一株耐高温园林废弃物分解菌st3及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于环境生物技术领域，具体涉及从园林废弃物堆肥中筛选出的一株高效降解纤维素的耐热菌及其在园林废弃物高温堆肥中的应用。
【背景技术】
[0002]园林废弃物指园林植物自然凋落或人工修剪所产生的枯枝、落叶、草肩、残花、树木与灌木剪枝及其它植物残体等，主要成分为难降解的纤维素和半纤维素。近年来，我国园林废弃物每年8%_10%的速度递增，给城市绿色化进程带来了巨大阻力，目前我国处理园林废弃物的方式主要为焚烧和填满，这两种处理方式不仅浪费了可再生资源还造成了严重的环境污染。因此，如何合理有效处理园林废弃物，使其资源化利用是目前大家普遍关注的热点问题之一。
[0003]利用堆肥技术将园林废弃物腐熟制成有机肥料和育苗基质等，是其资源化利用的有效出路之一，然而园林废弃物中含有大量的木质素、纤维素等难降解的物质，导致堆肥效率低、周期长，大大限制了园林废弃物的再利用价值。因此需要向堆肥中加入特定的微生物，以加快园林废弃物腐熟过程。纤维素降解菌是一类能够产生胞外纤维素酶将纤维素大分子水解成葡萄糖的微生物，可以加速纤维素材料的降解速度。自然界中，产生纤维素的微生物种类很多，目前研究和应用得较多的是真菌，如木霉、青霉属、曲霉属、根霉属等。细菌和放线菌的研究和应用均较少。堆肥过程中纤维素降解主要发生在高温期，而真菌主要在中温条件下，酶活最大，随着堆肥过程温度的上升，真菌活菌数量及其产生的酶活性大大降低，这就限制了产纤维素酶霉菌的在堆肥中的利用。耐高温纤维素降解菌的筛选和应用是解决上述问题的有效措施。
[0004]很多纤维素降解菌都是针对玉米秸杆、稻草、麦秸等农业废弃物，很少有专门针对园林废弃物纤维素材料的降解菌的筛选和利用研究。中国专利“一株高温纤维素降解菌及其应用”(专利申请号:201410018582.6)公布了一株从园林废弃物高温期堆肥样品中分离的高温纤维素降解菌地芽孢杆菌，纤维素酶活性为7.8 U/ml，该菌为细菌。关于从园林废弃物堆肥中分离耐高温纤维素降解放线菌的报道较少。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是:提供一株耐高温嗜热一氧化碳链霉菌(Streptomyces thermocarboxydus)，该菌能在40-70°C高温内大量产酶，纤维素酶活性高，具有耐高温、高效降解纤维素特性，可将其作为微生物菌剂应用于高温堆肥体系中，适用于园林废弃物堆肥。
[0006]本发明提供的技术方案是:一株耐高温纤维素降解菌嗜热一氧化碳链霉菌(Streptomyces thermocarboxydus) ST3，保藏编号为CGMCC N0.12135，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
[0007]本发明所述嗜热一氧化碳链霉菌(Streptomyces thermocarboxydus) ST3已于2016年2月18日为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC所保藏(保藏地址是:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，邮政编码:100101)，其保藏号为CGMCC N0.12135，经检测存活。
[0008]本发明嗜热一氧化碳链霉菌(Streptomyces thermocarboxydus) ST3，是从北京昌平区某苹果园园林废弃物堆肥高温中期采集的样品中分离的菌种，将其编号为菌株ST3，该菌能够在40-70°C条件下产生纤维素酶并降解纤维素。其在高氏I号培养基上生长时，气生菌丝为灰白色，基内菌丝为浅黄棕色，不产生可溶性色素，气生菌丝多分支，在气生菌丝上生有孢子丝。显微观察表明该菌呈菌丝状，革兰氏染色呈阳性，孢子丝才有柔曲/螺旋状，孢子椭圆形，表面光滑。结合菌落菌体形态特征和基于细菌16S rDNA基因序列的系统发育分析，将其鉴定为嗜热一氧化碳链霉菌(Streptomyces thermocarboxydus)。
[0009]本发明所述菌株生产纤维素酶的方法，将该菌接种于发酵培养基(培养基成分:CMC-Na 0.5%，蛋白胨 1%，麸皮 3%, NaCl 2%, KH2PO4 0.l%g,MgS04.7H20 0.02%, (NH4)2SO40.3%，pH 7.0-7.6)中，于温度50°C、rpml50转摇床中培养3_4d，离心取上清液，测定纤维素酶活性。
[0010]本发明还提供一种适用于园林废弃物为主要堆肥材料的高温堆肥腐熟剂，该腐熟剂以液体发酵方式获得，菌液浓度为5 X 19 CFU/mL，麸皮和玉米面2:1混合作为菌液吸附剂，按菌液与吸附剂1:1混合，制作成固态菌剂。
[0011]同时，本发明还提供所述嗜热一氧化碳链霉菌ST3菌株在以园林废弃物为主要材料的堆肥腐熟中的应用，以园林废弃物为主要堆肥原料，添加动物粪便和水，使混合物料碳氮比为25-40:1、含水率50-60%，固态腐熟剂按物料重量的5%比例接种到堆肥物料中，进行高温堆肥。
[0012]本发明具有以下有益效果:
本发明所述嗜热一氧化碳链霉菌(Streptomyces thermocarboxydus) ST3是从园林废弃物堆肥中筛选出降解纤维素的菌种，可在40-70°C温度范围内产生较多的纤维素酶，酶活高达30.05 U/mL，具有耐高温、高效降解纤维素特性。相对真菌在中温条件下酶活最大，而细菌产酶活力较低的问题，嗜热一氧化碳链霉菌既能适应高温环境，又能产生较高的纤维素酶，对纤维素材料具有很好的降解能力，所以嗜热一氧化碳链霉菌更能适应堆肥过程复杂环境。
[0013]将本发明获得的耐高温纤维素降解菌制成固态腐熟剂添加到以园林废弃物为主要材料的堆肥中，与不接种的对照相比，能够提高堆肥进入高温期的时间、延长高温期持续时间已经高温期温度，降低堆肥C/N比，从而加快堆肥腐熟进程。可将其作为微生物菌剂应用于高温堆肥体系中，适用于园林废弃物堆肥。
[0014]本发明是针对园林废弃物堆肥材料筛选的菌种和制备的腐熟剂，可以为园林废弃物的资源化利用提供一条合理、有效的途径，实现降低环境污染、资源循环利用的目的。
【附图说明】
[0015]图1嗜热一氧化碳链霉菌(Streptomyces thermocarboxydus)分离纯化图片
图2本发明嗜热一氧化碳链霉菌(Streptomyces thermocarboxydus)的16S rDNA基因序列。
[0016]图3通过嗜热一氧化碳链霉菌(Streptomyces thermocarboxydus)和相近菌株16SrDNA的基因序列进行同源性Blast比对时构建的系统发育树图片。
[0017]图4堆肥过程中堆体温度变化。
[0018]图5堆肥过程中碳氮比(C/N比)变化。
【具体实施方式】
[0019]下面通过【具体实施方式】的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。
[0020]实施例1耐高温纤维素降解菌株筛选
从北京昌平区某苹果园园林废弃物堆肥高温初期、高温中期、高温后期材料、北京延庆平原造林地区园林绿化废弃物堆积物中采集样品；称取上述新鲜样品1g放于装有10粒玻璃珠、并盛有90 ml无菌水的锥形瓶中，置于30°C 150 rpm的摇床中摇30 min，使样品充分散开，50°C下静置富集培养24h。用无菌吸管吸取I ml上清液加入到含有9ml无菌水的试管中，此即为10—1样品稀释液，再从10—1样品中取Iml加入到9ml无菌水中，此即为10—2样品稀释液，以此类推，得到10—3、10—4、10—5、10—6样品稀释液，然后用移液器吸取100 μ?的10—3、10—4、10—5、10—6样品稀释液于纤维素刚果红培养基上(培养基组成为:K2HPO4 0.5g，微晶纤维素1.88g，MgS04 0.25g，明胶2.0g，刚果红0.5g，琼脂16g，蒸馈水1000ml，pH
7.0)，用涂布器把稀释液均匀涂布于整个平板，并置于50°C培养箱中培养3天。挑选在纤维素刚果红平板上有明显透明圈的菌落，进行编号，再进行反复划线分离纯化获得纯种菌株，将分离后的菌种接到斜面上，4°C保存进行后续实验。
[0021]将保藏于4°C的纯菌株转接到羧甲基纤维素培养基(培养基成分=CMC-Na 15.0g，NH4NO3 l.0g，酵母膏 1.0g，MgS04.7H20 0.5g, KH2PO4 l.0g，蒸馏水 1000ml，琼脂 16g，pH
7.0)平板上，50°C下活化培养，然后挑起平板上的单菌落转接到纤维素刚果红平板上，置于50 0C培养箱中培养，72h后测量菌落直