3 g/L、MgS〇4.7H20 0.5 g/L、KCl 0.5 g/L、 K2HP〇4 1 g/L、FeS〇4*7H20 0.01 g/L、琼脂粉20 g/L、7jC余量，pH 7.2; LB培养基:胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L、水余量，pH7.0; 增殖培养基:乳糖1 〇g/L、胰蛋白胨5g/L、酵母浸粉1 Og/L、NaCl 4g/L、水余量，pH为7.0; 基础发酵培养基:牛肉膏3g/L、胰蛋白胨5g/L、NaCl 3g/L、水余量，pH为7.0; 优化发酵培养基：葡萄糖27g/L、大豆蛋白胨4g/L、牛肉膏3g/L、胰蛋白胨5g/L、NaCl 3g/L、水余量，pH为8.0; 实施例1脱叶链霉菌(Streptomyces exfoliates group)的分离与鉴定 一、脱叶链霉菌A1013Y的分离 称取O.lg采集于河南省新乡市金利尔乳制品厂附近的土样，放进装有无菌水的1.5mL 的PE小管中充分震荡均匀，用无菌水将其分别稀释成体积浓度为1 X 10-4、1 X 10-5两个梯度 的稀释液，分别用灭菌的枪头吸取100度的稀释液涂布于预先配制并且灭菌的改良LB平板 培养基中，于37°C培养24h。从改良LB平板培养基上划线分离单菌落，将挑取的单菌落中的 部分进行制片镜检，判断菌株纯度(显微镜观察菌体为同一形态特征，为纯菌落）。如果不是 纯菌落，应反复多次划线分离单菌落，直至获得纯菌落为止。将获得的纯菌落用斜面培养基 保存，得到菌株纯培养体。
[0025] 二、脱叶链霉菌A101Y的鉴定 1.形态特征 将步骤一获得的菌株纯培养体分别接种到以下培养基中（牛肉膏蛋白胨培养基、高氏I 号培养基、蔗糖查氏培养基、LB培养基和改良LB平板培养基），观察培养特征:结果见表1: 表1.链霉菌A10131Y形态培养特征(可溶性色素存在于培养基）
[0026] 37°C下在改良LB平板培养基平板培养24h，菌落直径2_3mm，菌落呈白色、边缘凸 起、不整齐（肉眼直接观察）；革兰氏染色阳性；显微镜观察，细胞孢子呈圆柱形、链直、有分 支，结果见图1; 用高氏I号固体培养基进行培养72h后，老化后的菌落较小、中间凸起;分泌色素呈现紫 色；显微镜下观察，菌丝(细胞孢子)形态见图2; 用蔗糖查氏固体培养基进行培养72h后，老化后的菌落较小、中间凸起;分泌色素呈现 紫色；显微镜下观察，菌丝(细胞孢子)形态见图3; 根据表1及图1、2、3可以得出：步骤一分离所得菌株纯培养体是一种链霉菌，命名为脱 叶链霉菌A1013Y。
[0027] 3.16S rDNA序列分析 16S rDNA基因序列由北京宝杰罗生物公司测序（如SEQ ID N0.1所示），将得到的16S rDNA序列提交到NCBI数据库中进行BLAST在线同源性比对分析，结果在GenBank数据库中找 到多个链霉菌属显著相似的基因序列，其同源性高达99%。选出相似度较高的部分链霉菌 16S rDNA，应用MEGA6软件，采用相邻拼接方法(Neighbor Joining Method)，构建系统进化 发育树;所构建的系统进化发育树如图4所示，将该菌鉴定为脱叶链霉菌。
[0028] 该菌株已于2015年11月4日送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心保藏，保藏编号为:CGMCC No.11451。
[0029] 实施例2脱叶链霉菌A1013Y的培养和发酵培养基及发酵条件的优化 1.菌株的培养 将实施例1获得的菌株纯培养体(本发明的脱叶链霉菌A1013Y)置于灭菌后的装有50mL 增殖培养基的250mL的三角瓶中，32°C恒温培养40-42h，180r/min;获得增殖液。
[0030] 2.发酵培养基及发酵条件的优化 在基础发酵培养基的基础上，对碳源种类及浓度、氮源种类及浓度、发酵液初始pH、接 种量、发酵时间、发酵温度、摇瓶转速进行优化，得到产蓝菌株A1013Y的优化发酵培养基(g/ L):葡萄糖27g、大豆蛋白胨4g、牛肉膏3g，胰蛋白胨5g，NaCl 3g，pH为8.0。
[0031 ]将步骤1培养好的增殖液以8%的接种量接种到115°C灭菌30min的装有50mL优化后 发酵培养基的250mL的三角瓶中，转速160r/min、23°C恒温培养93h，得蓝色发酵液。蓝色发 酵液中，蓝色素的色价达到325U/mL。
[0032]实施例3蓝色素粗品的制备及鉴定 1.蓝色素粗品的制备 将发酵得到的蓝色发酵液于4°C下8000r/min离心15min，取上清，将上清在45°C条件下 进行旋蒸浓缩，浓缩后液体经冷冻干燥既得蓝色素粗品，粗品得率达到l〇g/L(得率，是相对 于发酵液的）以上。
[0033] 2.蓝色素的定性检测 将步骤1中获得的上清液通过高效液相色谱法进行梯度洗脱，洗脱条件见表2，流速为 0.5mL/min，测定液体发酵液的成分，检测结果如图5:液体发酵液在紫外波长为570nm处有 吸收波长，进一步验证发酵物质即为蓝色素。
[0034] 衷2.高效液相梯庠洗脱备件
【主权项】
1. 一种脱叶链霉菌A1013Y，其保藏号为:CGMCC No. 11451。2. 根据权利要求1所述脱叶链霉菌A1013Y，其特征在于， 用改良的LB固体培养基进行培养24h后：幼龄菌落为圆形、边缘突起、表面湿润、呈白 色，老化后菌落表面干燥、褶皱、呈灰白色；分泌色素呈现深蓝色素；显微镜观察，细胞孢子 呈圆柱形、链直、有分支； 用高氏I号固体培养基进行培养72h后，老化后的菌落较小、中间凸起;分泌色素呈现紫 色； 用蔗糖查氏固体培养基进行培养72h后，老化后的菌落较小、中间凸起;分泌色素呈现 紫色。3. 根据权利要求1所述脱叶链霉菌A1013Y，其特征在于，于22-37°C即可生长并将色素 分泌至胞外。4. 一种用于培养、分离权利要求1、2或3所述脱叶链霉菌A1013Y的培养基，其特征在于， 其组成为:乳糖l〇g/L、胰蛋白胨5g/L、酵母浸粉10g/L、NaCl 4g/L、琼脂20g//L和水余量，其 pH为7.0。5. -种权利要求1、2或3所述脱叶链霉菌A1013Y的应用，产蓝色素。6. -种权利要求1、2或3所述脱叶链霉菌A1013Y产蓝色素的方法，其特征在于，是将脱 叶链霉菌A1013Y接种于发酵培养基，转速140-180r/min、32°C恒温发酵，即可获得含有蓝色 素的发酵液； 所述发酵培养基的pH为7.0;每1L发酵培养基含有以下成分:葡萄糖25g，牛肉膏3g，胰 蛋白胨5g，大豆蛋白胨0.6g，NaCl 3g，水余量。7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在将脱叶链霉菌A1013Y接种于发酵培养基 之前，通常会进行平板培养和增值培养;然后将脱叶链霉菌A1013Y的增值液接种到发酵培 养基； 所述平板培养:将脱叶链霉菌A1013Y接种到改良的LB固体培养基，37°C恒温培养24h; 所述增殖培养:将平板培养后的脱叶链霉菌A1013Y接种到增殖培养基，转速140-180r/ min、32°C恒温培养40h培养，得增殖液； 其中，所述改良的LB固体培养基、增殖培养基的pH均为7.0; 每1L改良的LB固体培养基含有以下成分：乳糖10 g，胰蛋白胨5 g，酵母浸粉10 g，NaC 1 4g，琼脂20g，水余量； 每1L增殖培养基含有以下成分:乳糖10g，胰蛋白胨5g，酵母浸粉10g，NaCl 4g，水余量。8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，将脱叶链霉菌A1013Y增值液的接种量限定 为8%、将发酵时间限定为48h-96h。9. 根据权利要求6、7或8所述的方法，其特征在于，包括蓝色素粗品制取:将发酵液于4 °C、8000r/min离心15min，取上清，旋蒸、浓缩，冷冻干燥得蓝色素粗品。
【专利摘要】本发明涉及一种脱叶链霉菌A1013Y及其应用，属于微生物分离、培养技术领域。本发明的脱叶链霉菌A1013Y，从河南新乡金利尔乳制品厂附近的土壤中分离、筛选得到；其保藏号为：CGMCC？No.11451。本发明的脱叶链霉菌A1013Y能够产生蓝色素；于22-37℃即可生长并将色素分泌至胞外；通过摇瓶发酵48-96h，即可产生色价可达到325U/mL的发酵液；而且，连续传代10代以上，产蓝色素能力不变。本发明的脱叶链霉菌A1013Y所产生的色素为水溶性色素；对热稳定，在80℃温度条件下保温2h，色价无明显改变；对酸碱在避光条件下稳定，避光保存1d，色价无明显变化；对DPPH自由基、ABTS+自由基和OH具有一定的清除作用，说明该蓝色素具有一定的抗氧化能力。CGMCC No.1145120150923
【IPC分类】C12P1/06, C12N1/20, C12R1/465
【公开号】CN105567611
【申请号】CN201610122666
【发明人】李秀婷, 朱运平, 孙宝国, 范光森, 许丽亚
【申请人】北京工商大学
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2016年3月4日