将无菌的、可溶的且颗粒状的牛骨来源的I型胶原置于0.0 lN HCl中的30-40% 乙醇（水中的v/v)中，并无菌地向其添加溶于0.0 lN HCl中的或谷氨酸盐缓冲液（pH 4.8)中的BMP溶液，涡旋振荡x3,于4°C温育1小时，然后进行冻干。添加至浓缩物 (concentrations)中的BMP的量范围为1-100 μ g至25-200mg的胶原。随后将冻干的胶原 /BMP基质（~25mg)置于150 μ 1的20-40%普朗尼克聚合物（v/v)在PBS (pH 7. 4)中的 溶液中，并在室温（RT)充分混合用于注射。在一些实例中，将胶原-BMP-普朗尼克混合物 与填充剂（例如透明质酸、骨矿质或其组合）合并。或者，可以将BMP-骨胶原-普朗尼克 聚合物、矿质和糖胺聚糖与放射性造影剂的混合物在无菌环境中冻干，并可以在使用前在 操作套件处将其悬于水或缓冲溶液中。
[0047] 骨诱生测定：
[0048] 可注射成骨制剂的骨诱导活性可以通过在啮齿动物的皮下部位移植或通过经皮 注射入嗤齿动物的腹膜（abdominal fascia)或骨豁肌袋（pouches)来进行评估。在注射 后第12-21天，收取植入物，并通过生化分析法（碱性磷酸酶和钙含量）和如（Sampath. T.K.和Reddi，A.H. 1981)中所述的组织学来测定其骨形成活性。
[0049] OGF ：
[0050] OGF，例如天然的或重组的人BMP，如BMP-2或BMP-7 (OP-1)或BMP-4或BMP-6，或 混合物，可从商业来源获得。
[0051] 胶原基质：
[0052] I型胶原可以从多个商业来源获得。下文实施例使用的牛骨I型胶原按照 (Sampath. T.K.和Reddi，A.H. 1981)所述制备。在临床使用中，I型胶原应当是可以用于治 疗人的那种。
[0053] 通过使用标准程序从3-6个月龄的奶牛制备牛去矿质骨干骨基质， DBM(70-420 μ m)。然后在4°C用6M胍HCl处理牛DBM数小时（16-24小时），然后用水洗涤， 在酸性环境中加热1小时然后在冻干之前用水洗并用酒精处理。通过在使用前以3. 5mega RADy射线处理，将去矿质的、不可溶的、胍-HCL提取的且经酸处理的牛骨I型胶原进行灭 菌，然后用含自由基清除剂无菌水洗涤处理并进行冻干。
[0054] 透明质酸（HA)产品
[0055] 通过在Framingham, MA的Genzyme设备中发酵兽疫链球菌（Streptococcus zooepidemicus)从而纯化细菌来源的HA(平均分子量3, 000, 000)。在Ridgefield, NJ的 Genzyme设备中从鸡冠生产Hylan A (平均分子量6, 000, 000)。
[0056] Prevelle 丝（Prevelle Silk)和真皮凝胶提取物（Dermal Gel Extra, DGE)为真 皮填充物（dermal filer)。它们制备于Ridgefield, NJ的Genzyme设备。
[0057] Hylastan是一种粘度补充剂（visco-supplement)，用于治疗由骨关节炎引起的 疼痛。其制备于Ridgefield, NJ的Genzyme设备。Restylane是一种真皮填充物，并且购自 QMED，瑞典。
[0058] 透明质酸（HA)的市售产品的特性
[0059] (DGE) Prevelle 丝 Restylane* Hylastan/ 总 HA 浓度（mg/mL) 22 δΓδ 20 Τ0 凝胶 / 流体比 85/15 98/2 75/25 65/35 HA 凝胶浓度（mg/mL) ΤΓ? 5Λ ΤΓ0 Τ0 HA修饰程度（％ ) 9 23 3 Γδ %交联的 HA 7 12 T~2 2?7 耐稀释性/%膨胀 ~15 <25 50 G' 模量（Pa) 1800 230-260 660 平均粒径（微米) 230 350 300 DVS DVS BDDGE DVS HA 流体 MW[kDa]-预灭菌- - - 3MD 利多卡因 + + - - 体内滞留时间（月） 9 F9 ~1-2 GtF 30 31 30 18-21 挤压力（lml/G30) [N] 33 18* 27
[0060] 泊洛沙姆407聚合物：
[0061] 泊洛沙姆407/普朗尼克F-127共聚物（氧化乙烯和氧化丙烯嵌段）购自 BASF(Mount Olive, NJ)〇
[0062] 所述聚合物溶于PBS中得到20-30% wt/体积的聚合物终浓度。在这个浓度，聚合 物显示出热可逆特性、在室温的流体状态以及在体温的凝胶状态。通过向IOOmL的冷PBS 添加20g普朗尼克F-127并在4°C搅拌过夜以获良好溶解，从而制备了 20%凝胶。接下来 将所述溶液用0. 22 μ m过滤器过滤除菌。
[0063] 组合物特征：
[0064] 组合物具有粘性和挤压力，这使其能够在注射器中使用。例如，其从5cc注射器用 尺寸为20G-1. 5〃的针以低于30牛顿的挤压力进行递送。 实施例
[0065] 实施例1.可注射的成骨制剂诱导了软骨内的骨形成，这是通过对来自异位骨形 成的大鼠模型样品外植体的碱性磷酸酶活性、钙含量和组织学评估判断出的。骨诱导活性 的水平取决于BMP蛋白浓度（图1)。
[0066] 实施例2.在这心研究中测验了浓度范闱为20-30%的泊洛沙姆407。当所有含泊 洛沙姆的制剂都诱导骨形成时，观测到其泊洛沙姆407最佳浓度为20-25%，以加速体内的 凝胶形成（图2A)。
[0067] 实施例3.有或无普朗尼克酸的、胶原-BMP基质伴随高分子量透明质酸（Hyal-A 或Hyalastin)溶液经皮注射，也诱导了新骨形成（图2B)。
[0068] 实施例4.由于可注射成骨制剂的临床使用可能需要荧光检查指引至意图递送部 位，我们证明向制剂添加放射性造影剂不干扰体内的骨形成。用临床相关浓度的放射性造 影剂（例如Isovue-370)对可注射成骨制剂进行补充，并测试异位骨形成大鼠模型。这项 研究的结果揭示了放射性造影剂不干扰该骨形成动物模型中的骨诱导（图3)。
[0069] 实施例5.由于珊瑚来源的羟基磷灰石已经用作骨缝隙填充物（bone avoid filler)和带有自体骨移植物的膨胀矿物骨架，我们测验了 ProOsiecm? 500R(Interporc, Cross International)对于新骨形成的效果。结果提示，珊瑚-羟基磷灰 石是可与BBC/普朗尼克酸生物相容的，并形成为可塑的油灰以用作骨移植替代物用于脊 柱融合术（图4)。
[0070] 实施例6. InFuse (Medtronic, MN)已经被批准用于体内融合使用于腰椎。Infuse 采用12mg的BMP-2,其吸收了来源于牛跟腱瓣的I型胶原，并被拧入钛金属笼的凹槽中，以 刺激新骨形成并融合邻近的腰椎段。我们对比了皮下植入物中的InFuse-牛跟腱胶原与 BBC/普朗尼克可注射悬液与多种剂量的BMP-2。结果显示，对于给定体积的胶原植入物， BBC/普朗尼克酸悬液采用了比BMP-2低10-50倍以引发相当的新骨形成，如组织学分数所 证明的那样（图5)。
[0071] 实施例 7 (09-4662)：
[0072] 本实施例调查了：
[0073] ?大鼠异位模型中胶原载体批次（lots)的成骨诱导潜力
[0074] ?胶原/BMP比率以及骨架质量（scaffold mass)对成骨诱导潜力的影响
[0075] ?对于大鼠异位模型中成骨诱导的载体/聚合物比率的变化
[0076] 研究设计：12组（η = 4)4-5周龄的雄性Long Evans大鼠在胸部接受了双边皮下 植入物。手术植入物含有不同浓度的HA/普朗尼克F-127(载体）和不同量的BBC(骨架） 中的〇-1〇4881^-2(信号）。
[0077] 研究设计的细节在下表1中列出。
[0078] 在第14天将所有大鼠经0)2室息处死，并获取样本用于分析。
[0079] 表1 :研究设计
[0082] *Lot#18034_124
[0083] **Lot#18034_104
[0084] 将每个样品分为两块。一半的样品于10%中性缓冲的福尔马林中固定，包埋在甲 基丙烯酸甲酯中，以约5微米切片，并用苏木素和伊红（H&E)、von Kossa和甲苯胺蓝染色。 组织病理学评估包括对样品中新软骨和骨形成的定量和半定量评定，所述评定是用表2中 所示的记分系统来进行的。还对每个样品的新骨/软骨形成的分布模式进行记分（表3) (Lucy Phillips, B. V. Sc.，A. C. V. P,病理学部，建新公司）。
[0085] 表2 :新骨/软骨的记分系统
[0089] 清除另一半样品的附着组织。将样品置于2ml的冰冷的0. 15M NaCl/3mM NaHCO3中，然后用Polytron勾衆器进行勾衆。然后将其离心，把上清倒出并通过Randox Daytona 化学分析仪来分析总蛋白浓度（TP)和碱性磷酸酶活性（ALP)。（Michelle Searles，药理 学/毒理学部；建新公司）。
[0090] 在5ml的20mM磷酸盐缓冲液中将残余物洗涤两次，然后在5ml的0. 6N HCL中4°C 提取过夜。然后将其离心，倒出上清并进行妈分析。在Varian ICP-OES上于396nm发射光 处分析样品，所述分析由建新公司分析研发部Martin Hanus完成。
[0091] 结果：组织病理学评估
[0092] 病理学分数的散点图如图5中所示。
[0093] 含有25或50mg的BBC(批号#18034-124)的样品和含有批号#18034-124(新） 或批号#10834-104(旧）的样品中新骨/软骨的程度和分布模式是相当的。
[0094] 对于含有不同浓度的HA/普朗尼克F-127载体的样品，在新骨产生的程度上没有 显著差异；然而，随着HA浓度增加，新骨在围绕含BBC骨架的腔体中心的环边而形成和出血 的趋势是显著的。
[0095] 碱件磷酸酶活件
[0096] ?对于含3 μ g BMP-2的植入物，碱性磷酸酶浓度没有差异。
[0097] ?将BBC骨架从25升至50mg (而BBC/BMP-2比例相同），不导致更高的碱性磷酸 酶浓度。
[0098] ?在5 μ g BMP-2处，增加载体中HA的浓度和降低普朗尼克F127的浓度不导致碱 性磷酸酶浓度的差异。
[0099] ?在10 μ g BMP-2负载处，具有较高HA浓度（6% )的样品具有较高的碱性磷酸酶 浓度，但不高于测定中的变化。
[0100] 钙评估
[0101] ?对于含有3 μ g BMP-2的植入物而言，旧批次的BBC (批号#10834-104)与新批次 (批号#10834-124)相比有较高的Ca含量的趋势。
[0102] · BBC骨架从25升至50mg(而BBC/BMP-2比例相同），不导致更高的Ca浓度。
[0103] ?在5 μ g BMP-2处，增加载体中HA的浓度和降低普朗尼克F-127的浓度不导致 Ca浓度的差异。
[0104] ?含有10 μ g BMP-2和I. 5% F-127/6%