温敏性骨生长组合物的制作方法
【专利说明】
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求申请日为2013年3月14日的美国专利申请序列号No. 61/783,803的 优先权，其在此通过提述并入。
技术领域
[0003] 本发明涉及促进骨生长的组合物，更具体为用于诱导新骨形成的骨移植替代物 (BGS) 〇
[0004] 发明背景
[0005] 当前BGS制剂的外科应用（例如用于骨折修复术或脊柱融合术）可以是侵入式 的、耗时且繁冗的，这是由于已经开发用于递送成骨生长因子的递送系统的设计和结构所 造成的。
[0006] 发明概述
[0007] 我们开发了一种非侵入式的可注射的组合物，其含有水介质中的I型胶原、成骨 生长因子（OSF)以及可逆性温敏性的生物可降解聚合物。该制剂可以非侵入式地施用，例 如通过注射施用，从而避免了目前市售的许多骨诱生产品的局限性。如已通过例如异位成 骨的标准大鼠模型来确定的，所述可注射的成骨制剂有效诱导骨形成。所述温敏性的生物 可降解的聚合物控制组合物的流变学特性，以便使其能在室温注射，并且随着其温度升至 体温（37°C )，其在递送位点形成含有OSF的生物可相容的凝胶，从而将所述组合物（尤其 是0SF)定位在其有用的部位。在所述组合物中使用骨胶原粉，提供了适于OSF的递送基质 并提供了促进成骨的生物环境。这种可注射组合物使得能以低OSF浓度进行新骨形成。
[0008] 在所述组合物的优选实施方案中，OSF是骨形态发生蛋白（BMP)，如BMP-2、BMP-4、 BMP-6、BMP-7 (0P-1)。可以使用 BMP-2 或 BMP-4 或 BMP-6 或 BMP-7 (0P-1)的同源二聚体，同 样可以使用所选的BMP的异源二聚体，如BMP-2/7异源二聚体。还可以使用所选的BMP的 组合。这些蛋白可以是人蛋白，并且它们可以通过重组方式产生；它们可以低于3. 5mg/每 克温敏性胶原骨架的浓度存在。组合物还可以包含矿物质如磷酸三钙或羟基磷灰石。组合 物还可以包含填充剂或粘度增补剂如透明质酸化合物，尤其是分子量>500Da的透明质酸 化合物。所述透明质酸化合物可以是交联的，例如交联的透明质酸，以促进植入部位处骨模 (mold)或骨板（slab)的形成。可以包含糖胺聚糖如硫酸软骨素或壳聚糖。
[0009] 同样在优选的实施方案中，在室温或以下，所述组合物粘度适于从注射器进行注 射，例如当组合物从针头尺寸为20G-1. 5〃的5cc注射器递送时，其展示出< 30牛顿的注射 器挤压力。所述组合物可以是可塑的油灰（putty)。所述组合物含有按重量计50%-80% 的液体。如通过粒度筛所确定的，胶原的平均粒径为70-425 μ m。所述组合物成分溶解/悬 浮于缓冲溶液或无菌水中。组合物可以包含放射性造影剂，并且所述组合物不需要包含透 明质酸化合物。
[0010] 所述组合物可用于治疗需要诱导骨生长的患者，所述治疗是通过在希望骨生长的 部位（例如骨折部位，或对于正在经受或已经受过脊柱融合术程序的患者而言是其脊柱融 合部位）注射该组合物。
[0011] 宙义：
[0012] 术语"透明质酸化合物"包括糖胺聚糖（例如来自活生物来源例如鸟类或细菌来 源的天然HA，或合成的HA)，以及透明质酸盐和上述的衍生物，包括聚合胶、交联胶和衍生 的透明质酸。
[0013] 成骨生长因子（OGF)意为影响天然骨形成过程的化合物，如生长与分化因子 (GDF)、成骨蛋白（OP)、诱导成骨因子（OIF)。该术语包括骨形态发生蛋白（BMP)如BMP-2、 BMP-4、BMP-6、BMP-7 (0P-1)。通常这些因子是为人所熟知的且市售的。
[0014] 泊洛沙姆可以是非离子三嵌段共聚物，其由两侧的两条聚氧乙烯（聚（氧 化乙烯））亲水链和中心的聚氧丙烯（聚（氧化丙烯））疏水链组成。一般参见US 3, 740, 421。泊洛沙姆包括产品 Synperonics (Croda Inc.，Edison NJ)，具体是泊 洛沙姆 407 ;普郎尼克（BASF Corporation, Florham Park, NJ);和 Kolliphor (BASF Corporation, Tarrytown, NY)，聚乙氧基蓖麻油和LeGoo?血管内阻塞胶（occlusion gel)，其包含20% (盐水中的重量百分比）的纯化的泊洛沙姆407。泊洛沙姆是一个生物 可相容性的、水溶性的、具有可逆性温敏性特性（即随着温度升高，其粘度升高）的聚合物 的家族。具体而言，所用的泊洛沙姆是无毒性、生物可相容的、水溶性的，且其粘度随着温度 在使用范围内升高而降低。在室温，所述组合物是可注射的，但是有粘性的。在加热至体温 时，其经历了温度诱导的相变，而其化学组成未发生实际变化（未固化），从而形成聚合的 栓或板。
[0015] 本发明的一个或多个实施方案的详情在下文的附图和说明书中示出。本发明的其 他特征、目的和优点可从说明书和附图以及权利要求书中明显地看出。
[0016] 附图简述
[0017] 图1显示了新骨形成的组织学分数：评估了加载于20%普朗尼克F-127中的BBC 上的BMP-2诱导骨形成的能力，其与加载于PBS中的BBC上的BMP-2 (阳性对照）进行对比； BBC:牛骨胶原。
[0018] 图2A显示了新骨形成的组织学分数：透明质酸和普朗尼克F-127伴随BBC作为添 加的骨架对于BMP-2诱导骨形成的能力的效果。
[0019] 图2B显示了皮下植入物中新骨形成的组织学分数。评估了作为骨架的多种市售 的透明质酸以及BBC/普朗尼克酸：每个点代表一个个体动物，而水平短线代表组中位分 数。任意组之间的新骨/软骨形成的组平均分数无显著差异（P>〇. 05)。
[0020] 图3显示了皮下植入物中新骨形成的组织学分数：评估了放射性造影剂（Is0V)与 BBC/22. %普朗尼克酸的组合）：每个点代表一个个体动物，而水平短线代表组中位分数。 标注：+P〈0. 01，与第1组对照（22. 5% PL+0 μ g BMP-2)相比；##P〈0. 001，与第1组对照相 比ΓΡ〈0. 05,与DGE组相比；PL =普朗尼克。
[0021] 图4显示了皮下植入物中新骨形成的组织学分数：评估了珊瑚-羟基磷灰石骨架 与BBC/普朗尼克酸IBMP的组合。每个圆圈代表一个个体动物而水平短线是组中位数。标 注：+P〈0. 01且#Ρ〈0· 001，与25BBC+0 μ g ΒΜΡ+Ρ对照（第1组）对比；PL =普朗尼克。
[0022] 图4A显示了皮下植入物中新骨形成的组织学分数。对比了临床使用来源于牛跟 腫（Bovine Achilles Tendon)的胶原（Heliostat-InFuse, Medtronic)与BBC/普朗尼克酸 骨架，伴随多种量的BMP-2。每个点代表一个个体动物，而水平短线代表组中位分数。标注： I= BBC =牛骨胶原/普朗尼克酸盐，~P〈0. 05,对比O μ g的两组；Α~Ρ〈0. 01，对 比 0 μ g 的胃M ;#Ρ〈〇· 〇〇1，又寸比 0 μ g 的胃M ;+Ρ〈〇· 〇1，又寸比 H-5. 4 μ g M ;++Ρ〈〇· 〇〇1，又寸比 Η-5. 4 μ g 组；*Ρ〈0· 05,对比 Η-5. 4 μ g 组。
[0023] 图5显示了病理学分数。每个圆圈代表一个个体动物，而水平短线代表新骨/软 骨生成的组中位分数。接受含有>1 μ g BMP-2植入物的（第2-12组）任意组之间组中位 分数无显著差异。标注：+P〈〇. 001，与第1组对比；*P〈〇. 01，与第1组对比；#P〈〇. 05,与第1 组对比。
[0024] 图6显示了 BBC的份额（lots)和骨架尺寸对样品中每克蛋白的碱性磷酸酶活性 的影响。
[0025] 图7显示了不同比例的HA和普朗尼克F-127对每克蛋白的碱性磷酸酶活性的影 响。
[0026] 图8显示了 BBC的份额和骨架尺寸对样品中钙浓度的影响。
[0027] 图9显示了不同的HA/普朗尼克F-127浓度对样品中钙浓度的影响。
[0028] 图10显示了不同的胶原骨架对大鼠异位模型中BMP-2的成骨诱导潜力的影响 (22. 5%普朗尼克F-127作为载体）。
[0029] 图11显示了载体对大鼠异位模型中BMP-2的成骨诱导潜力的影响（BBC, 70-425um 作为骨架）。
[0030] 图12显示了新骨/软骨形成的病理学分数。每个点代表一个个体动物，而水 平短线代表组中位分数。任意组之间的新骨/软骨形成分数的组中位分数无显著差异 (Ρ>0· 05) 〇
[0031] 图13显示了 HA市售产品植入物在28天后的钙浓度。
[0032] 图14显示了在大鼠异位模型中作为ΒΜΡ-2骨架的新批次（批号#17075-43)的 BBC的成骨诱导潜力，与现有批次（批号#11848-79)的BBC进行对比。
[0033] 图15显示了对载体缓冲液、谷氨酸盐和PBS与对照相比对于大鼠异位模型中 ΒΜΡ-2的成骨诱导潜力的评估。
[0034] 图16对比了两种新载体，2. 5% HA和20%普朗尼克F-127/2. 5% ΗΑ，与20%普朗 尼克F-127。
[0035] 图17显示了不同载体对rhBMP-2诱导骨形成的能力的影响。
[0036] 图18对比了两种大鼠异位模型：不同载体中皮下（SQ)对比肌内（頂）移植。
[0037] 图19是病理学分数的散点图。每个点代表一个个体动物，而水平短线代表组中位 分数。标注：+P〈〇. 01，对比第1组对照（22. 5% PL+0 μ g rhBMP-2) ;#P〈0. 001，对比第1组 对照ΓΡ〈〇. 05,对比DGE组；PL =普朗尼克。
[0038] 图20显示了不同载体对钙浓度的影响。
[0039] 图21显示了植入物中新骨/软骨的病理学分数。每个点代表一个个体动物，而 水平短线代表组中位分数。符号显示了相对于对照的第1组的统计学差异。给予了 >3 μ g rhBMP-2的任意处理组之间无显著差异（P>0. 05)。标注ΓΡ〈0. 05,对比第1组；+P〈0. 01，对 比第1组；#P〈〇. 001，对比第1组。
[0040] 图22显示了 RBC和BBC对钙浓度的影响。
[0041] 图23显示了载体中不同的BBC粒径、骨架尺寸和造影剂对钙浓度的影响。
[0042] 图24是皮下植入物中骨/软骨生成的病理学分数的散点图。。每个点代表一个个 体动物，而水平短线代表组中位分数。标注：+(P〈〇.〇5)，对比BMP-4,3yg) ;#(P〈0.05,对 比81^-4,0.3 48);*(口〈0.01，对比81^-4,3 48);~(卩〈0.001，对比81^-4,3 48和0.3 48);&(?〈0.05，对比81^-4，148)山(卩〈0.01，对比81^-4,0.3 48)丨1^ = 22.5%普朗尼克；891 =皮下注射。
[0043] 发明详述
[0044] 总体而言，如下的方案阐述了可注射的成骨组合物的形成。OGF、I型胶原和聚合 物组分仅供说明之用，并且本领域技术人员会理解，用于临床用途的组分会选自那些已经 被批准用于人临床用途的组分。
[0045] 成骨溶液制备：
[0046]