针对间质和上皮-间质转化的循环肿瘤细胞的特异性检测工具的制作方法
【专利说明】针对间质和上皮-间质转化的循环肿瘤细胞的特异性检测 工具
[0001] 本申请要求2013年3月5日提交的美国临时申请号61/772, 973的优先权权益， 所述美国临时申请的整个内容以引用的方式并入本文。
[0002] 文件名称"UTFCP1208TO_ST25. txt"中包含的 3KB (如 Microsoft Windows 中所测 量）且于2014年2月18日创建的序列表通过电子提交与此一起提交，并且以引用的方式 并入本文。
[0003] 发明背景
[0004] 本发明根据由国立卫生研究院授予的资助号CA120295在政府资助下进行。政府 享有本发明的某些权利。 1.发明领域
[0005] 本发明大体上涉及癌症生物学的领域。更具体来说，它涉及计数和分离循环肿瘤 细胞以有助于早期检测肿瘤、转移和复发。
[0006] 2.相关技术的描述
[0007] 转移是癌症相关死亡的主要原因。循环肿瘤细胞（CTC)被视为转移的种子，并且 被定义为使它们自身从原发性肿瘤脱离进入血流中，并且朝向远端器官行进以定殖成转移 瘤的罕见细胞（Pantel和Brakenh off, 2004)。尽管在癌症疗法领域的近期进步能够牵制 原发性癌症散布，但需要用于早期检测、诊断和治疗性监测转移性癌症的可靠生物标志物。 癌症患者的外周血液中存在的CTC正作为用于早期检测和监测抗癌药物的治疗功效的有 前途靶标而出现（Parkinson等，2012)。目前，用于检测CTC的可接受标志物包括EpCAM 和细胞角蛋白（Parkinson等，2012)。然而，这些标志物可检测仅上皮CTC，从而排除已丧 失EpCAM的表达的上皮-间质转化的（EMT) CTC (Sieuwerts等，2009)和源于间质肿瘤的任 何其它非上皮CTC，所述间质肿瘤构成成人癌症类型的约10%以及儿科癌症类型的约20% (Mackall等，2002)。当前检测工具的这个局限性表明急切需要可满足这些要求的新颖工 具。
[0008] 发明概述
[0009] 在一些实施方案中，本发明提供一种用于检测循环肿瘤细胞上的细胞表面波形蛋 白的新颖抗体。在一个实施方案中，本发明提供一种分离的单克隆抗体，其中所述抗体特异 性结合波形蛋白多肽，并且其中所述抗体与84-1单克隆抗体竞争结合所述多肽。在某些方 面，本发明的单克隆抗体可与84-1单克隆抗体结合相同表位。
[0010] 在一个方面，本发明的单克隆抗体可包含与84-1的Vh⑶Rl (SEQ ID NO: 3)至少 80% 同一的第一 Vh CDR;与 84-1 的 Vh CDR2(SEQ ID N0:4)至少 80% 同一的第二 Vh CDR; 与 84-1 的 Vh CDR3(SEQ ID N0:5)至少 80% 同一的第三 Vh CDR;与 84-1的\ CDR1(SEQ ID N0:6)至少 80% 同一的第一 \ CDR;与 84-1 的\ CDR2(SEQ ID N0:7)至少 80% 同一的第 二\ CDR;和与 84-1 的\ CDR3(SEQ ID N0:8)至少 80% 同一的第三\ CDR。
[0011] 在另一方面，本发明的单克隆抗体可包括与SEQ ID NO: 3同一的第一 Vh⑶R ;与 SEQ ID NO: 4 同一的第二 Vh CDR ;与 SEQ ID NO: 5 同一的第三 Vh CDR ;与 SEQ ID NO: 6 同一 的第一\CDR;与SEQIDN0:7同一的第二\CDR;和与SEQIDN0:8同一的第三\CDR。
[0012] 在另一方面，本发明的单克隆抗体可包含与84-1的Vh结构域（SEQ ID NO: 1)至 少约80%同一的Vh结构域和与84-1的V1结构域（SEQ ID NO: 2)至少约80%同一的V #吉 构域。在某一方面，本发明的单克隆抗体可包含与84-1的Vh结构域（SEQ ID NO: 1)同一 的Vh结构域和与84-1的V1结构域（SEQ ID NO:2)同一的V1结构域。在另外某一方面，本 发明的单克隆抗体可为84-1抗体。
[0013] 在一些方面，本文公开的单克隆抗体可为重组的。在一些方面，实施方案的单克隆 抗体可为IgG、IgM、IgA或其抗原结合片段。在一些方面，本发明的单克隆抗体可为Fab'、 F((ab'）2、F((ab'）3、单价scFv、二价scFV或单结构域抗体。在一些方面，本文单克隆抗 体可为人抗体、人源化抗体或去免疫抗体。在某些方面，所述人源化或去免疫抗体可在人 IgG (例如IgGl或IgG2)骨架上包含前述CDR。
[0014] 在某些方面，实施方案的单克隆抗体可缀合于显像剂、化学治疗剂、毒素或放射性 核素。在某些方面，本文公开的单克隆抗体可包含在药学上可接受的载体中。
[0015] 在一个实施方案中，本发明提供一种分离的多核苷酸分子，其包含编码本发明的 单克隆抗体的核酸序列。
[0016] 在一个实施方案中，本发明提供一种重组多肽，其包含含有84-1的Vh结构域的 ⑶R 1-3(SEQ ID N0:3、4和5)的抗体Vh结构域。在另一实施方案中，本发明提供一种重组 多肽，其包含含有84-1的\结构域的CDR 1-3 (SEQ ID N0:6、7和8)的抗体V ^结构域。在 另一实施方案中，本发明提供一种分离的多核苷酸分子，其包含编码包含含有84-1的Vh结 构域的CDR 1-3 (SEQ ID NO: 3、4和5)的抗体Vh结构域和/或含有84-1的八结构域的CDR 1-3(SEQ ID N0:6、7和8)的抗体\结构域的多肽的核酸序列。
[0017] 在一个实施方案中，本发明提供一种宿主细胞，其包含一种或多种编码实施方案 的单克隆抗体或重组蛋白的多核苷酸分子。在某些方面，宿主细胞可为哺乳动物细胞、酵母 细胞、细菌细胞、纤毛虫细胞或昆虫细胞。
[0018] 在一个实施方案中，本发明提供一种制备抗体的方法，其包括在细胞中表达一种 或多种编码本发明的抗体的\和V H多肽链的多核苷酸分子，以及从所述细胞纯化所述抗 体。
[0019] 在一个实施方案中，本发明提供一种分离的抗体，其中所述抗体包含与84-1的VhCDR1(SEQ ID N0:3)至少 80% 同一的第一 Vh CDR;与 84-1 的 Vh CDR2(SEQ ID N0:4)至少 80% 同一的第二 Vh CDR;与 84-1 的 Vh CDR3(SEQ ID N0:5)至少 80% 同一的第三 Vh CDR; 与 84-1的\ CDR1(SEQ ID N0:6)至少 80% 同一的第一 \ CDR;与 84-1的\ CDR2(SEQ ID N0:7)至少 80% 同一的第二\ CDR;和与 84-1 的\ CDR3(SEQ ID N0:8)至少 80% 同一的 第三\ CDR。
[0020] 在一个实施方案中，本发明提供一种特异性检测循环肿瘤细胞的方法，其包括（a) 从患者获得血液样品，（b)使所述样品与结合细胞表面波形蛋白的抗体一起孵育，以及（C) 检测所述抗体结合的细胞。在某些方面，结合细胞表面波形蛋白的抗体可为本文公开的抗 体。在一些方面，抗体可为结合细胞表面波形蛋白的抗体样分子，如适体。在一些方面，检 测抗体结合的细胞可包括使用流式细胞计量术、免疫组织化学、荧光显微术、放射免疫测定 或 ELISA。
[0021] 在某些方面，方法可进一步包括在使样品与结合细胞表面波形蛋白的抗体一起孵 育之前清除样品的CD45阳性细胞。在某些方面，方法可进一步包括通过使样品与蛋白质 酪氨酸磷酸酶抑制剂一起孵育来增加细胞表面波形蛋白表达水平。在一些方面，蛋白质酪 氨酸磷酸酶抑制剂是原钒酸钠。在其它方面，蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂可为迪憐他汀 (dephostatin)、mpV(pic)、苯胂氧化物、葡萄糖酸铺钠 、BAY U6751、酪氨酸磷酸酶抑制剂混 合物（包括钒酸钠、钼酸钠、酒石酸钠和咪唑）或RK-682。
[0022] 在某些方面，方法可进一步限定为一种分离活循环肿瘤细胞的方法，并且进一步 包括从样品分离（c)的抗体结合的循环肿瘤细胞。在一些方面，分离可包括免疫磁性捕集、 基于粘附的细胞分选、磁性激活细胞分选或荧光激活细胞分选（FACS)。在某些方面，方法可 进一步包括为所分离的活循环肿瘤细胞基因分型。
[0023] 在某些方面，方法可进一步包括使样品与EpCAM或细胞角蛋白抗体一起孵育。在 某些方面，方法可进一步包括定量患者中循环肿瘤细胞的数目。在某些方面，血液样品来自 先前尚未被诊断有癌症的患者，并且方法是早期癌症检测的方法。在另一方面，血液样品来 自处于缓解中的患者，并且方法是检测复发的方法。在一些方面，每毫升血液检测到至少约 3个循环肿瘤细胞指示患者具有肿瘤。在其它方面，每毫升血液检测到至少约1个或至少约 2个循环肿瘤细胞指示患者具有肿瘤。
[0024] 在某些方面，方法可为监测癌症患者中对疗法的响应的方法，其中如果循环肿瘤 细胞的数目随时间降低，那么所述患者被称为已对疗法具有积极响应。在某些方面，方法可 为预测方法，其中每毫升血液检测到至少约5个循环肿瘤细胞指示患者具有不良预后。在 其它方面，方法可为预测方法，其中每毫升血液检测到至少约1个、至少约2个、至少约3个 或至少约4个循环肿瘤细胞指示患者具有不良预后。
[0025] 在某些方面，患者可具有上皮肿瘤。在其它方面，患者可具有间质肿瘤。在某些方 面，肿瘤可包括乳腺癌、肺癌、头颈癌、前列腺癌、食道癌、气管癌、皮肤癌、脑癌、肝癌、膀胱 癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、子宫颈癌、睾丸癌、结肠癌、直肠癌或皮肤癌。在某些方 面，肿瘤可包括骨肉瘤、血管肉瘤、横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤、尤因肉瘤、成胶质细胞瘤、成神 经细胞瘤和白血病。
[0026] 在一个实施方案中，本发明提供一种治疗根据本发明方法确定具有循环肿瘤细胞 的患者的方法，所述方法包括施用有效量的本文公开的缀合抗体。在一些方面，缀合抗体可 包含在药学上可接受的组合物中。
[0027] 在一个方面，抗体可被全身性施用。在其它方面，抗体可被静脉内、皮内、肿瘤内、 肌肉内、腹膜内、皮下或局部施用。方法可进一步包括向受试者施用至少第二抗癌疗法。第 二抗癌疗法的实例包括但不限于手术疗法、化学疗法、放射疗法、冷冻疗法、激素疗法、免疫 疗法或细胞因子疗法。
[0028] 在其它方面，方法可进一步包括向受试者施用本发明组合物超过一次，例如像1、 2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20 或大于 20 次。
[0029] 在一个实施方案中，提供一种用于治疗受试者的癌症的包含本发明实施方案的抗 体的组合物。受试者可已根据本发明实施方案的方法确定具有循环肿瘤细胞。在一些方面， 受试者可为人。在一些方面，受试者可为非人哺乳动物。在一些方面，组合物可为药学上可 接受的组合物。
[0030] 在某些方面，受试者可具有上皮肿瘤。在其它方面，受试者可具有间质肿瘤。在其 它方面，受试者可具有转移性肿瘤。在某些方面，肿瘤可包括乳腺癌、肺癌、头颈癌、前列腺 癌、食道癌、气管癌、皮肤癌、脑癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、子宫颈癌、 睾丸癌、结肠癌、直肠癌或皮肤癌。在某些方面，肿瘤可包括骨肉瘤、血管肉瘤、横纹肌肉瘤、 平滑肌肉瘤、尤因肉瘤、成胶质细胞瘤、成神经细胞瘤和白血病。
[0031] 在一些方面，组合物可进一步包含至少一种其它抗癌剂，如化学治疗剂、放射冶疗 剂、基因疗法或第二免疫治疗剂。在一些方面，组合物可被配制以供全身性、静脉内、皮内、 肿瘤内、肌肉内、腹膜内、皮下或局部施用。
[0032] 在一个实施方案中，本文提供本发明实施方案的抗体生产用于治疗受试者的癌症 的药剂的用途，其中所述受试者已被确定包含循环肿瘤细胞。
[0033] 某些实施方案涉及一种抗体或重组多肽组合物，其包含特异性结合细胞表面波形 蛋白的分离的和/或重组抗体或多肽。在某些方面，抗体或多肽具有与任何本文提供的单 克隆抗体的全部或一部分至少或至多80、85、90、95、96、97、98、99或100%同一（或其中可 导出的任何范围）的序列。在其它方面，分离的和/或重组抗体或多肽具有、具有至少、或 具有至多 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、 33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、 58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、 83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100 或大于 100 个来自任何本 文提供的序列或所述序列的组合的连续氨基酸。
[0034] 在其它方面，实施方案的抗体或多肽包含一个或多个具有任何本文公开的氨基酸 序列的氨基酸区段。举例来说，抗体或多肽可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或大于10个氨基 酸区段，所述区段在长度方面包含约、至少或至多5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19、20、21、22、23、24、25to 25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、 42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、 67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、 92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、 113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、 132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、 151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、 170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、 189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199 或 200 个氨基酸，包括介于之间的所有 值和范围，所述氨基酸与任何本文公开的氨基酸序列至少80、85、90、95、96、97、98、99或 100%同一。在某些方面，氨基区段选自如表7中提供的细胞表面波形蛋白结合抗体的氨基 酸序列中的一个。
[0035] 在其它方面，实施方案的抗体或多肽包含具有任何本文公开的氨基酸序列的氨 基酸区段，其中所述区段在本文提供的任何序列中的氨基酸位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25 至 25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、 35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、 60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、 85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、 108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、 127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、 146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、 165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、 184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199 或 200 处开始， 并且在同一提供的序列中的氨基酸位置4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20、21、22、23、24、25 至 25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、 44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、 69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、 94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、 114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、 133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、 152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、 171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、 190、191、192、193、194、195、196、197、198、199或200处结束。在某些方面