菌接种至含有50mg/L氯霉素和50mg/L硫酸链霉素的LB液体培养基，在37 °C培养10h，获得种 子液。所述种子液按体积浓度6 %的接种量接种至发酵培养基。
[0022] 本发明所述甘油脱水酶基因 dhaB123及甘油脱水酶再激活因子基因 gdrA来自克雷 伯氏菌Klebsiella pneumoniae DSM 2026。本发明所使用的α-酮戊二酸半醛脱氢酶 (KGSADH)来自巴西固氮螺菌A.brasilense。本发明所使用的甘油三磷酸脱氢酶基因 gpdl来 自酿酒酵母S. cerevisiae。
[0023] 本发明不仅克隆了来自K.penumoniae DSM 2026的甘油脱水酶基因 dhaB123及甘 油脱水酶激活因子基因 gdrA构建重组质粒pACY⑶uet-tac_dhaB123-gdrA，而且还克隆了 A. bras ilense的α-酮戊二酸半醛脱氢酶基因 kgsadh筛选突变体编码基因 TUkgsadh与来自 酿酒酵母的甘油三磷酸脱氢酶编码基因 gpdl构建了重组质粒pCDFDuet-tac-gpdl-TUkgsadh。
[0024] 本发明所述宿主E.coli W3110,是敲除了生成1，3-丙二醇合成途径相关基因的乙 醛还原酶基因 yqhD，达到减少副产物1，3_丙二醇的合成并提高3-羟基丙酸产量的目的。本 发明通过将重组质粒 pACYCDue t-tac-dhaBl 23-gdrA 和pCDFDuet-tac-gpdl-TUkgsadh 导入 到宿主重组大肠杆菌E.coli W3110_AyqhD中实现3-HP的生产。
[0025]本发明所述缺失基因的方法采取Red系统同源重组，在本领域技术人员的能力范 围之内。所述重组载体导入重组宿主菌的方法采用化学转化法。
[0026]本发明以大肠杆菌E.coli W3110为宿主菌，在合成产物时需要添加适量的维生素 Bi2;敲除了宿主菌合成副产物1，3_丙二醇的相关基因，减少了副产物1，3_丙二酸的合成。
[0027] 与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在:通过利用基因敲除技术降低副产 物1，3_丙二醇产量的同时再生醛脱氢酶的辅因子NAD+，从而提高3-羟基丙酸的产量，提高 15倍。 (四）
【附图说明】
[0028] 图1.利用甘油合成3-羟基丙酸的代谢途径示意图；
[0029] 图2.口厶0￥0〇1161：-七&(3-(111&13123飞(1^载体构建不意图；
[0030]图3.pCDFDuet-tac_TUkgsadh 载体构建不意图；
[0031 ]图4.pCDFDuet-tac-gpdl_TUkgsadh 载体构建不意图；
[0032]图5.甘油在大肠杆菌中的代谢途径(虚线表示已经敲除的路径）；
[0033]图6.IPTG诱导浓度对重组大肠杆菌目的蛋白表达量的影响示意图（Maker表示标 准蛋白质，泳道 1_4的菌株为E.coli W3110_A yqhD(pACYCDuet-tac_dhaBl23-gdrA/ pCDrouet-tac-TUkgsadh)，IPTG诱导浓度依次为0、0 · 0ImM、0 · 25mM及0 · 5mM，泳道5-8的菌株 为E·coli W3110_ Δ yqhD(pACYCDuet-tac-dhaB123-gdrA/pCDFDuet-tac-gpdl_TUkgsadh)， IPTG诱导浓度依次为0、0.0ImM、0.25mM及0.5mM，箭头指示目的蛋白）；
[0034]图7.重组大肠杆菌发酵3-羟基丙酸(3-HP)的高效液相色谱检测；（A~D为标准品， E、F为未敲除菌E · coli W3110(pACYCDuet-tac-dhaB123-gdrA/pCDFDuet-tac_TUkgsadh)发 酵产物的示差检测图和紫外检测图，G、H为敲除菌E.coli WSlHLAyqhDbACYCDuet-tac-dhaBWS-gdrA/pCDFDuet-tac-TUkgsadh) 发酵产物的示差检测图和紫外检测图， I、J为敲除 菌E·coli W3110_ Δ yqhD(pACYCDuet-tac-dhaB123-gdrA/pCDFDuet-tac-gpdl_TUkgsadh) 发酵产物的示差检测图和紫外检测图。 (五)
【具体实施方式】
[0035]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0036] 下列实施中所使用的实验方法若无特殊说明，均为常规方法。
[0037] 下列实施例中所使用的材料、试剂等若无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0038]所用酶试剂购自TaKaRa公司，提取质粒所用的试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒购 自爱思进生物技术有限公司，相应的操作步骤按照产品说明书进行；酵母粉、蛋白胨购置 0X0ID公司;所有的培养基如无特别说明均用去离子水配置。
[0039] "基因缺失"或"基因敲除"指将目的基因从基因组中删除，从而使目的基因失去表 达，导致某些功能的缺失。
[0040] "电击转化"指分子生物学转染技术的一种，用于将外来目的基因整合到宿主中并 稳定表达。主要利用高压电脉冲的电击作用将质粒或者基因片段导入到宿主。
[0041] "热击转化"指分子生物学转染技术的一种，用于将外来基因整合到宿主细胞中稳 定表达，其利用热击作用将外来质粒导入宿主细胞中。
[0042] "过表达"指特定的基因在生物体中大量表达，表达量超过正常水平。
[0043] 本实验中所用菌株为大肠杆菌E.coli W3110。
[0044] "扩增"是指在个体染色体或者质粒中额外的引入基因以便能够过量表达。
[0045] 培养基配方：
[0046] (1 )LB培养液:5g/L酵母粉，10g/L NaCl，10g/L蛋白胨，其余为水，pH自然，121°C灭 菌20min〇
[0047] (2)LB固体培养基:20g/L琼脂，5g/L酵母粉，10g/L NaCl，10g/L蛋白胨，其余为水， pH自然。
[0048] (3)发酵培养基：甘油30g/L，NaCl lg/L，MgS〇4 · 7H20 0.25g/L，Na2HP〇4 · 12H20 22 · 7g/L，KH2P〇43g/L，酵母膏4g/L，（NH4) 2S〇43 · 2g/L，其余为水，pH7 · 0，121°C 灭菌20min。
[0049] 实施例1:质粒中启动子的替换
[0050] 菌株及质粒：E · ci 1 i BL21 (DE3)购自Transgen公司，表达载体pACYCDuet-1和 pCDFDuet-Ι购自诺维信公司。
[0051 ] 质粒pACY⑶uet-Ι和p⑶rouet-Ι启动子的替换是通过同源重组将质粒上T7启动子 的序列更换为tac启动子的序列。
[0052]以pACYCDuet-tac质粒的构建为例。培养含有质粒pACYCDuet-Ι的大肠杆菌菌株， 然后以pACYCDuet-Ι质粒为模板，利用突变引物使质粒模板上的T7序列突变为tac，然后将 用Dpnl内切酶消化好的模板化学转化进BL21(DE3)感受态细胞中。然后涂布于含50mg/L氯 霉素的LB固体培养基平板上，PCR筛选阳性克隆。从阳性克隆中提取重组质粒进行测序验 证。验证结果显示T7启动子序列(T7碱基序列：
[0053] TAATACGACTCACTATA)成功替换为tac启动子(tac启动子序列：
[0054] TGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGT)。其中所用的替换引物序列为：
[0055] I up:5'-GGAAATTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGGGGAATTG-3'
[0056] I down:5 '-CAATTCCCCACATTATACGAGCCGATGATTAATTGTCAATTTCC-3 '
[0057] II up:5'-AGCTTTTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGGGGAATTG-3'
[0058] II down:5'
[0059] -CAATTCCCCACATTATACGAGCCGATGATTAATTGTCAAAAAGC-3 ' 〇
[0060] 同理替换pCDFDuet-1的启动子为tac。
[0061 ] 实施例2:
[0062] 1、肺炎克雷伯氏菌中甘油脱水酶及甘油脱水酶激活因子的克隆与表达
[0063] (1)菌株及质粒:肺炎克雷伯氏菌(K.peneumoniae DS