cience 291 :2344 ;Wacker 等 人（2002) Science 298 :1790 ;Davis 等人（2002) Chem. Rev. 102 :579 ;Hang 等人（2001) Acc. Chem. Res 34 :727。如本文描述的抗体（例如IgG同种型，例如IgGl)可以包含确定 数目（例如7种或更少，例如5种或更少，例如两种或单一）的糖形。
[0076] 脱酰胺是主要将天冬酰胺（N)转换为以约3:1比的异天冬氨酸和天冬氨酸（D)的 酶促反应。在小得多的程度上，脱酰胺可以以类似方式对谷氨酰胺残基发生。CDR中的脱酰 胺导致分子电荷中的改变，但通常不导致抗原结合中的改变，它也不影响PK/PD。
[0077] 氧化可以在产生和贮存过程中（即在氧化条件的存在下）发生，并且导致通过活 性氧簇直接诱导或通过与氧化性应激的次级副产物反应间接诱导的蛋白共价修饰。氧化主 要对甲硫氨酸残基发生，但偶然地可以在色氨酸和游离半胱氨酸残基处发生。
[0078] 二硫键混杂可以在产生和碱性贮存条件过程中发生。在某些环境下，二硫键可以 不正确地破坏或形成，导致不配对的半胱氨酸残基（-SH)。这些游离的（不配对的）巯基 (-SH)可以促进混乱。
[0079] 异构化通常在产生、纯化和贮存（在酸性pH下）过程中发生，并且通常在天冬氨 酸通过化学处理转换为异天冬氨酸时发生。
[0080] 重链和/或轻链中的N末端谷氨酰胺可能形成焦谷氨酸（pGlu)。大多数PGlu形成 在生产生物反应器中发生，但它可以非酶促形成，这取决于加工和贮存条件的pH和温度。 pGlu形成视为关于重组mAb的首要降解途径之一。
[0081] C末端赖氨酸剪切是由羧肽酶催化的酶促反应，并且通常在重组mAb中被观察到。 该处理的变体包括赖氨酸从一条或两条重链中的去除。赖氨酸剪切看起来不影响生物活 性，并且对mAb效应子功能没有作用。
[0082] 效应子功能增强 抗原结合蛋白的恒定区和各种Fc受体（FcR)包括Fc γ RI (CD64)、Fc γ RII (CD32)和 Fe γ RIII (CD16)之间的相互作用据信介导抗原结合蛋白的效应子功能，诸如ADCC和CDC。 [0083] 本文所使用的术语"效应子功能"意指抗体依赖性细胞介导的细胞毒性活性 (ADCC)、补体依赖性细胞毒性活性（CDC)介导的应答、Fc介导的吞噬作用或抗体依赖性细 胞吞噬作用（ADCP )和经由FcRn受体的抗体再循环中的一种或多种。
[0084] 本发明的抗原结合蛋白的ADCC或CDC特性可以以多种方式来增强。
[0085] 已经显示了含有特定突变或在残基Asn297上具有改变的糖基化的人IgGl恒定 区以增强与Fc受体的结合。也已经显示，在一些情况下，这些突变增强ADCC和⑶C(Lazar 等人 PNAS 2006，103; 4005-4010 !Shields 等人 J Biol Chem 2001，276; 6591-6604; Nechansky 等人 Mol Immunol, 2007，44; 1815-1817)。
[0086] 在本发明的一个实施方案中，这种突变在选自239、332和330(IgGl)的一个或多 个位置处或其他IgG同种型中的等效位置处。合适突变的实例是S239D和I332E和A330L。 在一个实施方案中，本文所述的本发明的抗原结合蛋白在239和332位处突变，例如S239D 和I332E，或在进一步实施方案中，其在选自239和332和330的三个或更多个位置处突变， 例如S239D和I332E和A330L。（EU索引编号）。
[0087] 在本发明的一个实施方案中，提供了包含嵌合重链恒定区的抗原结合蛋白，例如 包含具有至少一个来自IgG3的CH2结构域的嵌合重链恒定区以使得抗原结合蛋白具有 增强的效应子功能的抗原结合蛋白，例如其中其具有增强的ADCC或增强的CDC，或增强的 ADCC和⑶C功能。在一个此类实施方案中，抗原结合蛋白可以包含一个来自IgG3的CH2结 构域或两个CH2结构域都可以来自IgG3。
[0088] 还提供了产生本发明的抗原结合蛋白的方法，其包括以下步骤： a) 培养包含表达载体的重组宿主细胞，所述表达载体包含如本文所述的分离核酸，其 中所述表达载体包含编码含有源自人种系IgGl和IgG3序列的结构域的Fc区的核酸序列； 和 b) 回收抗原结合蛋白。
[0089] 此类产生抗原结合蛋白的方法可以例如使用可以从BioWa, Inc. (La Jolla, CA, USA)和 Kyowa Hakko Kogyo (now, Kyowa Hakko Kirin Co.，Ltd. ) Co.，Ltd.获得的 COMPLEGENT ?技术系统进行，其中重组宿主细胞包含表达载体，其中表达编码含有源自人 种系IgGl和IgG3序列的结构域的Fc区的核酸序列以产生具有增强的补体依赖性细胞毒 性（CDC)活性的抗原结合蛋白，该活性相对于缺乏此类嵌合Fc结构域但其他方面都相同的 抗原结合蛋白增加。COMPLEGENT?技术系统的方面描述于W02007011041和US20070148165 中，其都通过引用并入本文。在可替代的实施方案中，可以通过在IgG链的Fc区中引入序 列特异性突变来增加 CDC活性。本领域普通技术人员也将认识到其他合适系统。
[0090] 在本发明的可替代实施方案中，提供了抗原结合蛋白，其包含具有改变的糖基化 概况的重链恒定区，使得该抗原结合蛋白具有增强的效应子功能。例如，其中抗原结合蛋白 具有增强的ADCC或增强的CDC或其中其具有增强的ADCC和CDC效应子功能。产生具有改 变的糖基化概况的抗原结合蛋白的合适的方法的实例描述于W02003011878、W02006014679 和EP1229125,所有这些都可以被应用到本发明的抗原结合蛋白。
[0091] 本发明还提供了用于产生本发明的抗原结合蛋白的方法，其包含以下步骤： a) 在适合于表达抗原结合蛋白的条件下培养包含表达载体的重组宿主细胞，所述表 达载体包含如本文所述的分离核酸，其中在所述重组宿主细胞中编码α -1，6-岩藻糖基转 移酶的FUT8基因已经失活；和 b) 分离由重组宿主细胞产生的抗原结合蛋白。
[0092] 本发明还提供了用于产生根据本发明的抗原结合蛋白的方法，其包括以下步骤： a) 在重组宿主细胞中表达根据本发明的抗原结合蛋白，其中编码α-1，6_岩藻糖基 转移酶的FUT8基因在重组宿主细胞中是失活的；和 b) 分离由重组宿主细胞产生的抗原结合蛋白。
[0093] 此类产生抗原结合蛋白的方法可以例如使用可以从BioWa, Inc. (La Jolla, CA, USA)获得的POTELLIGENT?技术系统进行，其中缺乏FUT8基因的功能性拷贝的CH0K1SV细 胞产生具有增强的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC)活性的单克隆抗体，该活性相 对于具有功能性FUT8基因的细胞中产生的相同单克隆抗体增加 。POTELLIGENT ?技术系统 的方面描述于US7214775、US6946292、W00061739和W00231240中，其都通过引用并入本文。 本领域普通技术人员也将认识到其他合适系统。
[0094] 在一个进一步方面，本发明提供了非岩藻糖基化的抗体。本文提及"非岩藻糖基化 的"或"无岩藻糖基化的"抗体是指具有Fc的复杂型N-聚糖的三-甘露糖基核心结构而不 具有岩藻糖残基的抗体。非岩藻糖基化的或无岩藻糖基化的本发明的抗体在连接至Asn297 的核心碳水化合物结构上不包含岩藻糖。缺乏来自Fe N-聚糖的核心岩藻糖残基的这些糖 工程改造的抗体，由于Fe γ RIIIa结合能力的增强，可以表现出比岩藻糖基化的等效物更 强的ADCC。
[0095] 本领域技术人员将显而易见的是，此类修饰不仅可以单独使用，而且可以彼此组 合使用以进一步增强效应子功能。
[0096] 在本发明的一个此类实施方案中，提供了包含重链恒定区的抗原结合蛋白，所述 重链恒定区包含突变和嵌合的重链恒定区。例如其中抗原结合蛋白包含至少一个来自人 IgG3的CH2结构域和一个来自人IgGl的CH2结构域，其中IgGl CH2结构域在选自239和 332和330的位置处具有一个或多个突变（例如突变可以选自S239D和I332E和A330L) 以使得抗原结合蛋白具有增强的效应子功能。在该背景下，增强的效应子功能可以等于，例 如，具有增强的ADCC或增强的CDC，例如其中其具有增强的ADCC和增强的CDC。在一个实 施方案中，IgGl CH2结构域具有突变S239D和I332E。
[0097] 在本发明的可替代实施方案中，提供了包含嵌合重链恒定区且具有改变的糖基化 概况的抗原结合蛋白。在一个这种实施方案中，重链恒定区包含至少一个来自IgG3的CH2 结构域和一个来自IgGl的CH2结构域且具有改变的糖基化概况以使得岩藻糖与甘露糖的 比率为0. 8 :3或更低，例如其中抗原结合蛋白经去岩藻糖基化以使得所述抗原结合蛋白与 具有缺乏所述突变和改变的糖基化概况的免疫球蛋白重链恒定区的等效抗原结合蛋白相 比具有增强的效应子功能，例如其中其具有一种或多种下列功能：增强的ADCC或增强的 ⑶C，例如其中其具有增强的ADCC和增强的⑶C。
[0098] 在可替代的实施方案中，抗原结合蛋白具有至少一个人IgG3 CH2结构域和至少一 个来自人IgGl的重链恒定结构域，其中两个IgG CH2结构域都根据本文所述的限制进行突 变。
[0099] 在本发明的一个方面，提供了产生本文所述的本发明的抗原结合蛋白的方法，其 包括以下步骤： a) 培养含有表达载体的重组宿主细胞，所述表达载体含有如本文所述的分离核酸，所 述表达载体进一步包含编码含有源自人种系IgGl和IgG3序列的结构域的Fe区的Fe核酸 序列，且其中在该重组宿主细胞中编码α -1，6-岩藻糖基转移酶的FUT8基因已经失活；和 b) 回收抗原结合蛋白。
[0100] 此类产生抗原结合蛋白的方法可以例如使用可以从BioWa, Inc. (La Jolla, CA, USA)获得的AccretaMab ?技术系统进行，所述系统组合POTELLIGENT ?和COMPLEGENT ?技术 系统以产生具有增强的ADCC和CDC活性的抗原结合蛋白，所述活性相对于缺乏嵌合Fe结 构域且在寡糖上具有岩藻糖但其他方面相同的单克隆抗体增加。
[0101] 在本发明的又另一个实施方案中，提供了包含突变和嵌合的重链恒定区的抗原结 合蛋白，其中所述抗原结合蛋白具有改变的糖基化概况以使得抗原结合蛋白具有增强的效 应子功能，例如其中其具有一种或多种下列功能：增强的ADCC或增强的CDC。在一个实施 方案中，突变选自239和332和330位，例如突变选自S239D和I332E和A330L。在进一步 实施方案中，重链恒定区包含至少一个来自人IgG3的CH2结构域和一个来自人IgGl的CH2 结构域。在一个实施方案中，重链恒定区具有改变的糖基化概况使得岩藻糖和甘露糖的比 率为〇. 8:3或更低，例如抗原结合蛋白是去岩藻糖基化的，使得所述抗原结合蛋白与等效 非嵌合抗原结合蛋白或缺乏所述突变和具有改变的糖基化概况的免疫球蛋白重链恒定区 相比具有增强的效应子功能。
[0102] 半衰期延长 增加的半衰期，或半衰期延长，可用于体内应用抗原结合蛋白，特别是抗体，最特别是 小尺寸的抗体片段。此类片段（Fvs，二硫键键合的Fvs、Fabs、scFvs、dAbs)通常从体内迅 速清除。可以改变或修饰根据本公开的抗原结合蛋白，以提供体内抗原结合蛋白的功能活 性的增加的体内血清半衰期，因此更长的持久性、或停留时间。合适地，此类修饰的分子与 未改变的分子相比具有降低的清除率和增加的平均停留时间。增加的半衰期可以改善治疗 分子的药代动力学和药效动力学特性，也可以对于改善的患者顺应性是重要的。
[0103] 短语"半衰期"（"t1/2"）和"血清半衰期"是指根据本公开的抗原结合蛋白的血清 (或血浆）浓度在体内减少50% (例如，由于抗原结合蛋白的降解和/或抗原结合蛋白通 过天然机制清除或遮蔽）而花费的时间。
[0104] 本公开的抗原结合蛋白可以通过结合至抵抗降解和/或清除或遮蔽的分 子（"半衰期延长部分"或"延长半衰期的分子"）而在体内稳定化且增加它们的半衰 期。半衰期延长策略综述于，例如，" T1AerajOei/ iic /3TO .· Sira ?ο ifooWa ie TXeir 由 Roland Kontermann 编辑，Wiley-Blackwell, 2012， ISBN:978-3-527-32849-9。合适的半衰期延长策略包括：PEG化、多唾液酸化、HES化、重组 PEG模拟物、，糖基化、仏糖基化、Fc融合、工程改造的Fe、IgG结合、白蛋白融合、白蛋白 结合、白蛋白偶联和纳米颗粒。
[0105] 在一个实施方案中，所述半衰期延长部分或分子是聚乙二醇部分或PEG模拟物。 在一个实施方案中，所述抗原结合蛋白包含（任选由其组成）连接至聚乙二醇部分的本公 开的单一可变结构域（任选地，其中所述部分具有大小为约20至约50kDa，任选地约40 kDa 直链或分枝PEG)。关于结构域抗体和结合部分的PEG化的更多细节，参考W004081026。在 一个实施方案中，拮抗剂由连接至PEG的结构域抗体单体组成，其中所述结构域抗体单体 是根据本公开的单一可变结构域。合适的PEG模拟物综述于，例如，第4章，第63-80页， " Therapeutic Proteins:Strategies to Modulate Their Plasma Half-Lives", |il Roland Kontermann 编辑，Wiley-Blackwell，2012，ISBN:978-3-527-32849-9〇
[0106] 抗体的Fe区和各种Fe受体（Fe γ R)之间的相互作用据信介导抗体或抗体片段 的吞噬作用和半衰期/清除。新生儿FcRn受体被认为涉及抗体清除和跨越组织的转胞吞 作用（参见 Junghans(1997) Immunol. Res 16 :29-57;和 Ghetie 等人（2000)Annu. Rev. Immunol. 18:739-766)。在一个实施方案中，半衰期延长部分可以是来自抗体的Fe区。此 类Fe区可以根据期望特性并入各种修饰。例如，可以将补救受体结合表位掺入抗体内，以 增加血清半衰期，参见US 5, 739, 277。
[0107] 被确定与人FcRn直接相互作用的人IgGl残基包括Ile253、Ser254、Lys288、 Thr307、Gln311、Asn434和His435。因此，在本节中描述的任何位置的取代可以实现抗体的 增加的血清半衰期和/或改变的效应物特性。
[0108] 通过融合至Fc区的半衰期延长综述于，例如，第9章，第157-188页，" T1AerajOeiziic Proteins:Strategies to Modulate Their Plasma Half-Lives", 1? Roland Kontermann 编辑，Wiley-Blackwell, 2012，ISBN:978-3-527-32849-9。
[0109] 通常，增强体内血清半衰期的多肽，即延长半衰期的分子，是体内天然存在且抵抗 内源机制的降解或去除（其从生物体（例如，人）去除不需要的物质）的多肽。通常，此类 分子是天然存在的蛋白，其本身具有长体内半衰期。
[0110] 例如，增强体内血清半衰期的多肽可以选自来自细胞外基质的蛋白，血液中发现 的蛋白，在血脑屏障或神经组织中发现的蛋白，定位于肾脏、肝脏、肌肉、肺、心脏、皮肤或 骨骼的蛋白，应激蛋白，疾病特异性蛋白或参与Fc转运的蛋白。合适的多肽描述于，例如， W02008/096158。
[0111] 此类方法也可用于将根据本公开的抗原结合蛋白（例如，单一可变结构域）靶向 递送至目标组织。在一个实施方案中，提供了根据本公开的高亲和力单一可变结构域的靶 向递送。
[0112] 在一个实施方案中，根据本公开的抗原结合蛋白，例如，单一可变结构域，可以连 接，即缀合或结合至血清白蛋白、其片段和类似物。通过融合至白蛋白的半衰期延长综 龙号，執如，％ 韋，％ 22?>-2\? .展，" Therapeutic Proteins:Strategies to Modulate TXeir 由 Roland Kontermann 编辑，Wiley-Blackwell, 2012， ISBN:978-3-527-32849-9。
[0113] 合适的白蛋白、白蛋白片段或白蛋白变体的实例描述于，例如，W02005077042和 TO2003076567。
[0114] 在另一个实施方案中，根据本公开的单一可变结构域、多肽或配体，可以连接，即 缀合或结合至转铁蛋白、其片段和类似物。
[0115] 在一个实施方案中，半衰期延长可以通过革El向增加体内半衰期的抗原或表位来实 现。抗原结合蛋白的流体动力学大小及其血清半衰期可以通过将本公开的抗原结合蛋白缀 合或结合至结合天然存在的分子且增加体内半衰期的结合结构域而增加。
[0116] 例如，根据本发明的抗原结合蛋白可以缀合或连接至抗血清