)、假单胞菌（Pseudomonas sp.)、假交替单胞菌（Pseudoalteromonas sp.)、杜擀氏菌(Duganella sp.)等，由于色素是微生物的次级代谢产物，发酵基质与产生 机理等不同会产生不同组分的蓝色素，但与产红、黄系色素微生物相比，总体天然产蓝色素 微生物种类较少，因此进一步开发新的微生物资源生产蓝色素，使天然色素种类更加丰富 具有很高的研究和实用价值。
【发明内容】
[0005] 针对国内外市场上天然蓝色素供不应求的现状，本发明的目的在于提供一种可产 蓝色素的链霉菌，命名为脱叶链霉菌A1013Y;本发明还提供了用于获得脱叶链霉菌A1013Y 的培养基、脱叶链霉菌A1013Y的应用及其通过发酵获得天然蓝色素的方法。
[0006] 技术方案 一种脱叶链霉菌A1013Y，其保藏号为:CGMCC No. 11451。
[0007] 本发明的产蓝色素链霉菌，从河南新乡金利尔乳制品厂附近的土壤中分离、筛选 得到。
[0008] 本发明的链霉菌A1013Y，用改良的LB固体培养基进行培养24h后：幼龄菌落为圆 形、边缘突起、表面湿润、呈白色，老化后菌落表面干燥、褶皱、呈灰白色;分泌色素呈现深蓝 色素;显微镜观察，细胞孢子呈圆柱形、链直、有分支，如图1所示； 用高氏I号固体培养基进行培养72h后，老化后的菌落较小、中间凸起;分泌色素呈现紫 色；显微镜下观察，菌丝(细胞孢子)形态见图2; 用蔗糖查氏固体培养基进行培养72h后，老化后的菌落较小、中间凸起;分泌色素呈现 紫色；显微镜下观察，菌丝(细胞孢子)形态见图3。
[0009] 对本发明的链霉菌A1013Y进行16 S rDNA基因测序，序列SEQ ID N0.1所示。将所 得菌株序列通过Genebank序列比对，利用MEGA6建立系统发育树，结果见图4。通过16S rDNA 序列系统发育分析，菌株A1013Y鉴定为：Streptomyces exfoliates group。
[0010]本发明的脱叶链霉菌A1013Y能够产生蓝色素;通过摇瓶发酵48-96h，即可产生色 价可达到325U/mL的发酵液;而且，连续传代10代以上，产蓝色素能力不变。
[0011]本发明的脱叶链霉菌A1013Y于22-37°C即可生长并将色素分泌至胞外。
[0012]本发明的脱叶链霉菌A1013Y所产生的色素为水溶性色素;对热稳定，在80°C温度 条件下保温2h，色价无明显改变;对酸碱在避光条件下稳定，避光保存Id，色价无明显变化； 对DPPH自由基、ABTS+自由基和0H具有一定的清除作用，说明该蓝色素具有一定的抗氧化能 力。因此，与现有的能产生蓝色素的链霉菌相比，本发明的链霉菌的特殊之处在于具有良好 的产蓝性能，摇瓶发酵后所产蓝色素色价高达325U/mL，所产蓝色素的颜色鲜亮、性质稳定、 具有良好的抗氧化性。
[0013] 本发明还提供了一种用于培养、分离本发明的链霉菌A1013Y的培养基，其组成为： 乳糖l〇g/L、胰蛋白胨5g/L、酵母浸粉10g/L、NaCl 4g/L、琼脂20g/L和水余量，其pH为7.0。
[0014] 本发明还提供了脱叶链霉菌A1013Y的应用，产蓝色素。
[0015]本发明的链霉菌A1013Y产蓝色素的方法，是将脱叶链霉菌A1013Y接种于发酵培养 基，转速140-180r/min、32°C恒温发酵，即可获得含有蓝色素的发酵液； 所述发酵培养基的pH为7.0;每1L发酵培养基含有以下成分:葡萄糖25g，牛肉膏3g，胰 蛋白胨5g，大豆蛋白胨0.6g，NaCl 3g，水余量。
[0016] 上述方法，在将脱叶链霉菌A1013Y接种于发酵培养基之前，通常会进行平板培养 和增殖培养;然后将脱叶链霉菌A1013Y的增殖液接种到发酵培养基； 所述平板培养:将脱叶链霉菌A1013Y接种到改良的LB固体培养基，37°C恒温培养24h; 所述增殖培养:将平板培养后的脱叶链霉菌A1013Y接种到增殖培养基，转速140-180r/ min、32°C恒温培养40h培养，得增殖液； 其中，所述改良的LB固体培养基、增殖培养基的pH均为7.0; 每1L改良的LB固体培养基含有以下成分:乳糖10g，胰蛋白胨5g，酵母浸粉10g，NaCl 4g，琼脂20g，水余量； 每1L增殖培养基含有以下成分:乳糖10g，胰蛋白胨5g，酵母浸粉10g，NaCl 4g，水余量。
[0017] 经过上述平板培养和增殖培养后的脱叶链霉菌A1013Y增殖液，如果以8%的接种量 接种到发酵培养基，培养48h-96h，即可获得蓝色素色价为325U/mL的发酵液。所以，上述方 法，优选的，将脱叶链霉菌A1013Y增殖液的接种量限定为8%、将发酵时间限定为48h-96h。
[0018] 上述方法，还可以包括蓝色素粗品制取:将发酵液于4°C、8000r/min离心15min，取 上清，旋蒸、浓缩，冷冻干燥得蓝色素粗品。
[0019 ]本发明所用的专业术语说明： 色价：即色素效价相对定义，指每lmL发酵液所提取色素在pH9.0，波长在575nm下测定 吸光度，将0D值为0.1定义为1个色素效价相对单位(U/mL)。
[0020]与现有技术比，本发明优势在于： 1、 本发明提供的脱叶链霉菌，可利用改良后的牛肉膏蛋白胨等为原料发酵制得天然色 素，满足市场需要； 2、 通过摇瓶发酵优化，发酵周期72-96h，含有蓝色素的发酵液的色价可达到325U/mL; 3、 本发明的菌株适用于温度22-37°C，室温下即可生长并将色素分泌至胞外； 4、 本发明色素为水溶性色素，溶解性较好，对热稳定，对酸碱在避光条件下稳定，具有 一定的抗氧化性； 5、 本菌株遗传稳定性好，操作简单，连续传代10代以上，产蓝色素能力不变。
[0021]保藏信息 保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所 保藏日期:2015年9月23日 保藏编号:CGMCC No.11451 分类命名：脱叶链霉菌Streptomyces exfoliatus。
【附图说明】
[0022]图1显微镜观察脱叶链霉菌A1013Y在改良LB固体培养基生长24h后的细胞孢子形 态(菌丝形态）； 图2显微镜观察脱叶链霉菌A1013Y在高氏I号固体培养基生长72h后的细胞孢子形态 (菌丝形态）； 图3显微镜观察脱叶链霉菌A1013Y在蔗糖查氏固体培养基生长72h后的细胞孢子形态 (菌丝形态）； 图4脱叶链霉菌A1013Y系统进化发育树图； 图5实施例3中液体发酵上清液在紫外波长575nm处的吸收峰图谱。
【具体实施方式】
[0023] 在下面所述的具体实施例中，如无特殊说明，均为本领域常用方法。实施例中未注 明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(参考张和春等人的相关 文献)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获 得的常规广品。
[0024] 下述实施例所用培养基如下： 改良LB平板培养基:乳糖10g/L、胰蛋白胨5g/L、酵母浸粉10g/L、NaCl 4g/L、琼脂20g/ L、水余量，pH为7.0; 斜面培养基:乳糖l〇g/L、胰蛋白胨5g/L、酵母浸粉10g/L、NaCl 4g/L、琼脂20g/L、水余 量，pH 为 7.0; 牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3 g/L、胰蛋白胨5 g/L、NaCl 3 g/L、琼脂20 g/L、水余 量，pH 7.0; 高氏I号培养基：可溶性淀粉 20 g/L、KN03 1 g/L、K2HP〇4〇.5 g/L、MgS〇4.7H20 0.5 g/L、FeS〇4.7H20 0.01 g/L、NaCl 0.5 g/L、琼脂粉20 g/L、水余量，ρΗ7·2; 蔗糖查氏培养基：蔗糖30 g/L、NaN03